Medição de cortisol em Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para determinar o solvente óptimo da extração para medir o cortisol da pele do Koala. Os solventes utilizados neste protocolo são metanol, etanol e isopropanol. Determinar um solvente de extração ideal ajudará na medição de peles de forma confiável para determinar o impacto do estresse crônico em coalas.

Resumo

Os métodos ideais de extração hormonal utilizados para medir o stress em animais através de tipos de amostras não são sempre os mesmos. A icónica espécie marsupial da Austrália, ocoala (Phascolarctos cinereus), enfrenta a exposição prolongada a estressores antropogênicos-induzidos e a avaliação do estresse crônico em populações selvagens é urgentemente justificada. Uma das maneiras mais eficazes de medir o estresse crônico é através da análise do hormônio glicocorticóide cortisol no cabelo ou pele, uma vez que suporta respostas fisiológicas e comportamentais. Este estudo de validação laboratorial tem como objetivo testar as técnicas atuais para validar um método de extração hormonal ideal para ser usado como uma medida não invasiva de cortisol em peles de coala. Reconhece-se que o uso de técnicas não invasivas para medir os hormônios do estresse é preferível sobre técnicas tradicionais e invasivas devido a seus pontos de vista práticos e éticos ideais. Além disso, é comparativamente mais fácil de adquirir peles de coalas do que é para adquirir amostras de seu sangue. Este estudo utilizou amostras de peles de coala adquiridas do Adelaide Koala and Wildlife hospital para executar uma série de técnicas de extração hormonal na tentativa de validar um método de extração de cortisol ideal. Os resultados mostraram que o metanol de 100% forneceu a extração solvente a mais óptima comparada ao etanol de 100% ou ao isopropanol de 100% baseado em resultados do paralelismo. Em conclusão, este método da extração do cortisol da pele do Koala forneceu um ensaio não invasor de confiança que poderia ser usado para estudar o esforço crônico em koalas.

Introdução

Os ecossistemas australianos sustentam a vida humana através da prestação de serviços, incluindo alimentos e fibras, entre muitas outras interações dinâmicas¹. Ironicamente, é atividade humana que atua como o condutor dominante da perturbação do ecossistema através da mudança de biodiversidade². A fragmentação do habitat, conhecida como o processo de divisão de grandes habitats contínuos em pequenas manchas de terra, isoladas umas das outras, é a maior mudança de biodiversidade antropogênica ameaçando os ecossistemas australianos². A fragmentação do habitat modifica a estrutura e a diversidade da composição de espécies em uma determinada área, reduzindo assim a área de habitat necessária para que essas espécies mantenham populações viáveis². O resultado disso é o aumento da concorrência entre as espécies de recursos, incluindo alimentos, combustíveis, fibras e água³. A destruição de ecossistemas australianos através da mudança de biodiversidade está tendo conseqüências catastróficas em muitas espécies nativas australianas¹.

A espécie marsupial mais emblemática da Austrália, ocoala (Phascolarctos cinereus), depende dos ecossistemas australianos que permanecem saudáveis para sua sobrevivência⁴. A introdução do assentamento europeu causou um rápido declínio nas populações australianas de coalas, como eles foram abatidos por suas peles em busca de lucro em um grande comércio de exportação⁵. Esta prática foi proibida na década de 1980 e as populações de coalas foram então capazes de estabilizar⁵. No entanto, o crescimento exponencial da população humana resultou nesta espécie competindo por grande parte de seu habitat, e sua sobrevivência é novamente ameaça⁶. De acordo com a União Internacional para a conservação da natureza (IUCN), todas as populações de coalas australianas estão listadas como vulneráveis à extinção com uma tendência populacional decrescente⁷. Este anúncio é atribuído à incerteza em torno dos parâmetros populacionais relevantes e à variação acentuada das tendências populacionais para esta espécie⁷. Como os animais mais emblemáticos e endêmicos, coalas em grande parte beneficiam a economia australiana através do turismo (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Uma estimativa sugere que o turismo relacionado Koala gerou aproximadamente 9.000 empregos e contribui entre $1.01 e $2500000000 para a economia (NSW escritório de meio ambiente e património 2018). A remoção de qualquer uma das espécies tem o potencial de ser catastrófico, e pode ser visto no declínio constante da vida selvagem australiana nativa⁶. Adicionalmente, a economia de Austrália sentirá as ramificações se as populações de coalas Australian continuarem a declinar na taxa que são⁶.

Sugere-se que a prevalência de morte e doença em resposta à fragmentação do habitat é o resultado do estresse crônico⁸. Já, vinte e quatro espécies marsupiais foram declaradas extintas na Austrália devido à fragmentação do habitat, com coalas seguindo uma tendência semelhante⁸. A complexidade da fragmentação do habitat e dos sistemas biológicos é sinergética, mas pode ser desempacotada através da análise da resposta ao estresse⁶. Geralmente, qualquer perturbação em um ambiente natural de animais ativa uma cascata complexa de eventos Neurohormonais, conhecida como uma resposta de "luta ou fuga"^9,10. Esta resposta ao stress é um processo que começa no cérebro onde o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) é ativado¹¹. Um componente do cérebro chamado hipotálamo libera o hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que então sinaliza a hipófise anterior para liberar o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH)¹¹. Isso, por sua vez, estimula a secreção glicocorticóide da medula adrenal. O corpo circula glicocorticóides através do sangue, que desvia o armazenamento da glicose do glicogênio e mobiliza a glicose do glicogênio armazenado¹¹. Esta cascata de eventos Neurohormonais é a resposta usada pelo animal para lidar com estímulos imprevisíveis¹¹. No entanto, quando os glicocorticóides estão sendo liberados e permanecem elevados por um período prolongado de tempo, o animal é considerado como tendo estresse crônico^12,13. Esse processo envolve desviar a energia de outras funções corporais corpóreas, como é necessário para a produção contínua de glicocorticóides¹³. Como resultado, o estresse crônico pode proibir o crescimento, a reprodução e a imunidade, sendo todos os principais traços de aptidão necessários para a sobrevida¹⁴.

Medir a produção de glicocorticóides de um animal é um indicador comum usado para determinar se o animal está ou não experimentando estresse fisiológico¹⁵. Para isso, os glicocorticóides podem ser medidos no plasma sanguíneo, soro, saliva, urina ou fezes¹⁶. No entanto, evidências sugerem que o cabelo é um indicador muito mais eficaz do estresse crônico, em oposição aos¹⁶acima mencionados. Isso é porque o cabelo é pensado para incorporar hormônios transmitidos pelo sangue durante a sua fase de crescimento; é relativamente estável; e todo o cortisol detectado no cabelo reflete o esforço fisiológico experimentado sobre o período de crescimento do cabelo, que pode ser semanas completamente aos meses¹⁶. Além disso, qualquer coleta de cortisol deve ser não invasiva, a fim de minimizar o estresse associado à captura e manuseio¹⁶. No entanto, qualquer estresse experimentado durante este evento não afetaria os níveis de glicocorticóides no cabelo¹⁶. Houve muitos estudos que exploram a proficiência de usar o cabelo para medir o stress a longo prazo em um número de animais, e incluem estudos em Rena, ursos de urso, macacos de rhesus, muskoxen, e ursos marrons^{17,18, 19} anos de ^{, 20} anos de ^, o cortisol ²¹. Hair é extraído geralmente primeiramente lavando a amostra para assegurar o cortisol do suor e do sebo-derivado depositado na superfície do cabelo não é coextraído com cortisol e então pulverizando a amostra em um grânulo-batedor²². Após a lavagem, a amostra precisa de ser secada para assegurar a evaporação completa²². Finalmente, usando um solvente, a amostra pode ser extraída e reconstituída para facilitar o ensaio de cortisol²². O solvente mais comum usado para extrair o cortisol da pele é o metanol^21,23; no entanto, existem alguns estudos que usam etanol e isopropanol em suas técnicas de extração de cortisol. Por exemplo, um estudo que utilizou etanol foi bem-sucedido para extrair o cortisol do fluido amniótico humano²⁴. Adicionalmente, um estudo que utilizou isopropanol foi bem-sucedido para extrair o cortisol do cabelo humano e unhas^25,26. Por esta razão, este estudo testou todos os três solventes (metanol, etanol e isopropanol) para determinar qual foi o mais bem sucedido para a extração de cortisol de amostras de peles de coala.

O objetivo preliminar deste estudo era usar técnicas atuais para validar uma técnica óptima da extração de hormona a ser usada como uma medida não invasora do cortisol da pele do Koala. Isto foi conseguido testando três solventes da extração (metanol, ethanol, e isopropanol). Nós supor que o metanol será o solvente ideal usado para extrair o cortisol da pele do Koala porque é o solvente recomendado da extração pelos jogos²⁷do cortisol do ensaio da árvore.

Protocolo

Este projeto foi realizado rigorosas diretrizes de cuidado animal e humano. A ética animal foi concedida pela Western Sydney University (A12373). Adicionalmente, uma avaliação de risco laboratorial e uma forma de biossegurança e radiação foram submetidas e aceitas pela Western Sydney University para realizar esta pesquisa com segurança (B12366).

Nota: as amostras de peles de Koala para este projeto foram obtidas do Adelaide Koala and Wildlife hospital, localizado na 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. A pele foi tomada de um koala que fosse admitido ao hospital e eutanasiado devido a suas lesões severas. O Koala falecido tinha sido armazenado em um congelador dentro de um saco do corpo logo após a morte. Depois de remover o Koala falecido do saco do corpo, 1,2 g de pêlo foi raspado da nuca do pescoço usando cortadores de animais padrão. O pêlo foi raspado o mais próximo possível da pele, de modo a garantir que a pele não foi cortada. Uma vez raspada, o Koala falecido foi colocado de volta no saco do corpo e colocado no congelador. A pele foi então colocada em uma bolsa feita de folha de alumínio e armazenada abaixo de-20 ° c. Em trânsito, a pele foi mantida à temperatura ambiente, e na chegada ao laboratório, a pele foi armazenada em-80 ° c.

1. extração do cortisol da pele do Koala

1. Retire a pele do armazenamento a-80 ° c e Reserve tempo para descongelar.
2. Pesar a pele em um laboratório de equilíbrio de precisão analítica.
3. Coloque 60 mg de pele em um tubo de centrifugação pré-pesado e rotulado de 1,5 mL e repita até que 18 tubos estejam preenchidos.
   Nota: foram utilizadas 18 subamostras de peles para este estudo de validação.
4. Adicione 1 mL de isopropanol de grau de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) a 100% a cada tubo usando uma pipeta.
5. Amostras de vórtice para 30 s.
6. Coe cada amostra usando uma peneira de precisão micro 0,5 mm de modo a alcançar a separação de líquidos e peles.
7. Descarte o líquido em um recipiente de resíduos.
8. Coloc cada amostra da pele em um barco de pesagem plástico etiquetado, a seguir coloc em um desiccator do vácuo, deixe a pele para secar por 3 dias.
9. Uma vez completamente seco, coloque cada amostra em um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,5 mL.
10. Coloque cada amostra em um moinho de contas com 3 grânulos de aço cromado (3,2 mm) e pulverizar por 2 min a 30 shakes por segundo.
11. Pipeta 1,5 mL da primeira técnica de extração (100% de etanol de grau analítico) em 6 1,5 mL de tubos de microcentrífuga contendo a amostra de peles.
12. Realize o mesmo para 100% de metanol de grau analítico e 100% de isopropanol analítico até dezoito tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estarem preenchidos.
13. Tampe cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar à temperatura ambiente (RT) com pulsante constante usando uma coqueteleira por 3 h.
14. Retire e Coe amostras usando uma peneira de precisão micro de 0,5 mm.
15. Transfira o líquido para um novo e rotulado tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com uma pipeta, assegurando que a pele seja descartada apropriadamente.
16. Extrato solvente completamente seco um córrego do vapor de N₂ um fume-armário.
17. Reconstituir o extrato da amostra seca usando 400 μL de tampão de ensaio (composição fornecida no kit comercial de cortisol; ver tabela de materiais) e 100 μl de 100% de etanol de grau analítico.
    Nota: as extrações de amostra podem ser armazenadas em-80.

2. controlos internos

1. Para fazer controles, faça um pool de amostras extraídas com altos níveis hormonais. Para fazer esta piscina, selecione amostras de animais com exposição conhecida ao estressor. Por exemplo, selecione amostras de coalas que foram resgatadas do trauma ambiental, pois geralmente exibirão níveis elevados de hormônio cortisol⁶.
   1. Para fazer o pool de extração, tomar 20 μL de extrato de cada amostra (n = 10) até que um volume total de 200 μL seja obtido. O pool de extração pode ser armazenado em-80 C até os ensaios. Execute o pool em cada ensaio como controles internos baixos ou altos (consulte a etapa 2,2).
2. Para o ensaio, use a piscina para fazer estoques para controles baixos e altos que se ligam a 70% (C1) e 30% (C2), respectivamente. Obter o fator de diluição para os pontos de ligação de 30% e 70% do gráfico de paralelismo para o extrato contra o padrão de cortisol (Figura 1). Utilize o tampão de ensaio para diluição do conjunto de amostras. Por exemplo, use 60 μL do extrato da piscina e 60 μL de tampão de ensaio para a diluição 1:2.
   Nota: para o extrato de metanol, o ponto de ligação de 30% estava em puro, enquanto 70% ponto de ligação foi aproximadamente 1:2 como por Figura 1. Assim, estes forneceram o fator de diluição para os controles internos (C1 e C2 respectivamente) para a execução dentro do ensaio.

3. análise de cortisol em extratos de peles de coala

1. Use um kit de cortisol comercial (tabela de materiais) e configure a placa de tira 96 bem, incluindo as amostras, controles, padrões de cortisol, poços de ligação não específicos e poços de ligação máximos seguindo as instruções do fornecedor. Use a folha de layout da placa fornecida no livreto do kit para listar as posições de amostras, controles e padrões no mapa da placa.
   Observação: é recomendável que todas as amostras, controles e padrões são executados em duplicado para permitir a precisão dos resultados.
2. Prepare amostras. Siga a extração de hormônio da pele (seção 1) para obter 100% de pele de Koala extraída metanol.
3. Prepare os reagentes. Siga o procedimento descrito no kit de cortisol comercial para preparar os reagentes, incluindo (1) tampão de ensaio, (2) tampão de lavagem e (3) padrões (composições fornecidas no kit de cortisol, tabela de materiais).
4. De acordo com as instruções fornecidas no kit de cortisol, Pipet 50 μL de amostras ou normas em poços na placa. Pipet 75 μL e 50 μL de tampão de ensaio nos poços de ligação não específica (NSB) e os poços de ligação máxima (B0 ou padrão zero), respetivamente.
5. Adicionar 25 μL do conjugado de cortisol a cada poço usando um repetidor Pipet. Em seguida, Pipet 25 μL do anticorpo cortisol em cada poço, exceto os poços NSB. Bata delicadamente os lados da placa para assegurar-se de que os reagentes estejam bem misturados.
6. Cubra a placa com o aferidor da placa e agitar à temperatura ambiente para 1 h (em velocidade lenta) usando um agitador orbital.
7. Retire o aferidor da placa e aspirar a placa de poço lavando cada poço com 300 μL de tampão de lavagem 4 vezes.
8. Seque a placa tocando na placa em toalhas absorventes limpas.
9. Pipete 100 μL de substrato tetrametilbenzadina (TMB) (composição fornecida no kit de cortisol, tabela de materiais) a cada poço.
10. Coloque o aferidor da placa na placa de poço e incubar a RT durante 30 min.
11. Pipeta 50 μL de solução de paragem para cada poço.
12. Coloc a placa do poço em um leitor da placa capaz da leitura 450 nanômetro.
13. Para calcular a concentração hormonal final, derivar a concentração final de cortisol de pele em ng/mg de amostra multiplicando a concentração hormonal pg/mL com o volume de extrato final (0,5 mL) e dividindo-se pela massa da amostra de peles (60 mg).

Resultados

A detecção do ensaio de metabólitos hormonais de interesse é determinada usando paralelismo. Usando uma curva de paralelismo, o ponto de ligação de 50% também determina o fator de diluição da amostra na curva padrão (Figura 1). Como mostrado no gráfico de paralelismo (Figura 1), os extratos de 100% de etanol e 100% de isopropanol não proporcionam deslocamento paralelo contra o padrão de cortisol. No entanto, o extrato de metanol 100% forneceu deslocamento paralelo contra o p...

Discussão

Há uma série de estudos que usam uma série de técnicas para detectar o cortisol na pele de mamíferos. Este estudo apresenta resultados para a detecção de cortisol em peles coletadas de um koala selvagem exposto ao estresse antropogênico atual. Este estudo inovador usou peles para testar qual dos três solventes comumente usados são melhores na extração de cortisol, uma medida de estresse crônico, de peles de coala. Os resultados mostraram que 100% de metanol foi o solvente recomendado para extração de corti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge Tubes	n/a	n/a	1.5 mL
Chrome Steel Beads	n/a	n/a	3.2 mm x 3
Cortisol Kit	Arbor Assays	K003-H1W	Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	Arbor Assays	K003-H5	Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Isopropanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Methanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Micro Pipette	n/a	n/a	n/a
Micro Precision Sieve	n/a	n/a	0.5 mm
Microplate Reader	Bio Radi	n/a	n/a
Microplate Washer	Bio Radi	n/a	n/a
Orbital Shaker	Bio Line	n/a	n/a
Plastic Weighing Boat	n/a	n/a	n/a
Plate Sealer	n/a	n/a	n/a
Precision Balance	n/a	n/a	n/a
Vortex Mixer	Eppendorf	n/a	n/a