코알라의 코티솔 측정(파스콜아크토시네레우스)모피

요약

우리는 코알라 모피에서 코티솔을 측정하는 최적의 추출 용매를 결정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에 사용되는 용매는 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올이다. 최적의 추출 용매를 결정하면 모피를 안정적으로 측정하여 코알라에 대한 만성 스트레스의 영향을 결정하는 데 도움이 됩니다.

초록

샘플 유형에 걸쳐 동물의 스트레스를 측정하는 데 사용되는 호르몬 추출의 최적의 방법은 항상 동일하지 않습니다. 호주의 상징적인 화성 종인코알라(Phascolarctos cinereus)는인위적으로 유발된 스트레스에 장기간 노출되고 야생 인구의 만성 스트레스에 대한 평가가 시급히 보장됩니다. 만성 스트레스를 측정하는 가장 효과적인 방법 중 하나는 모발이나 털의 글루코코르티코이드 호르몬 코티솔을 분석하여 생리적 및 행동적 반응을 지원하는 것입니다. 이 실험실 검증 연구는 코알라 모피에서 코티솔의 비침습적 측정으로 사용되는 최적의 호르몬 추출 방법을 검증하기 위해 현재 기술을 테스트하는 것을 목표로합니다. 비침습적 기술을 사용하여 스트레스 호르몬을 측정하는 것이 이상적인 실용적이고 윤리적인 관점으로 인해 전통적인 침습적 기술보다 선호된다는 것이 인식되고 있습니다. 또한, 코알라에서 모피를 획득하는 것이 혈액 샘플을 획득하는 것보다 비교적 쉽습니다. 이 연구는 최적의 코티솔 추출 방법을 검증하기 위해 애들레이드 코알라와 야생 동물 병원에서 얻은 코알라 모피 샘플을 사용하여 여러 가지 호르몬 추출 기술을 실행했습니다. 결과는 100% 메탄올이 병렬성 결과에 기초하여 100% 에탄올 또는 100% 이소프로판에 비해 가장 최적의 용매 추출을 제공한다는 것을 보여주었다. 결론적으로, 코알라 모피에서 코티솔 추출의이 방법은 코알라에서 만성 스트레스를 연구하는 데 사용할 수있는 신뢰할 수있는 비 침습적 인 분석법을 제공했다.

서문

호주 생태계는 다른 많은 동적 상호 작용 중 음식과 섬유를 포함한 서비스의 제공을 통해 인간의 생명을^유지1. 아이러니하게도, 생물 다양성^변화를통해 생태계 붕괴의 지배적 인 동인으로 작동하는 인간의 활동2 . 서식지 단편화, 서로 고립 된 토지의 작은 패치로 큰 연속 서식지를 분할하는 과정으로 알려진, 호주생태계를 위협하는 주요 인위적 생물 다양성 변화2. 서식지 단편화는 어떤 주어진 지역에서 종 조성의 구조와 다양성을 수정, 따라서 가능한 인구를 유지하기위해 이러한 종에 필요한 서식지의 영역을 감소 2. 그 결과 식품, 연료, 섬유 및 물 3을 포함한자원에 대한 종 간의 경쟁이 심화됩니다. 생물 다양성 변화를 통해 호주 생태계의 파괴는 많은 호주 토착 종에 치명적인 결과를 초래하고^{있다 1}.

호주의 가장 상징적 인 화성 종인 코알라(Phascolarctos cinereus)는생존을 위해 건강한 호주 생태계에 달려^{있습니다 4}. 유럽 정착의 도입은 코알라의 호주 인구의 급속한 감소를 야기, 그들은 큰 수출 무역에서 이익을 추구하기위해 자신의 펠트에 대한 학살로 5. 이 관행은 1980 년대에 금지되었고 코알라의 인구는 5를안정시킬 수있었습니다. 그러나, 인간 인구의 기하 급수적 인 성장은 그들의 서식지의 대부분을 위해 경쟁하는이 종을 초래하고, 그들의 생존은^다시위협 6 . 국제자연보전연맹(IUCN)에 따르면, 호주 코알라의 모든 인구는 감소하는 인구 추세와함께 멸종위기에 취약한 것으로 등재되어 있다 7. 이 목록은 관련 인구 매개 변수에 대한 불확실성과이 종에대한 인구 동향의 현저한 변화에 기인7. 코알라는 가장 상징적이고 풍토성 동물로서 관광(NSW 환경 유산 사무소 2018)을 통해 호주 경제에 큰 혜택을 제공합니다. 추정에 따르면 코알라 관련 관광은 약 9,000개의 일자리를 창출했으며 경제에 1.1~25억 달러를 기여하고 있습니다(NSW 환경 유산 사무소 2018). 어떤 한 종의 제거는 치명적 일 가능성이 있으며, 토착 호주 야생 동물의 꾸준한 감소에서 볼 수 있습니다⁶. 또한, 호주 코알라의 인구가 6%로 계속 감소할 경우 호주 경제는 파급효과를 느낄 것입니다.

서식지 단편화에 대응하여 사망과 질병의 유병률이 만성 스트레스^의결과인 8. 이미 24종의 화석이 서식지 단편화로 인해 호주에서 멸종된 것으로 선언되었으며, 코알라도 비슷한 경향을 보이고^있다8. 서식지 단편화 및 생물학적 시스템의 복잡성은 시너지 효과가 있지만 응력 반응 의분석을 통해 압축을 풀 수 있습니다 6. 일반적으로, 동물의 자연환경의 어떠한 교란은 '싸움 또는 비행' 반응으로 알려진 신경 호르몬사건의 복잡한 폭포를 활성화한다 9,^10. 스트레스에 대한 이러한 반응은 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축이 활성화되는 뇌에서 시작되는 과정입니다^11. 시상 하 부 라는 뇌의 구성 요소는 코르 티 코 트로 핀 방출 호르몬을 출시 (CRH), 다음 동맥 상관 호르몬 호르몬을 해제 하는 전방 뇌 하 수 체 신호 (ACTH)^11. 이것은 차례로 부신 수질에서 글루코 코르티코이드 분비를 자극합니다. 신체는 혈액을 통해 글루코 코르티코이드를 순환하여 글리코겐에서 포도당 저장을 전환하고 저장된 글리코겐^11에서포도당을 동원합니다. 이러한 신경호르몬 이벤트의 폭포는 예측할 수 없는 자극을 처리하기 위해 동물이사용하는 반응이다(11). 그러나 글루코 코르티코이드가 방출되고 장기간 상승 된 상태로 유지되면 동물은 만성 스트레스^12,13을경험하는 것으로 간주됩니다. 이 과정은 다른 신체 기능에서 에너지를 전환 포함, 그것은 지속적인 글루코 코르티코이드 생산에 필요한 13. 그 결과, 만성 스트레스는 성장을 금지 할 수 있습니다, 재생산 과 면역, 모든 생존에 필요한 주요 피트니스 특성인^14.

동물의 글루코코르티코이드 생산을 측정하는 것은 동물이 생리적 스트레스를 경험하고 있는지 여부를 결정하는 데 사용되는 일반적인 지표이다^15. 이를 위해, 글루코코르티코이드는 혈장, 혈청, 타액, 소변 또는 대변^16에서측정될 수 있다. 그러나, 증거는 머리가 앞서 언급 한 반대로 만성 스트레스의 훨씬 더 효과적인 지표임을 시사¹⁶. 이 때문에 머리는 성장 단계 동안 혈액 매개 호르몬을 통합 하는 것으로 생각 된다; 비교적 안정적입니다. 그리고 머리에서 검출 된 모든 코티솔은 모발 성장 기간 동안 경험한 생리적스트레스를 반영하며, 이는 16 개월까지 몇 주가 될 수 있습니다. 또한, 코티솔의 모든 컬렉션은 캡처 및 처리와 관련된 스트레스를 최소화하기 위해 비 침습적이어야한다¹⁶. 그러나, 이 이벤트 동안 경험 하는 어떤 스트레스 머리에 글루코 코르티코이드 수준에 영향을 주지 않을 것^{이다 16}. 동물의 숫자에 장기 스트레스를 측정 하기 위해 머리를 사용 하 여 숙련도 탐구 하는 많은 연구가 되었습니다., 순 록에 대 한 연구를 포함 하 여, 회색 곰, rhesus 원숭이, muskoxen, 그리고 갈색 곰^{17,18, 19세 , 20개 , 21}. 모발 코티솔은 일반적으로 모발표면에 증착된 땀과 피지 유래 코티솔을 확인하기 위해 먼저 시료를 세척하여 추출한 후 비드비터(22)에서 시료를 분쇄하지 않는다. 세척 후, 시료는 완전한 증발을 보장하기 위해 건조될 필요가^있다(22). 마지막으로, 용매를 사용하여, 샘플을 추출하고 코티솔(22)의 분석이용이하게 하기 위해 재구성될 수 있다. 모피에서 코티솔을 추출하는 데 사용되는 가장 일반적인 용매는 메탄올^21,23; 그러나, 그들의 코 티 솔 추출 기술에 에탄올과 이소 프로판올을 사용 하는 몇 가지 연구가 있다. 예를 들어, 에탄올을 사용한 연구는 인간 양수^24에서코티솔을 추출하는 데 성공했습니다. 또한, 이소프로판올을 사용한 연구는 인간의 머리카락과 손톱25,^26에서코티솔을 추출하는 데 성공했다. 이러한 이유로, 이 연구는 코알라 모피 샘플에서 코티솔을 추출하는 데 가장 성공적인 용매(메탄올, 에탄올 및 이소프로판올)를 모두 테스트했습니다.

이 연구의 주요 목적은 코알라 모피에서 코티솔의 비 침습적 측정으로 사용되는 최적의 호르몬 추출 기술을 검증하기 위해 현재의 기술을 사용하는 것이었습니다. 이것은 3개의 추출 용매 (메탄올, 에탄올 및 이소프로판올)를 시험함으로써 달성되었다. 우리는 메탄올이 코알라 모피에서 코티솔을 추출하는 데 사용되는 최적의 용매가 될 것이라고 가설을 세우고, 아버 분석 코티솔 키트^27에의한 추출의 권장 용매이기 때문이다.

프로토콜

이 프로젝트는 엄격한 동물 및 인간 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 윤리웨스턴 시드니 대학에 의해 부여 되었다 (A12373). 또한, 실험실 위험 평가 및 생물 안전 및 방사선 양식 제출 하 고 안전 하 게이 연구를 착수 하는 웨스턴 시드니 대학에 의해 허용 (B12366).

참고: 이 프로젝트의 코알라 모피 샘플은 호주 플림턴 의 282 Anzac 고속도로에 위치한 애들레이드 코알라 와 야생 동물 병원에서 얻었습니다. 모피는 병원에 입원한 코알라 한 곳에서 옮겨졌고 심각한 부상으로 안락사를 당했다. 고인은 죽은 직후 바디백 안에 냉동실에 보관되어 있었다. 바디 백에서 죽은 코알라를 제거한 후, 표준 동물 클리퍼를 사용하여 목 덜미에서 1.2 g의 모피를 면도했습니다. 털은 피부에 최대한 가깝게 면도하여 피부가 잘리지 않도록 했습니다. 일단 면도한 후, 고인은 다시 바디 백에 넣고 냉동실에 넣었습니다. 모피를 알루미늄 호일로 만든 파우치에 넣고 -20°C 이하로 보관하였다. 이동 중에, 모피를 주변 온도에서 유지하고, 실험실에 도착했을 때, 모피를 -80°C에서 보관하였다.

1. 코알라 모피 코티솔 추출

1. -80 °C에서 저장에서 모피를 제거하고 해동 시간을 허용합니다.
2. 실험실 분석 정밀 균형에 모피를 무게.
3. 모피 60 mg을 미리 계량하고 라벨이 붙은 1.5 mL 원심 분리튜브에 넣고 18개의 튜브가 채워질 때까지 반복합니다.
   참고: 이 검증 연구에는 18개의 모피 서브 샘플이 사용되었습니다.
4. 파이펫을 사용하여 각 튜브에 1mL의 1mL를 100% 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등급이 추가합니다.
5. 30 초 동안 소용돌이 샘플.
6. 액체와 모피의 분리를 달성하기 위해 0.5 mm 마이크로 정밀 체를 사용하여 각 샘플을 변형시.
7. 액체를 폐기 용기에 버리십시오.
8. 각 모피 샘플을 라벨이 부착된 플라스틱 계량 보트에 넣고 진공 건조기에 넣고 모피를 3일 동안 건조시도록 둡니다.
9. 완전히 건조되면 각 샘플을 라벨이 부착된 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.
10. 각 샘플을 3크롬 강철 비드(3.2mm)로 비드 밀에 놓고 초당 30쉐이크에서 2분 간 분쇄합니다.
11. 모피 샘플을 함유하는 6 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 최초의 추출 기술(100% 분석 등급 에탄올)의 피펫 1.5 mL.
12. 18 1.5 mL 미세 원심 분리튜브가 채워질 때까지 100% 분석 등급 메탄올 및 100% 분석 등급 이소프로판올에 대해 동일한 작업을 수행합니다.
13. 각 1.5 mL 미세원심지 튜브를 캡하고 실온(RT)에서 3시간 동안 셰이커를 사용하여 일정한 맥동으로 배양합니다.
14. 0.5mm 마이크로 정밀 체를 사용하여 샘플을 제거하고 변형시.
15. 푸가 적절하게 폐기되도록하면서 파이펫으로 표시된 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 액체를 옮김을 옮김을 합니다.
16. 연기 찬장 에서 N₂ 증기의 스트림에서 완전히 건조 용매 추출물.
17. 400 μL의 분석 버퍼(상업용 코티솔 키트에 제공된 조성물; 재료 표참조)와 100 μL의 분석 등급 에탄올을 사용하여 건조된 샘플 추출물을 재구성합니다.
    참고 : 샘플 추출물은 -80에 저장할 수 있습니다.

2. 내부 통제

1. 컨트롤을 만들려면, 높은 호르몬 수준으로 추출 된 샘플의 풀을 확인. 이 풀을 만들려면 스트레스에 노출된 것으로 알려진 동물의 샘플을 선택합니다. 예를 들어, 그들은 일반적으로 높은 코 티 솔 호르몬 수준을 표시 합니다 환경 외상에서 구출 된 코알라에서 샘플을 선택^6.
   1. 추출물 풀을 만들려면, 총 부피가 200 μL이 얻어질 때까지 각 샘플(n = 10)에서 추출물 20 μL을 섭취하십시오. 추출 풀은 -80 C에서 시술을 받을 때까지 저장할 수 있다. 각 분석에서 낮은 또는 높은 내부 제어로 풀을 실행합니다(2.2단계 참조).
2. 분석의 경우 풀을 사용하여 각각 70%(C1) 및 30%(C2)로 바인딩되는 낮고 높은 컨트롤에 대한 주식을 만듭니다. 코티솔 표준에 대하여 추출물에 대한 병렬성 그래프로부터 30% 및 70% 결합점에대한 희석 계수를 얻었다(도 1). 샘플 풀의 희석을 위해 분석 버퍼를 사용합니다. 예를 들어, 풀 추출물의 60 μL및 1:2 희석을 위한 분석 버퍼의 60 μL을 사용한다.
   참고: 메탄올 추출물의 경우, 30% 결합 점은 깔끔하고 70% 결합 점은 도1에 따라 약 1:2였습니다. 따라서, 이들은 분석내 의 실행을 위한 내부 대조군(C1 및 C2)에 대한 희석 계수를 각각 제공하였다.

3. 코알라 모피 추출물의 코티솔 분석

1. 상업용 코티솔 키트(재료 표)를 사용하고 공급업체의지시에 따라 샘플, 제어, 코티솔 표준, 비특이적 결합 웰 및 최대 결합 웰을 포함하는 96 개의 웰 스트립 플레이트를 설정합니다. 키트 소책자에 제공된 플레이트 레이아웃 시트를 사용하여 플레이트 맵에 샘플, 컨트롤 및 표준의 위치를 나열합니다.
   참고: 결과의 정확성을 허용하기 위해 모든 샘플, 컨트롤 및 표준을 중복으로 실행하는 것이 좋습니다.
2. 샘플을 준비합니다. 모피 호르몬 추출 (섹션 1)을 따라 100 % 메탄올 추출 코알라 모피를 얻습니다.
3. 시약을 준비합니다. 상용 코티솔 키트에 기재된 절차를 따라 (1) 분석 버퍼, (2) 세척 버퍼 및 (3) 표준(코티솔 키트, 재료표에 제공된 조성물)을 포함하는 시약을 준비한다.
4. 코티솔 키트에 제공된 지침에 따라, 파이펫 50 μL의 샘플 또는 표준이 플레이트의 우물에 들어갑니다. 파이펫 75 μL 및 50 μL의 분석 버퍼를 각각 비특이적 결합(NSB) 웰 및 최대 결합(B0 또는 제로 표준) 웰내로 한다.
5. 중계기 피펫을 사용하여 각 우물에 코티솔 컨쥬게이트 25 μL을 추가합니다. 이어서 NSB 웰을 제외한 각 웰내로 코티솔 항체의 25 μL을 피펫한다. 시약이 잘 혼합되어 있는지 확인하기 위해 부드럽게 플레이트의 측면을 누릅니다.
6. 플레이트 실러로 플레이트를 덮고 궤도 셰이커를 사용하여 실온에서 1시간(느린 속도로) 흔들어 줍니다.
7. 플레이트 실러를 제거하고 300 μL의 세척 버퍼로 각각 잘 세척하여 웰 플레이트를 4회 흡인한다.
8. 깨끗한 흡수성 수건에 접시를 눌러 접시를 건조.
9. 피펫 100 μL의 테트라메틸벤자딘(TMB) 기질(코티솔 키트, 재료표에 제공된 조성물)을 각각 잘 한다.
10. 플레이트 실러를 웰 플레이트에 놓고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
11. 각 웰에 스톱 솔루션의 피펫 50 μL.
12. 450 nm를 읽을 수있는 플레이트 리더에 우물 플레이트를 놓습니다.
13. 최종 호르몬 농도를 계산하기 위해, 최종 추출 량 (0.5 mL)과 pg / mL 호르몬 농도를 곱하고 모피 샘플 질량 (60 mg)으로 나누어 샘플의 ng / mg에서 최종 모피 코티솔 농도를 파생시.

결과

관심 의 호르몬 대사 산물의 분석 검출은 병렬을 사용하여 결정된다. 병렬처리 곡선을 사용하여, 50% 결합 점은 또한 표준 곡선에 대한샘플 희석 계수를 결정한다(도 1). 병렬성 그래프(도 1)에 나타낸 바와 같이, 100% 에탄올 및 100% 이소프로판올 추출물은 코티솔 표준에 대하여 병렬 변위를 제공하지 않았다. 그러나, 100% 메탄올 추출물은 코티솔 표준에 대하여 병렬 변위를 ?...

토론

포유류 모피에서 코티솔을 검출하기 위해 다양한 기술을 사용하는 여러 연구가 있습니다. 이 연구는 현재 인위적 스트레스에 노출된 야생 코알라에서 채취한 모피에서 코티솔을 검출하는 결과를 제시합니다. 이 획기적인 연구는 코알라 모피에서 만성 스트레스의 척도인 코티솔을 추출하는 데 가장 적합한 3가지 용매를 테스트하기 위해 모피를 사용했습니다. 결과는 100% 메탄올이 포유류 모피의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge Tubes	n/a	n/a	1.5 mL
Chrome Steel Beads	n/a	n/a	3.2 mm x 3
Cortisol Kit	Arbor Assays	K003-H1W	Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	Arbor Assays	K003-H5	Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Isopropanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Methanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Micro Pipette	n/a	n/a	n/a
Micro Precision Sieve	n/a	n/a	0.5 mm
Microplate Reader	Bio Radi	n/a	n/a
Microplate Washer	Bio Radi	n/a	n/a
Orbital Shaker	Bio Line	n/a	n/a
Plastic Weighing Boat	n/a	n/a	n/a
Plate Sealer	n/a	n/a	n/a
Precision Balance	n/a	n/a	n/a
Vortex Mixer	Eppendorf	n/a	n/a