زرع داخل البطين من السلائف العصبية المهندسة لدراسات الهندسة العصبية في الجسم الحي

Simone Chiola; Manuela Santo; Antonello Mallamaci

doi:10.3791/59242

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

استنادا ً إلى الهندسة الفيروسية في المختبر للسلائف العصبية، وزرعها المشترك في العقول البرية والتقييم المورفومتري المقترن لمشتقات "الاختبار" و"التحكم"، تسمح هذه الطريقة بنمذجة دقيقة للتحكم في الجينات الحية للنيوكورتيكال مورفولوجيا الخلايا العصبية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة.

Abstract

السيطرة الجينية على الخلايا العصبية هي حاليا موضوع تحقيق مكثف. يوصف هنا هو طريقة بسيطة وضعت لدراسة في السيطرة على الجينات في الجسم الحي من مورفولوجيا الخلايا العصبية الإسقاط neocortical. ويستند هذا الأسلوب على (1) في الهندسة في المختبر lentiviral من السلائف العصبية كما "اختبار" و "السيطرة" الخلايا، (2) زرع مشترك في العقول البرية من نوع، و (3) تقييم مورفومتري المقترنة من مشتقاتها العصبية. وعلى وجه التحديد، تستخدم السلائف البللة E12.5 من المتبرعين بالخلايا العصبية، والمسمى وراثيا، لهذا الغرض. وهي مصممة للاستفادة من المروجين المختارين وتكنولوجيا التيتون/أوف، وهي مزروعة يدوياً حرة في البطينين الجانبيين حديثي الولادة. في وقت لاحق، عند التنميط المناعي للعقول المتلقية، يتم تغذية الصور الظلية من الخلايا العصبية المزروعة في برامج المصدر المفتوح NeurphologyJ، يتم استخراج المعلمات مورفومترية، ويتم حساب متوسط الطول ومؤشر المتفرعة. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، وهذا واحد يقدم ثلاث مزايا رئيسية: أنه يسمح بتحقيق رقابة دقيقة على التعبير عبر الجينات بتكاليف معقولة، فإنه يتطلب فقط المهارات الجراحية الأساسية، ويوفر نتائج موثوقة إحصائيا عند تحليل محدود عدد الحيوانات. غير أنه بسبب تصميمه، فإنه لا يكفي لمعالجة السيطرة غير المستقلة للخلايا على الهندسة العصبية. وعلاوة على ذلك، فإنه يفضل أن تستخدم للتحقيق في السيطرة على مورفولوجيا النيورايت بعد الانتهاء من الهجرة العصبية. في تركيبته الحالية، يتم ضبط هذه الطريقة بشكل رائع للتحقيق في السيطرة الجينية على بنية الخلايا العصبية الجديدة الجلوتاماستيك. الاستفادة من خطوط المعدلة وراثيا التعبير عن EGFP في أنواع الخلايا العصبية محددة أخرى، فإنه يمكن إعادة الغرض لمعالجة السيطرة الجينية من هندستها المعمارية.

Introduction

هنا نقوم بوصف طريقة بسيطة وضعناها لتشريح في السيطرة على الجينات في الجسم الحي من الخلايا العصبية. استنادا إلى الهندسة في المختبر من السلائف العصبية، وزرعها في الدماغ حديثي الولادة والتقييم المورفومتري المقترن من "اختبار" و "السيطرة" الخلايا، فإنه يسمح للكشف عن الآثار الوظيفية للجينات اختبار في السيطرة الدقيقة على مورفولوجيا الخلايا العصبية في طريقة سريعة وبأسعار معقولة. للتحقيق في السيطرة على الجينات الحية للهندسة العصبية العصبية، يجب معالجة ثلاث قضايا تقنية رئيسية: (1) تحقيق تعبير جين الاهتمام (GOI) منقوشة بشكل كاف ومراقبة كمية دقيقة منه؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية الكافية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية الكافية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (3) تحقيق ذلك التعبير المنقوش بشكل كاف. (2) الحصول على تصور مجزأة بشكل صحيح من الصور الظلية العصبية متميزة؛ (3) استخلاص الأهمية الإحصائية للنتائج مع توظيف عدد محدود من الحيوانات.

عندما تكون متاحة، قد تكون خطوط متحولة الماوس التي تأوي التتراسيكلين (تيت) التي تسيطر عليها الجينات المتحولة أفضل أداة لمعالجة العدد الأول¹. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام التثناع الجسدي. في مثل هذه الحالات ، يتم تسليم الترانسجين عن طريق الكهرباء² أو التحويل الفيروسي³. بعد ذلك، يتم الاحتفاظ به كإبيسوم (على سبيلالمثال، على الكهربة القياسية 4)، أو يتم دمجها في الجينوم (عشوائيا، عن طريق integrase الرجعية⁵؛ أو في موقع محدد، عن طريق كريسبر الترويج لإعادة تركيبة متجانسة (SLENDR)⁶ ).

ثانياً، يمكن تحقيق تصور الصور الظلية العصبية من خلال (أ) وضع العلامات الموحدة المتناثرة أو (ب) وضع العلامات التفاضلية الكثيفة. أما بالنسبة لوضع العلامات متفرقة، يمكن استخدام منهجيات متقدمة مثل Golgi⁷، يمكن ملء مصغرات الخلايا العصبية المختارة من قبل biocytin⁸، ويمكن الحصول على وضع العلامات الملح والفلفل بفضل transgene معبر عن هائج. مثل هذا الجين قد يعرض النسخ المتنوع (Thy-EGFP)⁹ أو يمكن تنشيطه عن طريق إعادة تركيب ة الاستوكاستك (MORF)¹⁰. أما بالنسبة لـ (ب)، فإن الاستراتيجيات المتطورة تشمل إعادة تركيب الاستوكاستك بوساطة كري ضمن صفيف متعدد البروتينات الفلورية (Brainbow)^11،فضلاً عن التكامل الجيني الذي يحركه البيكونباك-ترانسبوساز لجينات البروتين الفلوري، سابقاً تسليمها عن طريق التثناق الجسدي (CLoNE)¹².

أما بالنسبة للمسألة الثالثة، فإن النتيجة المورفومترية تتأثر في كثير من الأحيان بتباين عشوائي كبير، ينشأ عن الاختلافات بين الحيوانات والطوارئ المتعلقة بحقن الخلايا. ولهذا الغرض، يستخدم عادة عدد كبير من الحيوانات لتحقيق القوة الإحصائية اللازمة لتقييم النشاط المورفولومتري GOI.

وكثيرا ما تعتمد النهج التي سبق وصفها على المهارات التقنية المتقدمة وتتطلب موارد مالية واضحة، مما قد يحد من انتشارها داخل الأوساط العلمية. للتحايل على هذه القضايا، تصورنا خط أنابيب سهلة ومباشرة لتشريح السيطرة الجينية للهندسة العصبية في الجسم الحي بطريقة سريعة وبأسعار معقولة. هذا مستوحى من تصميم مماثل زرع مشترك وضعت سابقا لسريع في تقييم الجسم الحي للنشاط عبر الانترابسيتش¹³.

وعلى وجه التحديد، يعتقد أن الزرع المشترك للسلائف العصبية "الخضراء" المهندسة في المختبر ("اختبار" و "التحكم" الخلايا) في الدماغ "الأسود" الوليد المتلقي يمكن أن يصلح في وقت واحد القضايا الرئيسية الثلاث المذكورة أعلاه. في الواقع، في المختبر الهندسة اللينفيروسير من السلائف، في ظروف تسيطر عليها جيدا، ويسمح الحفاظ على تقلب التعبير عبر الخلايا في الحد الأدنى، أقل بكثير من تلك المرتبطة عادة في التلاعب الجسدية في الجسم الحي (التي أجريت سابقا ^{14 سنة} ^, ¹⁵ وفي نتائجنا غير المنشورة). والسيطرة الدقيقة الناتجة عن ذلك على التعبير الجيني قابلة للمقارنة مع تلك التي حققتها النماذج المحورة وراثيا التي تسيطر عليها التي تسيطر عليها التيت. ومع ذلك، فإن تكاليف هذا الإجراء أقل بكثير من تلك الناشئة عن صيانة خط ماوس المعدل وراثياً. بعد ذلك، حقن الخلايا الحرة سهلة وتتطلب الحد الأدنى من التدريب. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة ضبط كمية السلائف المسماة التي تحقن في كل دماغ لتحقيق عدد تراكمي كاف من السلائف الموزعة توزيعا ضئيلا، مع الإبقاء أيضا على العدد الإجمالي للالحيوانات المزروعة عند الحد الأدنى. وأخيراً وليس آخراً، فإن الحقن المشترك للسلائف ذات العلامات الفلورية المختلفة و"الاختبار" و"المراقبة" والتحليل الإحصائي الثنائي اللاحق للنتائج يتصدى لآثار التغير التجريبي بين الحيوانات، مما يسمح بالوصول إلى الأهمية الإحصائية للنتائج، حتى بعد تحليل عدد محدود من الأفراد¹³.

وينبغي التأكيد على أن هذه الطريقة، وإن كانت سريعة ورخيصة، لها لدينا قيودان رئيسيتان. أولا، تم تصميمه للتحقيق في السيطرة الجينية الخلية المستقلة من العمارة العصبية، وليس من المناسب لمعالجة السيطرة البيئية. ثانيا، كما السلائف العصبية المزروعة تصل إلى موقعها النهائي من قبل جدول زمني غير متجانسة، وهذا الأسلوب هو أفضل من نموذج التحكم neuroarchitectonics التي تحدث الانتهاء من الهجرة الماضية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأساليب والإجراءات الموضحة هنا من قبل SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).

1- توليد مجمعات ذرية "خضراء" هندسية

إعداد حمام السباحة "الأخضر"
1. ماتي أنثى من نوع البرية CD1 مع مؤسس ^{MTAPT EGFP / +} ¹⁶. قتل السد الحامل عن طريق خلع عنق الرحم في 12.5 يوما بعد الكتوم (يتم تحديد اليوم 0 عن طريق فحص المكونات المهبلية) وحصاد الأجنة اليوم الجنيني 12.5 (E12.5). تعيين لهم في الآبار الفردية من لوحة 24 multiwell في حل PBS الباردة.
2. النمط الجيني بسرعة الأجنة عن طريق التفتيش البصري تحت مصباح الضوء الأزرق، والتحقق من انبعاث الفلورة الخضراء في العقول.
3. ضع الأجنة "الخضراء" في طبق بيتري قطره 10 سم مملوء بسائل PBS بارد 1x مع جلوكوز بنسبة 0.6% ونقله إلى تحت مجهر مجسم.
4. قطع رؤوس الأجنة باستخدام مقص قياسي واستخراج telencephalon منها عن طريق #3 وملقط #5.
5. فصل الحويصلات telencephalic اثنين وتشريح من neocortices باستخدام ملقط. تأكد من إزالة الحصين والعقد القاعدية¹⁷.
6. جمع neocortices عن طريق نقلها مع ماصة P1000 في أنبوب 1.5 مل أبقى على الجليد.
7. دع النيوكورتيسيس المعدّل يستقر ّ إلى أسفل الأنبوب.
8. يستنشق الخارق قدر الإمكان.
9. إعادة تعليق نيوكورتيسيس في 400 ميكرولتر من المتوسطة التكاثرية الطازجة [DMEM-F12، 1X غلوماماكس، 1X N2، 1 ملغ / مل ألبوممصل البقر (BSA)، 0.6٪ الجلوكوز، 2 ميكروغرام / مل الهيبارين، 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF)، 1X القلم العقدة، و 10 pg/mL amphotericin B].
10. ماصّة بلطف النيوكورتيسيس صعودا وهبوطا، بالتتابع مع نصائح P1000، P200، وP20، 4X لكل طرف، للحصول على تعليق خلية غائمة.
  ملاحظة: E12.5 الأنسجة القشرية الجديدة لينة جداً; فصلها إلى خلايا واحدة لا يتطلب الهضم الأنزيمي على الإطلاق. تكرار الأنابيب كافية.
11. دع السحايا والكتل القشرية الجديدة المتبقية تستقر لمدة دقيقتين.
12. نقل 150 درجة مئوية من الجزء العلوي من تعليق الخلية (تحتوي أساسا على خلايا واحدة) في أنبوب معقمة 1.5 مل جديدة.
13. إضافة 150 درجة مئوية من المتوسطة التكاثرية الطازجة وكرر الخطوات 1.1.10-1.1.12 حتى لا مزيد من كتل الأنسجة واضحة. أثناء القيام بذلك، حذف الخطوة P1000 pipetting (في الخطوة 1.1.10).
  ملاحظة: ثلاثة تكرار للخطوات 1.1.10-1.1.12 عادةً ما تكون كافية لتحقيق تفكك الأنسجة الكاملة.
14. عد الخلايا ("الأخضر" تجمع) مع طريقة استبعاد الأزرق trypan في غرفة Bürker¹⁷ وإضافة المتوسطة التكاثرية الطازجة لضبط التركيز إلى 10³ خلايا / ميكرول.
  ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 1.1.7-1.1.14 تحت غطاء تدفق اللامينار العقيم الذي تم تطهيره بنسبة 70% من الإيثانول والحفاظ على التهوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
هندسة المجمعات الفرعية "الخضراء"
1. تقسيم تجمع "الأخضر" إلى اثنين من المجمعات الفرعية في اثنين من أنابيب 1.5 مل متميزة للعدوى فيروسي العدس.
2. اُصيب المسابح الفرعية بشكل مستقل مع الخلطات اللينة المخصصة. كل مزيج يحتوي على "التسمية الحمراء" فيروس (Pgk1_mCherry) أو "أسود" فيروس (pCAG_lacZ) كعنصر تحكم، فضلا عن الفيروسات لtransgene التيتوف مدفوعة (Pgk1p_tTA وTRE_transgene) أو السيطرة (Pgk1p_tTA وTRE_PLAP) التعبير.
  تحذير: التعامل مع الفيروسات اللينة في بيئة BLS-2 مع جميع القياسات الوقائية المنصوص عليها في القواعد والقوانين المعمول بها.
  ملاحظة: يجب أن تدار كل فيروس lenti في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 8، والتي (كما هو مبين سابقا¹⁴⁾يكفي لتبديل الغالبية العظمى من الخلايا العصبية في مثل هذه الظروف التجريبية (الشكل1). يمكن بناء فيروس lentivirus التي تأوي أجهزة تحويل التجانب عن طريق توظيف مروجين عصبيين مختلفين يقودون تعبير tTA/rtTA (على سبيل المثال، pTα1، pSyn، pCaMKII، pGAD1، وما إلى ذلك) (الشكل2). وزارة الداخلية هي نسبة (أ) عدد الجسيمات الفيروسية المعدية التي يتم تسليمها إلى (ب) عدد الخلايا المستهدفة. هنا، يتم حساب السابق (أ) وفقا للإجراء التقليدي الموصوف في مكان آخر¹⁴، يتم تقييم الأخير (ب) ببساطة باستخدام غرفة بوركر.
3. لوحة 600،000 خلية من كل تجمع فرعي المصابة لكل بئر من لوحة 12 multiwell، في 600 ميكرولتر من المتوسطة التكاثرية مع 2 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين.
  ملاحظة: هنا، لا يتم معالجة الآبار مسبقا مع بولي يسين، الذي يمنع تعلق الخلايا العصبية إلى قيعان.
4. نقل الخلايا إلى الحاضنة في 5٪ CO₂ في 37 درجة مئوية.
5. بعد 2 أيام، لتقييم كفاءة العدوى ووضع علامات تفاضلية من برك هندسية، وفحص الخلايا تحت المجهر الفلورسنت التقليدية. يجب أن يظهر البرك الفرعية اثنين كتعليق من المجالات العصبية الصغيرة، والتعبير بشكل متجانس عن البروتين الفلورسنت الأحمر ("السيطرة" عينة) أو لا ("اختبار" عينة). داخل هذه المجالات العصبية، وانتقال ^{MTAPT EGFP} نشطة تقتصر على أقلية من الخلايا (الخلايا العصبية ما بعد الميتاتيك) وصامتة في الغالبية منهم (تكاثر السلائف) (الشكل3).

2. إعداد الأدوات الجراحية ومنطقة العمليات

إعداد إبر البورسليكات
1. استخدم الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ذات القطر الخارجي والداخلي التي تساوي 1.5 مم و1.12 مم على التوالي.
2. سحب الشعرية مع P 1000 puller.
3. إعداد برنامج السحب. معلمات البرنامج النموذجية هي: الحرارة = 614; vel = 60; الوقت = 1; الضغط = 600. يجب تعديلها وفقا لنموذج بكرة ومقاومالتدفئة المستخدمة.
4. وضع الشعرية في أصحاب الساحبة وتشديد لهم.
5. بدء البرنامج واتخاذ اثنين من microcapillaries سحبت.
6. قطع الطرف الشعري باليد، مع مشرط، تحت مجهر مجسم للحصول على طرف بقطر خارجي من ~ 200-250 م.
7. وضع الشعيرات الدموية على الطين النمذجة (على سبيل المثال، البلاستين) الدعم في طبق بيتري مغلقة ونقلها إلى تحت غطاء محرك السيارة.
إعداد غطاء محرك السيارة وإعداد حل تتبع الخلية
1. تنظيف غطاء محرك السيارة تدفق أفقي بعناية وتطهيره باستخدام الإيثانول 70٪.
2. تطهير الألياف البصرية باستخدام الإيثانول 70٪ ووضعها تحت غطاء محرك السيارة.
3. مزيج 10 درجة مئوية من 125 مل EGTA الحل و 10 درجة مئوية من الأخضر السريع لإعداد "حل تتبع الخلية" ووضعها تحت غطاء محرك السيارة.
4. قطع قطع صغيرة (4 سم × 2 سم من الحجم) من مختبر ختم الفيلم لاكتشاف تعليق الخلية.
5. إعداد حل من 1 ملغ / مل الدوكسيسيكلين المعقمة واستنشاقه في حقنة 0.3 مل.
6. قم بتشغيل غطاء محرك السيارة وحافظ على تدفق اللامينار لمدة 20 دقيقة قبل العملية.
تجميع أنبوب الحقن
1. خذ لسان من البلاستيك الصلب، واثنين من أنابيب اللاتكس (كل حوالي 30 سم طويلة) وحامل الشعرية من مجموعة تجميع أنبوب الأسبرين لمعايرة الماصات microcapillary.
2. إصلاح الفم من البلاستيك الصلب إلى نهاية واحدة من أنبوب اللاتكس.
3. إصلاح حامل الشعرية إلى نهاية واحدة من أنبوب اللاتكس آخر.
4. قم بتوصيل الأطراف الحرة من أنبوبي اللاتكس بفلتر معقم بـ 0.45 ميكرومتر، كحاجز ضد جراثيم المشغل.
5. وضع الجمعية أنبوب الأسبرين الناتجة على حامل الطين النمذجة ليتم الاحتفاظ بها تحت غطاء محرك السيارة.

3. مزيج الخلايا وزرع داخل البطين

خلط "اختبار" و "التحكم" المسابح الفرعية للخلايا الخضراء
1. جمع "اختبار" و "السيطرة" المجالات العصبية (انظر الخطوة 1.2.5) في أنابيب منفصلة 1.5 مل.
2. تعليق المجالات العصبية الطرد المركزي في 200 غرام لمدة 5 دقائق.
3. جمع وتجاهل supernatant، وتجنب اضطراب بيليه الخلية.
4. بلطف إعادة تعليق المجالات العصبية في 500 درجة مئوية من 1X PBS.
5. الطرد المركزي لهم في 200 غرام لمدة 1 دقيقة.
6. إزالة supernatant.
7. كرر الخطوات 3-1-4-3-1.6 مرتين إضافيتين.
8. بلطف إعادة تعليق المجالات في 200 درجة مئوية من 2X التربسين الحل (2X تريبسين، 1X PBS) وبيليه خلية ماصة صعودا وهبوطا 4X-5X.
  ملاحظة: إيلاء الاهتمام عدم جعل فقاعات الهواء.
9. اترك الخلايا في الحاضنة لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لتحقيق تعليق خلية واحدة.
10. كتلة تريبسين مع 200 ميكرولتر من محلول مثبطات التربسين (DMEM-F12، 10 ميكروغرام / مل DNAse I، 0.28 ملغ / مل مثبطات التربسين) عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 4X-5X.
11. خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقها في 1 مل من المتوسطة التكاثرية الطازجة (DMEM-F12، 1X Glutamax، 1X N2، 1 ملغ / مل BSA، 0.6٪ الجلوكوز، 2 ميكروغرام / مل الهيبارين، 20 نانوغرام / مل bFGF، 20 نانوغرام / مل EGF، 1X القلم العقد، 10 pg /mL amphotericin B).
12. عد خلايا المسابح مع طريقة استبعاد التريبان الأزرق في غرفة Bürker.
13. ضبط تركيزها إلى 100،000 خلية / ميكرولتر في وسط التكاثر.
14. مزيج 1:1 "اختبار" الخلايا مع تلك "التحكم".
15. تحقق من المزيج الناتج تحت المجهر الفلوري (التكبير الموضوعي: 10X) للتأكد من أن المزيج هو تعليق خلية واحدة من اثنين من حمامات (الشكل3C).
16. ضع المزيج على الجليد تحت غطاء محرك السيارة.
زرع داخل البطين
1. إعداد القفص مع الأم والجرو P0 على طاولة بعيدة عن منطقة المشغل الجراحية.
2. وضع قفص الانتعاش على عربة قريبة من غطاء محرك السيارة.
3. وضع خليط من نشارة الخشب مأخوذة من قفص الأم في الجزء السفلي من قفص الانتعاش ووضعها تحت مصباح.
4. وبصرف النظر، وضع مربع الجليد مغطاة رقائق الألومنيوم للتخدير من الجرو P0.
5. قبل الزرع مباشرة، أضف 1/10 حجم محلول تتبع الخلايا (من الخطوة 2.2.3) إلى حجم 1 من تعليق الخلايا (من الخطوة 3.1.16) وبقعة 3 ميكرولتر من "مزيج الحقن" الناتج على قطعة من فيلم ختم المختبر.
6. وضع الجرو على رقائق الألومنيوم بارد لمدة 1 دقيقة وتأكد من أنه يتم التخدير تماما.
  ملاحظة: لتأكيد التخدير، اضغط برفق مخلب ومراقبة الجرو لعدم وجود الحركات، في حين لا يزال التنفس.
7. وفي الوقت نفسه، يستنشق 3 ميكرولتر من مزيج الحقن (من الخطوة 3.2.5) في الشعرية الزجاجية.
8. مسح بلطف رأس الجرو التخدير مع الإيثانول 70٪.
9. ضع ذقن الجرو على طرف الألياف البصرية لتحديد نصفي الكرة القشرية بوضوح.
  ملاحظة: في P0-P1، جلد الرأس رقيقة جدا، مما يسمح لتحديد البصرية مباشرة من نصفي الكرة الأرضية فقط فوق مقلة العين وخلف المصابيح الشمية.
10. الحفاظ على الشعرية (محملة كما هو موضح في الخطوة 3.2.7) في أي من اثنين من الطائرات المتوسطة الطفيلية (اليسار أو اليمين)، فوق لمبة الشم، وثقب جلد الجبين عند تقاطعها مع الطائرة الأمامية التي تحتوي على مراكز مقلة العين. إيلاء الاهتمام لعدم تلف الأوعية الدموية. أدخل الشعرية في القشرة الأمامية والوصول إلى تجويف البطين (الشكل4A).
11. لمنع الضرر العرضي للسماحة العقدية، تدوير الإبرة أفقيا من قبل 30 درجة، مشيرا إلى طرفها caudal-medial-وارد (الشكل4B).
12. حقن بلطف الخلايا في تجويف البطين ورصد انتشارها عن طريق الأخضر السريع (الشكل4C).
13. انتظر 5-10 s.
14. إزالة إبرة الزجاج مع الحرص على عدم استنشاق تعليق الخلية وتجاهلها في سلة التخلص المناسبة.
15. قبل تعافي الجرو من التخدير حقن 150 درجة مئوية من محلول الدوكسيسيكلين داخل الصفاق للحفاظ على التعبير عبر الجينات لا يزال خارج بعد زرع.
16. بعد الحقن، ضع الجرو مباشرة تحت المصباح للتعافي.
17. ترك الجرو تحت المصباح لمدة 5-10 دقيقة، ومرة واحدة مستيقظا تماما، ووضعها في القفص مع الأم.
18. مراقبة الجرو تعمل لمدة 2-3 ح، لضمان أن الأم تقبل لهم.
19. تزويد القفص بمياه الشرب التي تحتوي على 0.5 ملغ / مل دوكسيسيكلين و 50 غرام / لتر السكروز للحفاظ على التعبير عبر الجينات قبالة.
20. استبدال المياه التي تحتوي على الدوكسيسيكلين بالماء الخالي من الدوكسي بعد 4 أيام من زرعها، وبالتالي تفعيل الترانسجين في الخلايا العصبية ما بعد السيتوتيك. إبقاء الفئران في نظام خال من الدوكسي لمدة 6 أيام وقتلهم في P10 عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها قطع الرأس.

4. تحليل العقول المزروعة

علم الأنسجة والفلورة المناعية
1. قتل الجراء المزروعة بعد 10 أيام من زرع الخلايا عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بقطع الرأس. إصلاح العقول من الجرو القتل الرحيم في 4٪ بارافورماللديهايد (PFA) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  تحذير: PFA هو شديد السمية; التعامل معها بعناية، والامتثال بدقة مع وصفات الشركة المصنعة، تحت غطاء الدخان الكيميائية؛ تجاهل حل PFA المتبقية في حاوية النفايات المسمى.
2. إزالة الحل PFA واستبداله مع 30٪ محلول السكروز.
3. ترك العقول في 4 درجة مئوية أو حتى تغرق في قاع القارورة.
4. نقل العقول إلى قالب تضمين المتاح ما يقرب من نصف مليئة مع وسيطة التبريد إدراج.
5. تجميد العقول المدرجة في -80 درجة مئوية.
6. قطع 60 ميكرومتر أقسام الإكليل سميكة باستخدام cryostat.
  ملاحظة: تجنب استخدام أقسام أرق، لأن هذا قد يؤدي إلى فقدان غير مقبول للمعلومات المتعلقة بالبنية الكاملة للخلايا العصبية واحدة.
7. أقسام عملية للمناعة^18،^19،باستخدام المضادة لGFP [1:400] ومكافحة RFP (mCherry) [1:500] الأجسام المضادة. نوى مضادة للبقع مع 1 ملغ / مل DAPI الحل [1:200].
موربهومتري
1. تعيين معلمات العمل من المجهر البؤري على النحو التالي: z-كومة الارتفاع = 40 ميكرومتر؛ الخطوة = 2 ميكرومتر.
2. جمع الصور من شرائح المناعية اختيار GFP حقول التصوير العصبية الإيجابية الغنية بالخلايا العصبية، أعمى من توزيع إشارة RFP.
3. تصدير الصور كملفات .nd2.
4. إنشاء إسقاطات Z القصوى منها كملفات .tiff (الشكل5A).
5. للسماح للهيكل العظمي الخلايا العصبية دون التسلسل أعمى للخلايا النمط الجيني، إخفاء الإشارة الحمراء. للقيام بذلك، افتح كل ملف .tiff بواسطة برنامج مناسب وإضافة طبقة ضبط. حدد "المستويات"، "الأحمر"، ثم قم بتعيين "الإخراج" إلى الصفر. حفظ الملف على هذا النحو.
  ملاحظة: يتم تنفيذ الهيكل العظمي لاحقاً بواسطة عامل تشغيل جديد لم يكن لديه حق الوصول السابق إلى الملفات الحمراء عادي الأصلي.
6. لكل ملف أحمر مخفي، أضف طبقة رسم إلى الصورة الأساسية وحدد أداة القلم الرصاص (اللون الأبيض). تتبع سوما على أساس إشارة GFP، ثم تتبع النيورايتات.
  ملاحظة: قد يتم تعيين أداة قلم رصاص في 40 بكسل للسوما وثلاثة بكسل للنيورايت.
7. حفظ ملف متعدد الطبقات بما في ذلك الصور الظلية العصبية (الشكل5B).
  ملاحظة: يمكن إجراء التحليل اللاحق للهيكل العظمي العصبي من قبل أي من المشغلين.
8. إنشاء ملف رمادي 1024 × 1024 16 بت مع خلفية سوداء، واحد لكل خلية عصبية.
9. نسخ ولصق الصور الظلية العصبية واحدة من الصورة الأساسية إلى ملف تدرج الرمادي الجديد. العودة إلى ملف متعدد الطبقات وإيقاف طبقة التكيف للكشف عن الأنماط الجينية العصبية. حفظ ملف تدرج الرمادي 16-بت على حد ّ مُعلّم النمط الجيني العصبي المطابق.
10. استيراد الصور الرمادية في ImageJ واحدا تلو الآخر وتحليل الهياكل العظمية من قبل NeurphologyJ البرنامج المساعد من برنامج ImageJ²⁰ (الشكل5C).
11. نسخ NeurphologyJ البيانات الأولية(neurite_length, attachment_points ونقاط النهاية;لكل منها، تأخذ قيم "المساحة الإجمالية")، لصقها في جدول بيانات وتوظيفها لحساب المعلمات المورفولومترية الثانوية ( متوسط طول النيورايت، مؤشر المتفرعة) (الشكل 5D).

النتائج

وهناك خمس مجموعات بيانات أولية توفر معلومات مفيدة عن الجوانب الرئيسية للإجراء، أولها (1) كفاءة انتقال السلائف العصبية ونقلها بصورة مشتركة بواسطة ناقلات الفيروسات اللينة. (2) مثال على السمات الرئيسية للمروّجين الذين استخدموا لقيادة "جين الاختبار". (3) مثال على الخلايا المهن...

Discussion

وجوانب/خطوات محددة من هذا الإجراء حاسمة وتتطلب اهتماما خاصا. أولاً، (أ) يجب أن يكون المشغلون مدربين مسبقاً بشكل كاف ٍ للتعامل بأمان مع الفيروسات اللينة في بيئة مختبر متوافقة مع BSL-2. ثانيا، (ب) قبل خلط "اختبار" و "السيطرة" الاستعدادات العصبية، فإنه من الإلزامي لغسل بعناية اثنين من تعليق المحيط...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونشكر مين دوك دو على إسهامه في الإعداد المبكر لهذا الإجراء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL syringe	BD	320840	store at RT
0.45 μm sterile filter	Millex-HV	SLHU033RS	store at RT
12 multiwell plate	Falcon	353043	store at RT
1X PBS	Gibco	14190-094	store at RT
24 multiwell plate	Falcon	351147	store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416	Tebubio	GTX13970	store at -20 °C
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839	Antibodies Online	ABIN334653	store at -20 °C
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773	Covance	MMS-435P	store at -20 °C
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA	store at RT
Blue light lamp	Nightsea	BLS2	store at RT
Borosilicate capillaries	Kwik-Fil	TW150-4	store at RT
BSA	Sigma	A9647	store at -20 °C
Bürker chamber	Sigma	BR719520	0.0025 mm², 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik)	Bio-Optica	05-9801	store at RT
DAPI	Sigma	D9542	store at -20 °C
Disposable embedding mold	Bio-Optica	07MP7070	store at RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	store at +4 °C
Dnase I	Roche	10104159001	store at -20 °C
Doxycicline	Sigma	D1822	store at -20 °C
Dumont forceps #3c	Fine Science Tools	11231-20	store at RT
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-20	store at RT
EGF	Gibco	PHG0311	store at -20 °C
EGTA	Sigma	E3889	store at RT
FGF	Gibco	PHG0261	store at -20 °C
Fine scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	store at RT
Fungizone (Amphotericin B)	Gibco	15290018	store at -20 °C
Glucose	Sigma	G8270	store at RT
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488	Invitrogen	A11039	store at -20 °C
Goat anti-rat Alexa 594	Invitrogen	A11007	store at -20 °C
Heparin Solution	Stem Cell Technologies	07980	store at -20 °C
N2 Supplement	Gibco	17502048	store at -20 °C
Optical fibers	Leica	CLS150X
P1000 puller	Sutter Instruments	P-1000 model
Parafilm	Bemis	PM-996	store at RT
Pen Strep	Sigma	P0781	store at -20 °C
Petri dish	Falcon	353003	store at RT
PFA	Sigma	158127	store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	store at -20 °C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Scalpel	Braun	BB515	store at RT
Steromicroscope	Leica	MZ6	store at RT
Trypan blue	Gibco	15250-061	store at RT
Trypsin	Gibco	15400-054	store at -20 °C
Trypsin inhibitor	Sigma	T6522	store at -20 °C

References

Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
. . NeurphologyJ Manual. , (2012).
Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: