Mesure de cortisol à Koala (Phascolarctos cinereus) Fourrure

Résumé

Nous présentons un protocole pour déterminer le solvant optimal d'extraction pour mesurer le cortisol de la fourrure de koala. Les solvants utilisés dans ce protocole sont le méthanol, l'éthanol et l'isopropanol. La détermination d'un solvant d'extraction optimal aidera à mesurer de façon fiable la fourrure afin de déterminer l'impact du stress chronique sur les koalas.

Résumé

Les méthodes optimales d'extraction hormonale utilisées pour mesurer le stress chez les animaux de tous les types d'échantillons ne sont pas toujours les mêmes. L'espèce marsupiale emblématique de l'Australie, le koala (Phascolarctos cinereus), fait face à une exposition prolongée aux facteurs de stress d'origine anthropique et l'évaluation du stress chronique dans les populations sauvages est urgentement justifiée. Une des façons les plus efficaces de mesurer le stress chronique est en analysant l'hormone glucocorticoïde cortisol dans les cheveux ou la fourrure, car il soutient les réponses physiologiques et comportementales. Cette étude de validation en laboratoire vise à tester les techniques actuelles pour valider une méthode optimale d'extraction hormonale à utiliser comme mesure non invasive du cortisol dans la fourrure de koala. Il est reconnu que l'utilisation de techniques non invasives pour mesurer les hormones de stress est préférée aux techniques traditionnelles et invasives en raison de leurs points de vue pratiques et éthiques idéaux. En outre, il est relativement plus facile d'acquérir de la fourrure à partir de koalas que d'acquérir des échantillons de leur sang. Cette étude a utilisé des échantillons de fourrure de koala acquis auprès de l'Hôpital Adélaïde Koala et de la faune pour exécuter un certain nombre de techniques d'extraction hormonale dans une tentative de valider une méthode optimale d'extraction de cortisol. Les résultats ont montré que le méthanol à 100 % fournissait l'extraction de solvants la plus optimale par rapport à 100 % d'éthanol ou 100 % d'isopropanol basé sur les résultats du parallélisme. En conclusion, cette méthode d'extraction de cortisol de la fourrure de koala a fourni un test non invasif fiable qui pourrait être employé pour étudier le stress chronique dans les koalas.

Introduction

Les écosystèmes australiens soutiennent la vie humaine grâce à la fourniture de services, y compris la nourriture et la fibre parmi de nombreuses autres interactions dynamiques¹. Ironiquement, c'est l'activité humaine qui est le principal moteur de la perturbation de l'écosystème par le changement de biodiversité². La fragmentation de l'habitat, connue sous le nom de processus de division de grands habitats continus en petites parcelles de terre, isolées les unes des autres, est le changement anthropique majeur de la biodiversité qui menace les écosystèmes australiens². La fragmentation de l'habitat modifie la structure et la diversité de la composition des espèces dans une zone donnée, réduisant ainsi la superficie d'habitat nécessaire à ces espèces pour maintenir des populations viables². Le résultat de ceci est concurrence accrue entre les espècespour les ressources comprenant la nourriture, le carburant, la fibre, et l'eau 3. La destruction des écosystèmes australiens par le changement de la biodiversité a des conséquences catastrophiques sur de nombreuses espèces indigènes australiennes¹.

L'espèce marsupiale la plus emblématique d'Australie, le koala (Phascolarctos cinereus), dépend du fait que les écosystèmes australiens restent en bonne santé pour leur survie⁴. L'introduction de l'établissement européen a provoqué un déclin rapide des populations australiennes de koalas, car ils ont été abattus pour leurs peaux dans la poursuite du profit dans un grand commerce d'exportation⁵. Cette pratique a été interdite dans les années 1980 et les populations de koalas ont ensuite pu stabiliser⁵. Cependant, la croissance exponentielle de la population humaine a entraîné cette espèce en concurrence pour une grande partie de leur habitat, et leur survie est de nouveau menacée⁶. Selon l'Union internationale pour la conservation de la nature (UICN), toutes les populations de koalas australiens sont classées comme vulnérables à l'extinction avec une tendance démographique en baisse⁷. Cette inscription est attribuée à l'incertitude entourant les paramètres de population pertinents et à la variation marquée des tendances démographiques pour cette espèce⁷. En tant qu'animaux les plus emblématiques et endémiques, les koalas profitent largement à l'économie australienne grâce au tourisme (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Une estimation suggère que le tourisme lié au koala a généré environ 9 000 emplois et contribue entre 1,1 et 2,5 milliards de dollars à l'économie (NSW Office of Environment and Heritage 2018). L'élimination d'une espèce a le potentiel d'être catastrophique, et peut être vu dans le déclin constant de la faune indigène australienne⁶. En outre, l'économie australienne ressentira les ramifications si les populations de koalas australiens continuent de diminuer au rythme où elles sont^{de 6}.

Il est suggéré que la prévalence de la mort et de la maladie en réponse à la fragmentation de l'habitat est le résultat du stress chronique⁸. Déjà, vingt-quatre espèces marsupiales ont été déclarées éteintes en Australie en raison de la fragmentation de l'habitat, avec des koalas suivant une tendance similaire⁸. La complexité de la fragmentation de l'habitat et des systèmes biologiques est synergique, mais peut être déballée grâce à l'analyse de la réponse au stress⁶. En général, toute perturbation dans un environnement naturel animal active une cascade complexe d'événements neurohormonaux, connu sous le nom de «combat ou de fuite» réponse^9,10. Cette réponse au stress est un processus qui commence dans le cerveau où l'axe hypothalamique-pituitaire-surrénalien (HPA) est activé¹¹. Un composant du cerveau appelé l'hypothalamus libère l'hormone de libération de corticotrophine (CRH), qui signale alors l'hypotuitaire antérieur pour libérer l'hormone adrénocorticotrophic (ACTH)¹¹. Ceci stimule à son tour la sécrétion glucocorticoïde de la médulle surrénale. Le corps circule glucocorticoïdes à travers le sang, ce qui détourne le stockage du glucose du glycogène et mobilise le glucose à partir de glycogène stocké¹¹. Cette cascade d'événements neurohormonaux est la réponse utilisée par l'animal pour faire face à des stimuli imprévisibles¹¹. Cependant, lorsque les glucocorticoïdes sont libérés et restent élevés pendant une période prolongée, l'animal est considéré comme éprouvant un stress chronique^12,13. Ce processus consiste à détourner l'énergie d'autres fonctions corporelles corporelles, car il est nécessaire pour la production continue de glucocorticoïdes¹³. En conséquence, le stress chronique peut interdire la croissance, la reproduction et l'immunité, tous étant des traits de forme physique clés requis pour la survie¹⁴.

La mesure de la production de glucocorticoïdes d'un animal est un indicateur courant utilisé pour déterminer si l'animal subit ou non un stress physiologique¹⁵. Pour ce faire, les glucocorticoïdes peuvent être mesurés dans le plasma sanguin, le sérum, la salive, l'urine ou les fèces¹⁶. Cependant, les preuves suggèrent que les cheveux sont un indicateur beaucoup plus efficace du stress chronique, par opposition aux¹⁶susmentionnés. C'est parce que les cheveux sont pensés pour incorporer des hormones transmissibles par le sang pendant sa phase de croissance; il est relativement stable; et tout cortisol détecté dans les cheveux reflète le stress physiologique ressenti au cours de la période de croissance des cheveux, qui peut être semaines à¹⁶mois . En outre, toute collection de cortisol doit être non invasive afin de minimiser le stress associé à la capture et la manipulation¹⁶. Cependant, tout stress ressenti au cours de cet événement n'aurait pas d'impact sur les niveaux de glucocorticoïdes dans les cheveux¹⁶. Il y a eu beaucoup d'études qui explorent la compétence d'utiliser des cheveux pour mesurer le stress à long terme dans un certain nombre d'animaux, et incluent des études sur des rennes, des ours grizzlis, des singes rhésus, des bœufs musqués, et des ours bruns^{17,18,, 19 ans,} états-unis qui ^{, 20} Ans, états-unis ^{, 21}. Le cortisol capillaire est habituellement extrait en lavant d'abord l'échantillon pour s'assurer que la sueur et le cortisol dérivé du sébum déposés à la surface des cheveux ne sont pas co-extraits avec du cortisol, puis pulvérisent l'échantillon dans un perle-batteur²². Après le lavage, l'échantillon doit être séché pour assurer l'évaporation complète²². Enfin, à l'aide d'un solvant, l'échantillon peut être extrait et reconstitué pour faciliter l'analyse du cortisol²². Le solvant le plus commun utilisé pour extraire le cortisol de la fourrure est le méthanol^21,23; cependant, il y a quelques études qui emploient l'éthanol et l'isopropanol dans leurs techniques d'extraction de cortisol. Par exemple, une étude qui a utilisé l'éthanol a réussi à extraire le cortisol du liquide amniotique humain²⁴. En outre, une étude qui a utilisé l'isopropanol a été couronnée de succès pour extraire le cortisol des cheveux humains et les ongles^25,26. Pour cette raison, cette étude a testé les trois solvants (méthanol, éthanol et isopropanol) pour déterminer lequel était le plus réussi pour l'extraction du cortisol à partir d'échantillons de fourrure de koala.

L'objectif principal de cette étude était d'utiliser les techniques actuelles pour valider une technique optimale d'extraction d'hormones à utiliser comme mesure non invasive du cortisol de la fourrure de koala. Ceci a été réalisé en testant trois solvants d'extraction (méthanol, éthanol, et isopropanol). Nous avons émis l'hypothèse que le méthanol sera le solvant optimal utilisé pour extraire le cortisol de la fourrure de koala parce que c'est le solvant recommandé de l'extraction par arbor estocurant kits de cortisol²⁷.

Protocole

Ce projet a été réalisé selon des directives strictes en matière de soins aux animaux et aux humains. L'éthique animale a été accordée par l'Université Western Sydney (A12373). De plus, une évaluation des risques en laboratoire et une forme de biosécurité et de rayonnement ont été soumises et acceptées par l'Université Western Sydney pour entreprendre cette recherche en toute sécurité (B12366).

REMARQUE : Des échantillons de fourrure de koala pour ce projet ont été obtenus à l'Hôpital Adelaide Koala and Wildlife, situé au 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. La fourrure a été prise d'un koala qui avait été admis à l'hôpital et euthanasié en raison de leurs blessures graves. Le koala décédé avait été entreposé dans un congélateur dans un sac mortuaire peu après sa mort. Après avoir retiré le koala décédé du sac mortuaire, 1,2 g de fourrure a été rasé de la nuque à l'aide de tondeuses pour animaux standard. La fourrure a été rasée aussi près que possible de la peau, afin de s'assurer que la peau n'a pas été coupée. Une fois rasé, le koala décédé a été remis dans le sac mortuaire et placé dans le congélateur. La fourrure a ensuite été placée dans une poche en papier d'aluminium et stockée en dessous de -20 oC. En transit, la fourrure était gardée à température ambiante, et à l'arrivée au laboratoire, la fourrure était entreposée à -80 oC.

1. Extraction de cortisol de fourrure de Koala

1. Retirer la fourrure de l'entreposage à -80 oC et laisser le temps de décongeler.
2. Peser la fourrure sur un équilibre de précision analytique de laboratoire.
3. Placer 60 mg de la fourrure dans un tube de centrifugeuse pré-pesé et étiqueté de 1,5 mL et répéter jusqu'à ce que 18 tubes soient remplis.
   REMARQUE : 18 sous-échantillons de fourrure ont été utilisés pour cette étude de validation.
4. Ajouter 1 ml d'isopropanol de qualité 100% de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) à chaque tube à l'aide d'une pipette.
5. Échantillons de Vortex pour 30 s.
6. Filtrer chaque échantillon à l'aide d'un tamis de précision micro de 0,5 mm afin d'obtenir la séparation du liquide et de la fourrure.
7. Jeter le liquide dans un contenant à déchets.
8. Placer chaque échantillon de fourrure dans un bateau de pesage en plastique étiqueté, puis placer dans un dessiccateur sous vide, laisser la fourrure sécher pendant 3 jours.
9. Une fois complètement sec, placer chaque échantillon dans un tube de microcentrifuge de 1,5 ml étiqueté.
10. Placer chaque échantillon dans un moulin à perles avec 3 perles d'acier chromé (3,2 mm) et pulvériser pendant 2 min à 30 secousses par seconde.
11. Pipette 1,5 mL de la première technique d'extraction (éthanol de qualité analytique à 100 %) en 6 tubes microcentrifuges de 1,5 ml contenant l'échantillon de fourrure.
12. Effectuez la même chose pour le méthanol de qualité analytique 100% et l'isopropanol de qualité analytique 100% jusqu'à ce que dix-huit tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml soient remplis.
13. Capuchon de chaque tube microcentrifuge de 1,5 ml et incuber à température ambiante (RT) avec une pulsation constante à l'aide d'un shaker pendant 3 h.
14. Enlever et filtrer les échantillons à l'aide d'un tamis de précision micro de 0,5 mm.
15. Transférer le liquide dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml étiqueté à l''eau-d'œuvre tout en veillant à ce que la fourrure soit jetée de façon appropriée.
16. Extrait de solvant complètement sec sous un jet de vapeur N₂ sous un panneau de fumée.
17. Reconstituer l'extrait d'échantillon séché à l'aide de 400 l de tampon d'analyse (composition fournie dans le kit de cortisol commercial; voir Tableau des matériaux) et 100 L d'éthanol de qualité analytique à 100 %.
    REMARQUE: Les extraits d'échantillons peuvent être stockés à -80 .

2. Contrôles internes

1. Pour effectuer des contrôles, faire un pool d'échantillons extraits avec des niveaux élevés d'hormones. Pour faire ce pool, sélectionnez des échantillons d'animaux ayant une exposition connue au facteur de stress. Par exemple, sélectionnez des échantillons de koalas qui ont été sauvés d'un traumatisme environnemental car ils afficheront généralement des niveaux élevés d'hormones cortisol⁶.
   1. Pour faire le pool d'extraits, prendre 20 l'extrait de chaque échantillon (n ' 10) jusqu'à ce qu'un volume total de 200 L soit obtenu. Le pool d'extraitpeut peut être stocké à -80 C jusqu'à ce que les essais. Exécutez la piscine dans chaque essai en tant que contrôles internes bas ou élevés (voir l'étape 2.2).
2. Pour l'assidu, utilisez le pool pour faire des stocks pour des contrôles faibles et élevés qui se lient à 70% (C1) et 30% (C2), respectivement. Obtenir le facteur de dilution pour les points de liaison de 30 % et 70 % à partir du graphique du parallélisme pour l'extrait par rapport à la norme cortisol (figure 1). Utilisez le tampon d'assay pour la dilution du pool d'échantillons. Par exemple, utilisez 60 ll de l'extrait de piscine et 60 l de tampon d'extrait pour 1:2 dilution.
   REMARQUE : Pour l'extrait de méthanol, le point de liaison de 30 % était propre tandis que le point de liaison de 70 % était d'environ 1:2 selon la figure 1. Ainsi, ceux-ci ont fourni le facteur de dilution pour les contrôles internes (C1 et C2 respectivement) pour l'exécution dans l'analyse.

3. Analyse de cortisol dans des extraits de fourrure de koala

1. Utilisez un kit commercial de cortisol (tableaudes matériaux)et configurez la plaque de bande de puits 96 comprenant les échantillons, les commandes, les normes de cortisol, les puits de liaison non spécifiques et les puits de liaison maximum suivant les instructions du fournisseur. Utilisez la feuille de mise en page des plaques fournie dans le livret du kit pour énumérer les positions des échantillons, des commandes et des normes sur la carte des plaques.
   REMARQUE : Il est recommandé que tous les échantillons, contrôles et normes soient exécutés en double pour permettre l'exactitude des résultats.
2. Préparer des échantillons. Suivez l'extraction de l'hormone de fourrure (section 1) pour obtenir 100% de méthanol extrait de la fourrure de koala.
3. Préparer les réactifs. Suivez la procédure décrite dans le kit de cortisol commercial pour préparer les réactifs, y compris (1) tampon d'analyse, (2) tampon de lavage, et (3) les normes (compositions fournies dans le kit de cortisol, Tableau des matériaux).
4. Conformément aux instructions fournies dans le kit de cortisol, pipet 50 'L d'échantillons ou de normes dans les puits dans la plaque. Pipet 75 l et 50 l de tampon d'assay dans les puits de liaison non spécifiques (NSB) et les puits de liaison maximale (B0 ou zéro standard), respectivement.
5. Ajouter 25 ll du cortisol conjugué à chaque puits à l'aide d'un tuyau de répéteur. Ensuite, pipet 25 L de l'anticorps de cortisol dans chaque puits, à l'exception des puits NSB. Appuyez doucement sur les côtés de la plaque pour s'assurer que les réactifs sont bien mélangés.
6. Couvrir la plaque avec l'étanchéité et secouer à température ambiante pendant 1 h (à vitesse lente) à l'aide d'un shaker orbital.
7. Retirer le scellant de plaque et aspirer la plaque de puits en lavant chaque puits avec 300 ll de tampon de lavage 4 fois.
8. Séchez la plaque en tapant sur des serviettes absorbantes propres.
9. Pipette 100 l de substrat de téramethylbenzadine (TMB) (composition fournie dans le kit de cortisol, Table of Materials) à chaque puits.
10. Placer le scellant de plaque sur la plaque de puits et couver à RT pendant 30 min.
11. Pipette 50 l de solution d'arrêt à chaque puits.
12. Placez la plaque de puits dans un lecteur de plaque capable de lire 450 nm.
13. Pour calculer la concentration finale d'hormones, dériver la concentration finale de cortisol de fourrure en ng/mg de l'échantillon en multipliant la concentration d'hormone de pg/mL avec le volume final d'extrait (0.5 mL) et en divisant par la masse d'échantillon de fourrure (60 mg).

Résultats

La détection d'analyse des métabolites d'hormone d'intérêt est déterminée utilisant le parallélisme. À l'aide d'une courbe de parallélisme, le point de liaison de 50 % détermine également le facteur de dilution de l'échantillon sur la courbe standard (Figure 1). Comme le montre le graphique du parallélisme (Figure 1), les extraits d'éthanol à 100 % et d'Isopropanol à 100 % n'ont pas fourni de déplacement parallèle par rapport à la norme du cortisol. Cependant, l'extrai...

Discussion

Il existe un certain nombre d'études qui utilisent une gamme de techniques pour détecter le cortisol dans la fourrure de mammifères. Cette étude présente des résultats pour la détection du cortisol dans la fourrure recueillie à partir d'un koala sauvage exposé au stress anthropique actuel. Cette étude révolutionnaire a utilisé la fourrure pour tester lequel des trois solvants couramment utilisés sont les meilleurs pour extraire le cortisol, une mesure du stress chronique, de la fourrure de koala. Les résult...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge Tubes	n/a	n/a	1.5 mL
Chrome Steel Beads	n/a	n/a	3.2 mm x 3
Cortisol Kit	Arbor Assays	K003-H1W	Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	Arbor Assays	K003-H5	Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Isopropanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Methanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Micro Pipette	n/a	n/a	n/a
Micro Precision Sieve	n/a	n/a	0.5 mm
Microplate Reader	Bio Radi	n/a	n/a
Microplate Washer	Bio Radi	n/a	n/a
Orbital Shaker	Bio Line	n/a	n/a
Plastic Weighing Boat	n/a	n/a	n/a
Plate Sealer	n/a	n/a	n/a
Precision Balance	n/a	n/a	n/a
Vortex Mixer	Eppendorf	n/a	n/a