Cortisol Messung in Koala (Phascolarctos cinereus) Pelz

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bestimmung des optimalen Extraktionslösungsmittels zur Messung von Cortisol aus Koalafell. Die in diesem Protokoll verwendeten Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol und Isopropanol. Die Bestimmung eines optimalen Extraktionslösungsmittels hilft bei der zuverlässigen Messung von Fellen, um die Auswirkungen chronischer Belastungen auf Koalas zu bestimmen.

Zusammenfassung

Optimale Methoden der Hormonextraktion, die verwendet werden, um Stress bei Tieren über Stichprobenarten hinweg zu messen, sind nicht immer gleich. Australiens ikonische Beuteltierart, der Koala (Phascolarctos cinereus), sieht sich einer längeren Exposition anthropogener Stressoren ausgesetzt und die Bewertung von chronischem Stress in wilden Populationen ist dringend gerechtfertigt. Eine der effektivsten Methoden, um chronischen Stress zu messen, ist durch die Analyse des Glukokortikoidhormons Cortisol in Haar oder Fell, da es physiologische und Verhaltensreaktionen unterstützt. Diese Laborvalidierungsstudie zielt darauf ab, aktuelle Techniken zu testen, um eine optimale Hormonextraktionsmethode zu validieren, die als nicht-invasive Santids-Maßnahme von Cortisol in Koalafellen verwendet werden soll. Es wird anerkannt, dass die Verwendung nicht-invasiver Techniken zur Messung von Stresshormonen aufgrund ihrer idealen praktischen und ethischen Standpunkte gegenüber traditionellen, invasiven Techniken bevorzugt wird. Darüber hinaus ist es vergleichsweise einfacher, Fell von Koalas zu erwerben, als Proben ihres Blutes zu erwerben. Diese Studie verwendete Proben von Koala-Pelz, die vom Adelaide Koala and Wildlife Hospital erworben wurden, um eine Reihe von Hormonextraktionstechniken auszuführen, um eine optimale Cortisolextraktionsmethode zu validieren. Die Ergebnisse zeigten, dass 100% Methanol die optimale Lösungsmittelextraktion im Vergleich zu 100% Ethanol oder 100% Isopropanol auf der Grundlage von Parallelitätsergebnissen lieferte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode der Cortisolextraktion aus Koalafellen einen zuverlässigen nicht-invasiven Assay lieferte, der verwendet werden könnte, um chronischen Stress in Koalas zu untersuchen.

Einleitung

Australische Ökosysteme erhalten das menschliche Leben durch die Bereitstellung von Dienstleistungen einschließlich Nahrung und Ballaststoffen und vielen anderen dynamischen Wechselwirkungen¹. Ironischerweise ist es die menschliche Aktivität, die als haupttreibender Treiber für Dieökosystemstörungen durch den Wandel der biologischen Vielfalt fungiert². Die Fragmentierung von Lebensräumen, bekannt als der Prozess der Aufteilung großer kontinuierlicher Lebensräume in kleine, voneinander isolierte Landflächen, ist die größte anthropogene Veränderung der biologischen Vielfalt, die die australischen Ökosysteme bedroht². Die Fragmentierung der Lebensräume ändert die Struktur und Vielfalt der Artenzusammensetzung in einem bestimmten Gebiet und verringert so die Lebensraumfläche, die für diese Arten zur Erhaltung lebensfähiger Populationen erforderlich ist². Das Ergebnis ist ein verstärkter Wettbewerb zwischen Denarten um Ressourcen wie Nahrung, Treibstoff, Fasern und Wasser³. Die Zerstörung australischer Ökosysteme durch veränderungen in der biologischen Vielfalt hat katastrophale Folgen für viele australische einheimische Arten¹.

Australiens ikonischste Beuteltierart, der Koala (Phascolarctos cinereus), hängt davon ab, dass die australischen Ökosysteme für ihr Überleben gesund bleiben⁴. Die Einführung der Europäischen Siedlung führte zu einem rapiden Rückgang der australischen Koalaspopulationen, da sie in einem großen Exporthandel für ihre Felle geschlachtet wurden, um Profit zu erzielen⁵. Diese Praxis wurde in den 1980er Jahren verboten und populationen von Koalas waren dann in der Lage,⁵zu stabilisieren. Jedoch hat exponentielles Wachstum der menschlichen Bevölkerung dazu geführt, dass diese Art um einen Großteil ihres Lebensraums konkurriert, und ihr Überleben ist wieder bedroht⁶. Nach Angaben der International Union for the Conservation of Nature (IUCN) sind alle Populationenaustralischer Koalas als vom Aussterben bedroht gelistet, tendenzianisch. Diese Auflistung wird auf die Ungewissheit um relevante Populationsparameter und die deutliche Veränderung der Populationstrends für diese Art⁷zurückgeführt. Als die ikonischsten und endemischsten Tiere profitieren Koalas der australischen Wirtschaft durch den Tourismus (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Eine Schätzung legt nahe, dass der Koala-Tourismus etwa 9.000 Arbeitsplätze geschaffen hat und zwischen 1,1 und 2,5 Milliarden US-Dollar zur Wirtschaft beiträgt (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Die Entfernung einer Art hat das Potenzial, katastrophal zu sein, und kann in der stetigen Abnahme der einheimischen australischen Tierwelt⁶gesehen werden. Darüber hinaus wird die australische Wirtschaft die Auswirkungen spüren, wenn die Populationen der australischen Koalas weiterhin mit der Geschwindigkeit sinken, die sie⁶beträgt.

Es wird vermutet, dass die Prävalenz von Tod und Krankheit als Reaktion auf die Fragmentierung von Lebensräumen das Ergebnis von chronischem Stress ist⁸. Bereits jetzt wurden 24 Beuteltierarten in Australien aufgrund der Fragmentierung von Lebensräumen für ausgestorben erklärt, wobei Koalas einem ähnlichen Trend folgen⁸. Die Komplexität der Habitatfragmentierung und der biologischen Systeme ist synergistisch, kann aber durch die Analyse der Stressreaktion⁶ausgepackt werden. Im Allgemeinen aktiviert jede Störung in der natürlichen Umgebung eines Tieres eine komplexe Kaskade neurohormonaler Ereignisse, die als "Kampf oder Flucht"-Reaktion bekannt ist^9,10. Diese Reaktion auf Stress ist ein Prozess, der im Gehirn beginnt, wo die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) aktiviert ist¹¹. Eine Komponente des Gehirns namens Hypothalamus setzt corticotrophin-releasing Hormon (CRH) frei, das dann signalisiert, dass die vordere Hypophyse adrenocorticotrophic Hormon (ACTH)¹¹freisetzen. Dies wiederum stimuliert die Glukokortikoid-Sekretion aus der Nebennieren-Medulla. Der Körper zirkuliert Glukokortikoide durch das Blut, das die Speicherung von Glukose aus Glykogen leitet und Glukose aus gespeichertem Glykogen¹¹mobilisiert. Diese Kaskade neurohormonaler Ereignisse ist die Reaktion, die das Tier verwendet, um mit unvorhersehbaren Reizen umzugehen¹¹. Wenn jedoch Glukokortikoide freigesetzt werden und über einen längeren Zeitraum erhöht bleiben, gilt das Tier als chronischer Stress^12,13. Dieser Prozess beinhaltet die Ableitung von Energie weg von anderen körperlichen Körperfunktionen, wie es für die laufende Glukokortikoid-Produktion benötigt wird¹³. Als Ergebnis kann chronischer Stress Wachstum, Fortpflanzung und Immunität verbieten, alles sind wichtige Fitnessmerkmale, die für das Überleben erforderlich sind¹⁴.

Die Messung der Glukokortikoiumproduktion eines Tieres ist ein gängiger Indikator, der verwendet wird, um zu bestimmen, ob das Tier physiologischen Stress hat¹⁵. Dazu können Glukokortikoide im Blutplasma, Serum, Speichel, Urin oderFäkalien 16 gemessen werden. Jedoch, Beweise deuten darauf hin, dass Haar ist ein viel effektiver Indikator für chronischen Stress, im Gegensatz zu den oben genannten¹⁶. Dies liegt daran, Haar wird gedacht, um blutübertragene Hormone während seiner Wachstumsphase zu integrieren; sie ist relativ stabil; und jedes Cortisol, das im Haar nachgewiesen wird, spiegelt physiologischen Stress wider, der während des Zeitraums des Haarwachstums erlebt wird, der Wochen bis Monate¹⁶betragen kann. Darüber hinaus sollte jede Sammlung von Cortisol nicht-invasiv sein, um den Stress zu minimieren, der mit der Erfassung und Handhabung von¹⁶verbunden ist. Jedoch, Jeder Stress während dieses Ereignisses erlebt würde glukokortikoiden Ebenen im Haar nicht beeinflussen¹⁶. Es gab viele Studien, die die Fähigkeit der Verwendung von Haaren, um Langzeitstress bei einer Reihe von Tieren zu messen, und umfassen Studien an Rentier, Grizzlybären, Rhesusaffen, Muskoxen und Braunbären^{17,18, 19 , 20 , 21}. Haarcortisol wird in der Regel durch erstes Waschen der Probe extrahiert, um sicherzustellen, dass Schweiß und Talg-abgeleitetes Cortisol, das auf der Oberfläche des Haares abgelagert wird, nicht mit Cortisol mitextrahiert wird und dann die Probe in einem Perlenschlag pulverisiert²². Nach dem Waschen muss die Probe getrocknet werden, um eine vollständige Verdunstung zu gewährleisten²². Schließlich kann die Probe mit einem Lösungsmittel extrahiert und rekonstituiert werden, um den Test von Cortisol²²zu erleichtern. Das gängigste Lösungsmittel, das zur Gewinnung von Cortisol aus Fell verwendet wird, ist Methanol^21,23; es gibt jedoch einige Studien, die Ethanol und Isopropanol in ihren Cortisolextraktionstechniken verwenden. Zum Beispiel war eine Studie, die Ethanol verwendet, erfolgreich für die Extraktion von Cortisol aus menschlicher Fruchtwasser²⁴. Zusätzlich, eine Studie, die Isopropanol verwendet wurde erfolgreich für die Extraktion von Cortisol aus menschlichen Haaren und Nägeln^25,26. Aus diesem Grund wurden in dieser Studie alle drei Lösungsmittel (Methanol, Ethanol und Isopropanol) getestet, um festzustellen, welche für die Extraktion von Cortisol aus Proben von Koalafell am erfolgreichsten war.

Das primäre Ziel dieser Studie war es, aktuelle Techniken zu verwenden, um eine optimale Hormonextraktionstechnik zu validieren, die als nicht-invasive Sysolmessung aus Koalafell verwendet werden soll. Dies wurde durch die Prüfung von drei Extraktionslösungsmitteln (Methanol, Ethanol und Isopropanol) erreicht. Wir vermuteten, dass Methanol das optimale Lösungsmittel für die Extraktion von Cortisol aus Koala-Pelz verwendet wird, weil es das empfohlene Lösungsmittel der Extraktion durch Arbor Assay Cortisol Kits²⁷ist.

Protokoll

Dieses Projekt wurde unter strengen Richtlinien für die Tier- und Humanpflege durchgeführt. Tierethik wurde von der Western Sydney University (A12373) gewährt. Zusätzlich wurden eine Laborrisikobewertung sowie Biosicherheits- und Strahlenform eingereicht und von der Western Sydney University akzeptiert, um diese Forschung sicher durchzuführen (B12366).

HINWEIS: Koala-Pelzproben für dieses Projekt wurden vom Adelaide Koala and Wildlife Hospital am 282 Anzac Highway in Plympton South Australia gewonnen. Pelz wurde von einem Koala genommen, der ins Krankenhaus eingeliefert und wegen ihrer schweren Verletzungen eingeschläfert worden war. Der verstorbene Koala war kurz nach seinem Tod in einer Tiefkühltruhe in einer Leichentasche gelagert worden. Nach dem Entfernen des verstorbenen Koalas aus der Körpertasche wurden 1,2 g Fell mit Standard-Tierknipsern aus dem Nacken rasiert. Das Fell wurde so nah wie möglich an der Haut rasiert, um sicherzustellen, dass die Haut nicht geschnitten wurde. Einmal rasiert, wurde der verstorbene Koala wieder in die Leichentasche gelegt und in den Gefrierschrank gelegt. Das Fell wurde dann in einen Beutel aus Aluminiumfolie gelegt und unter -20 °C gelagert. Während des Transports wurde das Fell bei Umgebungstemperatur gehalten, und bei der Ankunft im Labor wurde das Fell bei -80 °C gelagert.

1. Koala Pelz Cortisol Extraktion

1. Entfernen Sie das Fell bei -80 °C aus dem Lager und lassen Sie Zeit zum Tauen.
2. Wiegen Sie das Fell auf einer laboranalytischen Präzisionswaage.
3. 60 mg des Fells in ein vorgewogenes und beschriftetes 1,5 ml Zentrifugenrohr geben und wiederholen, bis 18 Tuben gefüllt sind.
   HINWEIS: Für diese Validierungsstudie wurden 18 Pelz-Unterproben verwendet.
4. Mit einer Pipette 1 ml 100% Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Isopropanol in jedes Rohr geben.
5. Wirbelproben für 30 s.
6. Jede Probe mit einem 0,5 mm Mikropräzisionssieb abseihen, um eine Trennung von Flüssigkeit und Fell zu erreichen.
7. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in einem Abfallbehälter.
8. Legen Sie jede Fellprobe in ein beschriftetes Kunststoff-Wägeboot, dann legen Sie in einem Vakuum-Austrocknungsgerät, lassen Sie das Fell für 3 Tage trocknen.
9. Nach dem Trocknen jede Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr etikettiert.
10. Jede Probe in eine Perlenmühle mit 3 Chrom-Stahlperlen (3,2 mm) geben und 2 min bei 30 Shakes pro Sekunde pulverisieren.
11. Pipette 1,5 ml der ersten Extraktionstechnik (100% ethanolisch ananalytischem Wert) in 6 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, die die Fellprobe enthalten.
12. Führen Sie das gleiche für 100% analytisches Methanol und 100% analytisches Isopropanol durch, bis 18 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre gefüllt sind.
13. Je 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr kappen und bei Raumtemperatur (RT) mit konstantem Pulsieren mit einem Shaker für 3 h inkubieren.
14. Entfernen und dehnen Sie Proben mit einem 0,5 mm Mikropräzisionssieb.
15. Übertragen Sie die Flüssigkeit in ein neues, markiertes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit einer Pipette und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass das Fell entsprechend entsorgt wird.
16. Vollständig trockene Lösemittelextrakt unter einem Strom von N2-Dampf unter einem Rauchschrank.
17. Rekonstituieren Sie den getrockneten Probenextrakt mit 400 l Assaypuffer (Zusammensetzung im kommerziellen Cortisol-Kit; siehe Materialtabelle)und 100 l mit 100 % analytischem Ethanol.
    HINWEIS: Probenextrakte können bei -80 gespeichert werden.

2. Interne Kontrollen

1. Um Kontrollen zu machen, machen Sie einen Pool von extrahierten Proben mit hohen Hormonspiegel. Um diesen Pool zu erstellen, wählen Sie Proben von Tieren mit bekannter Exposition gegenüber Stressor aus. Wählen Sie beispielsweise Proben von Koalas aus, die vor Umwelttraumata gerettet wurden, da sie in der Regel hohe Cortisolhormonspiegel^{anzeigen 6}.
   1. Um den Extraktpool zu bilden, nehmen Sie 20 l Extrakt aus jeder Probe (n = 10), bis ein Gesamtvolumen von 200 l erreicht ist. Der Extraktpool kann bei -80 C bis zum Assays gespeichert werden. Führen Sie den Pool in jedem Test als niedrige oder hohe interne Steuerelemente aus (siehe Schritt 2.2).
2. Verwenden Sie für den Test den Pool, um Vorräte für niedrige und hohe Kontrollen zu erstellen, die bei 70 % (C1) bzw. 30 % (C2) binden. Erhalten Sie den Verdünnungsfaktor für die 30% und 70% Bindungspunkte aus dem Parallelitätsdiagramm für den Extrakt gegen den Cortisolstandard (Abbildung 1). Verwenden Sie den Assaypuffer für die Verdünnung des Probenpools. Verwenden Sie z. B. 60 l des Poolextrakts und 60 l Assaypuffer für 1:2 Verdünnung.
   HINWEIS: Für den Methanolextrakt war der Bindungspunkt von 30 % ordentlich, während 70 % Bindungspunkt etwa 1:2 gemäß Abbildung 1betrugen. Diese lieferten somit den Verdünnungsfaktor für die internen Kontrollen (C1 bzw. C2) für den Betrieb innerhalb des Assays.

3. Cortisol-Analyse in Koala-Pelz-Extrakten

1. Verwenden Sie ein kommerzielles Cortisol-Kit (Materialtabelle) und richten Sie die 96-Wellbandplatte mit den Proben, Kontrollen, Cortisolstandards, unspezifischen Bindebrunnen und maximalen Bindungsbrunnen gemäß den Anweisungen des Lieferanten ein. Verwenden Sie das im Kit-Booklet enthaltene Plattenlayoutblatt, um die Positionen von Proben, Steuerelementen und Standards auf der Plattenkarte aufzulisten.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, alle Proben, Steuerelemente und Standards in doppelter Ausführung auszuführen, um eine Genauigkeit der Ergebnisse zu ermöglichen.
2. Bereiten Sie Proben vor. Folgen Sie der Pelzhormonextraktion (Abschnitt 1), um 100% Methanol extrahiertes Koalafell zu erhalten.
3. Bereiten Sie Reagenzien vor. Befolgen Sie das im kommerziellen Cortisol-Kit beschriebene Verfahren zur Herstellung der Reagenzien einschließlich (1) Assaypuffer, (2) Waschpuffer und (3) Standards (Zusammensetzungen im Cortisol-Kit, Materialtabelle).
4. Gemäß den Anweisungen im Cortisol-Kit, Pipetten 50 l Proben oder Standards in Brunnen in der Platte. Pipetten Sie 75 l und 50 l Assaypuffer in die unspezifischen Bindungsbrunnen (NSB) bzw. die maximalen Bindungs-(B0- bzw. Null-Standard-) Bohrungen.
5. Fügen Sie jedem Brunnen mit einer Repeaterpipette 25 l des Cortisolkonjugats hinzu. Dann Pipetten 25 l des Cortisol-Antikörpers in jeden Brunnen, mit Ausnahme der NSB-Bohrungen. Tippen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte, um sicherzustellen, dass die Reagenzien gut gemischt sind.
6. Bedecken Sie die Platte mit dem Plattenversiegeler und schütteln Sie bei Raumtemperatur 1 h (bei langsamer Geschwindigkeit) mit einem Orbital-Shaker.
7. Entfernen Sie die Plattenversiegelung und aspirieren Sie die Wellplatte, indem Sie jeden Brunnen mit 300 l Waschpuffer 4 mal waschen.
8. Trocknen Sie die Platte, indem Sie die Platte auf saubere saugfähige Handtücher tippen.
9. Pipette 100 l Tetramethylbenzadin (TMB) Substrat (Zusammensetzung im Cortisol-Kit, Materialtabelle)zu jedem Brunnen.
10. Legen Sie den Plattenversiegeler auf die Brunnenplatte und inkubieren Sie bei RT für 30 min.
11. Pipette 50 l Stop-Lösung für jeden Brunnen.
12. Legen Sie die Brunnenplatte in einen Plattenleser, der 450 nm lesen kann.
13. Um die endgültige Hormonkonzentration zu berechnen, leiten Sie die endgültige Cortisolkonzentration des Fells in ng/mg der Probe ab, indem Sie die pg/ml-Hormonkonzentration mit dem endgültigen Extraktvolumen (0,5 ml) multiplizieren und durch die Fellprobenmasse (60 mg) dividieren.

Ergebnisse

Der Assay-Nachweis von Hormonmetaboliten von Interesse wird mittels Parallelität bestimmt. Mit Hilfe einer Parallelitätskurve bestimmt der 50%-Bindungspunkt auch den Probenverdünnungsfaktor auf der Standardkurve (Abbildung 1). Wie im Parallelitätsdiagramm (Abbildung 1) dargestellt, lieferten die 100% Ethanol- und 100% Isopropanol-Extrakte keine parallele Verschiebung gegenüber dem Cortisolstandard. Der 100%ige Methanolextrakt sorgte jedoch für eine parallele Verschiebung gegenüber...

Diskussion

Es gibt eine Reihe von Studien, die eine Reihe von Techniken verwenden, um Cortisol in Säugetierfell zu erkennen. Diese Studie präsentiert Ergebnisse für den Nachweis von Cortisol in Fellen, die von einem wilden Koala gesammelt wurden, der aktuellem anthropogenen Stress ausgesetzt ist. Diese bahnbrechende Studie verwendete Pelz, um zu testen, welches der drei häufig verwendeten Lösungsmittel am besten Cortisol, ein Maß für chronischen Stress, aus Koalafell extrahiert. Die Ergebnisse zeigten, dass 100% Methanol das...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge Tubes	n/a	n/a	1.5 mL
Chrome Steel Beads	n/a	n/a	3.2 mm x 3
Cortisol Kit	Arbor Assays	K003-H1W	Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	Arbor Assays	K003-H5	Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Isopropanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Methanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Micro Pipette	n/a	n/a	n/a
Micro Precision Sieve	n/a	n/a	0.5 mm
Microplate Reader	Bio Radi	n/a	n/a
Microplate Washer	Bio Radi	n/a	n/a
Orbital Shaker	Bio Line	n/a	n/a
Plastic Weighing Boat	n/a	n/a	n/a
Plate Sealer	n/a	n/a	n/a
Precision Balance	n/a	n/a	n/a
Vortex Mixer	Eppendorf	n/a	n/a