Внутрижелудочковая трансплантация инженерных нейронных прекурсоров для исследований нейроархитектуры In Vivo

Резюме

На основе in vitro лентивирной инженерии нейрональных прекурсоров, их совместной трансплантации в мозг дикого типа и парной морфометрической оценки "тест" и "контроль" производных, этот метод позволяет точное моделирование in vivo генного контроля неокортикальных морфология нейронов в простой и доступный способ.

Аннотация

Генное управление нейрональной цитоархитектуры в настоящее время является предметом интенсивного исследования. Описан простой метод, разработанный для изучения виво-генного контроля неокортикальной проекционной морфологии нейронов. Этот метод основан на (1) in vitro lentiviral engineering нейрональных прекурсоров как "тест" и "контроль" клетки, (2) их совместной трансплантации в мозг дикого типа, и (3) парной морфометрической оценки их нейрональных производных. В частности, для этой цели используются прекурсоры E12.5 pallial от паннейрональных, генетически помеченных доноров. Они разработаны, чтобы воспользоваться выбранными промоутеров и тетон / OFF технологии, и они свободной руки трансплантированы в неонатальных боковых желудочков. Позже, при иммунофлуоресценцическом профилировании мозга реципиента, силуэты пересаженных нейронов подаются в программное обеспечение с открытым исходным кодом NeurphologyJ, извлекаются их морфометрические параметры, рассчитывается средняя длина и индекс ветвления. По сравнению с другими методами, этот предлагает три основных преимущества: он позволяет достичь тонкого контроля трансгенного экспрессии по доступным ценам, он требует только базовых хирургических навыков, и он обеспечивает статистически надежные результаты при анализе ограниченного животных. Из-за своей конструкции, однако, это не является адекватным для решения не клеток автономного контроля нейроархитектуры. Кроме того, он должен быть предпочтительно использовать для исследования контроля невритной морфологии после завершения миграции нейронов. В своей нынешней формулировке, этот метод изысканно настроен для исследования генного контроля глутаматергической неокортикальной архитектуры нейронов. Воспользовавшись трансгенными линиями, выражающими EGFP в других конкретных типах нейронных клеток, его можно перепрофилировать для решения проблемы генного контроля их архитектуры.

Введение

Здесь мы описываем простой метод, который мы разработали для вскрытия виво генного контроля нейрональной цитоархитектуры. На основе интроинженерии нейронных прекурсоров, их трансплантации в неонатальный мозг и парной морфометрической оценки "тест" и "контроль" клеток, это позволяет раскрыть функциональные последствия тестовых генов в тонком контроле нейрональной морфологии в быстрый и доступный способ. Для изучения виво-генного контроля нейронной архитектуры необходимо решить три ключевых технических вопроса: (1) достижение адекватно узорчатого выражения гена интересов (GOI) и точного количественного контроля над ним; (2) получение правильно сегментированной визуализации различных нейрональных силуэтов; (3) получение статистической значимости результатов при использовании ограниченного числа животных.

При наличии, мыши мутант линий укрывательство тетрациклин (тет) контролируемых трансгенов может быть лучшим инструментом для решения первого вопроса¹. Кроме того, может быть использован соматический трансгенез. В таких случаях трансген доставляется через электропорацию² или вирусную трансдукцию^3. Далее, он сохраняется в качестве эписома (например, при стандартной электропорации^4),или он интегрируется в геном (случайно, через ретровирусную интегразу⁵; или в определенном месте, через CRISPR-раскрученная гомологическая рекомбинация (SLENDR)⁶ ).

Во-вторых, визуализация нейрональных силуэтов может быть достигнута с помощью а) разреженной равномерной маркировки или b) плотной дифференциальной маркировки. Что касается разреженной маркировки, передовые Golgi-подобные методологии могут быть использованы⁷, выбранные нейрональные минисеты могут быть заполнены биоцитина⁸, и соль и перец маркировки могут быть получены благодаря редко выраженный трансген. Такой трансген может отображать пеструю транскрипцию (Thy-EGFP)⁹ или может быть активирован стохастической рекомбинацией (MORF)¹⁰. Что касается b), современные стратегии включают Cre-опосредованной стохастической рекомбинации в мульти-флоксированный флюоропротеин трансген массива (Brainbow)¹¹, а также поросенокBac-транспозаса инициативе геномной интеграции генопротеитов, ранее осуществляется через соматический трансгенез (CLoNE)¹².

Что касается третьего вопроса, то на морфометрический исход часто влияет большая случайная изменчивость, возникающая из межживотных различий и непредвиденных обстоятельств в клеточных инъекциях. Из-за этого, большое количество животных, как правило, используется для достижения статистической мощности, необходимой для оценки ГОИ морфометрической активности.

Описанные ранее подходы часто опираются на передовые технические навыки и требуют заметных финансовых ресурсов, которые могут ограничить их распространение в научном сообществе. Чтобы обойти эти проблемы, мы задумали простой и простой трубопровод для вскрытия генного контроля нейроархитектуры in vivo быстрым и доступным способом. Это вдохновлено аналогичной конструкцией совместной трансплантации, ранее разработанной для быстрой оценки виво антибластной трансгенной активности^13.

В частности, считается, что совместное трансплантации in vitro инженерии "зеленых" нейронных прекурсоров ("тест" и "контроль" клетки) в "черный" получатель неонатального мозга может одновременно исправить три ключевых вопросов, перечисленных выше. В самом деле, in vitro лентивирной инженерии прекурсоров, в хорошо контролируемых условиях, позволяет поддержание изменчивости нейрональной трансгенной экспрессии, как минимум, гораздо ниже, что обычно связано с in vivo соматические манипуляции (выполненные ранее ^{14 Год , 15} и в наших неопубликованных результатах). В результате точный контроль экспрессии генов сопоставим с тем, что достигается тет-контролируемыми трансгенными моделями. Однако затраты на эту процедуру значительно ниже затрат, связанных с обслуживанием трансгенной линии мыши. Далее, инъекция клеток свободной руки проста и требует минимальной подготовки. Кроме того, количество помеченных прекурсоров, вводимых в каждый мозг, может быть легко настроено для достижения достаточного совокупного числа малораспределенных прекурсоров, сохраняя при этом общее число пересаженных животных на минимальном уровне. И последнее, но не менее, совместное введение по-разному флюоро-маркированных, "тест" и "контроль" прекурсоров и последующий парный статистический анализ результатов противодействовать воздействию межживотных экспериментальной изменчивости, что позволяет достичь статистической значимости результатов, даже при анализе ограниченного числа лиц¹³.

Следует подчеркнуть, что, хотя и быстро и дешево, этот метод имеет два основных ограничения. Во-первых, он предназначен для исследования клеточного автономного генного контроля нейронной архитектуры, и не подходит для решения проблемы экологического контроля. Во-вторых, по мере того, как трансплантированные нейронные прекурсоры достигают своего конечного места по гетерохроническому графику, этот метод предпочтительнее моделировать нейроархитектуру управления, происходящие в прошлом завершении миграции.

протокол

Все методы и процедуры, описанные здесь, были одобрены SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).

1. Поколение инженерных "зеленых" бассейнов-прародителей

1. Подготовка «зеленого» бассейна
   1. Mate дикого типа CD1 женщины с Mtapt^{EGFP / »} основатель¹⁶. Эвтаназия беременной плотины путем вывиха шейки матки в 12,5 дней после coitum (день 0 определяется вагинальной пробки инспекции) и урожай эмбрионального дня 12,5 (E12.5) эмбрионов. Установите их в отдельные скважины 24 многоцветной пластины в холодном растворе PBS.
   2. Быстрый генотип эмбрионов путем визуального осмотра под голубой лампой света, проверка на выброс зеленой флуоресценции в мозге.
   3. Поместите "зеленые" эмбрионы в 10 см диаметром Петри блюдо заполнены холодной 1x PBS с 0,6% глюкозы и передать его под стереомикроскоп.
   4. Вырежьте головы эмбриона с помощью стандартных ножниц и извлеките из них теленефалион с помощью #3 и #5 щипцы.
   5. Разделите две теленцефалические пузырьки и расчлените неокортики с помощью щипцы; убедитесь, что удалить гиппокампа и базальных ганглиев¹⁷.
   6. Соберите неокортики, переведя их с пипеткой P1000 в трубку 1,5 мл, хранящейся на льду.
   7. Пусть расчлененные неокортики оседают на дно трубки.
   8. Аспирируй супернатант как можно больше.
   9. Приостановить действие неокортиков в 400 л свежей пролиферативной среды «DMEM-F12», 1x Glutamax, 1X N2, 1 мг/мл булбумистого сыворотки крупного рогатого скота (BSA), 0,6% глюкозы, 2 мкг/мл гепарина, 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 1X pen-strep, и 10 пг/мл амфотерицин БЗ.
   10. Аккуратно пипетка неокортики вверх и вниз, последовательно с P1000, P200, и P20 советы, 4x на кончик, чтобы получить облачной подвески клеток.
       ПРИМЕЧАНИЕ: E12.5 неокортикальной ткани очень мягкий; отмежевание его от одиночных клеток не требует ферментативного пищеварения на всех; повторное пайпеттинг достаточно.
   11. Пусть оранжереи и остаточные неокортикальные комки оседают на 2 мин.
   12. Передача 150 л из верхней части клеточной подвески (в основном содержащей одиночные клетки) в новую стерильную трубку 1,5 мл.
   13. Добавьте 150 л свежей пролиферативной среды и повторите шаги 1.1.10-1.1.12 до тех пор, пока не будут видны больше сгустков тканей. При этом, опустить P1000 трубач шаг (в шаге 1.1.10).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Три итерации шагов 1.1.10-1.1.12 обычно достаточны для достижения полной диссоциации тканей.
   14. Подсчитайте клетки ("зеленый" бассейн) с методом исключения трипан синего исключения в камере Бюркер¹⁷ и добавьте свежую пролиферативную среду, чтобы настроить концентрацию до 10³ ячеек/ЗЛ.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1.7-1.1.14 должны выполняться под стерильным ламинарным капотом, продезинфицированным 70% этанолом и проветриваемым в течение не менее 20 мин.
2. Проектирование «зеленых» подпулов
   1. Разделите «зеленый» бассейн на два подбассейна на две различные трубки мощностью 1,5 мл для лентивирусной инфекции.
   2. Заразить субпулы самостоятельно с двумя выделенными лентивирными смесями. Каждая смесь содержит вирус «красная этикетка» (Pgk1'mCherry) или «черный» вирус (pCAG-lac) в качестве элемента контроля, а также вирусы для выражения тетоффа(Pgk1p'ttTA и TRE'transgene) или контроль (Pgk1p-tTA и TRE-PLAP).
      ВНИМАНИЕ: Манипулировать лентивирусами в среде BLS-2 со всеми защитными измерениями, предписанными применимыми правилами и законами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый лентивирус должен вводиться при множественности инфекции (MOI) 8, которая (как ранее показано¹⁴⁾достаточно, чтобы преобразовать подавляющее большинство нервных клеток в таких экспериментальных условиях (Рисунок 1). Лентивирус укрывательство tet трансактиваторов может быть построен путем использования различных нейрональных промоутеров вождения tTA / rtTA выражение (например, pT,1, pSyn, pCaMKII, pGAD1 и т.д.) (Рисунок 2). МВД представляет собой соотношение а) количества инфекционных вирусных частиц, доставленных в b) число их целевых клеток. Здесь, первый (а) рассчитывается в соответствии с обычной процедурой, описанной в другом месте¹⁴, последний (б) просто оценивается с помощью камеры Бюркер.
   3. Плита 600000 клеток каждого инфицированного суббассейна на скважину 12 многокровной пластины, в 600 л размножающейся среды с 2 мкг/мл доксициклина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь колодцы не обрабатываются полилизином, который предотвращает привязанность нервных клеток к их днищам.
   4. Перенесите клетки в инкубатор в 5% CO₂ при 37 градусах Цельсия.
   5. Через 2 дня, чтобы оценить эффективность инфекции и дифференциальную маркировку инженерных бассейнов, осмотрите клетки под обычным флуоресцентным микроскопом. Два подбассейна должны отображаться как суспензии малых нейросфер, однородно выражающие красный флуоресцентный белок ("контрольный" образец) или нет ("тест" образца). В этих нейросферах, Mtapt^EGFP трансгена активна ограничивается меньшинством клеток (пост-митотических нейронов) и молчать в большинстве из них (пролиферации прекурсоров) (Рисунок 3).

2. Настройка хирургических инструментов и операционной зоны

1. Подготовка боросиликатных игл
   1. Используйте боросиликатные стеклянные капилляры с внешним и внутренним диаметром, равными 1,5 мм и 1,12 мм соответственно.
   2. Потяните капилляр с p 1000 шкив.
   3. Настройка программы потянув. Типичные параметры программы: тепло No 614; vel 60; время No 1; давление 600. Они должны быть отрегулированы в соответствии с моделью шкива и применяемым противопотопительным реипулатором.
   4. Поместите капилляр в держатели шкива и затяните их.
   5. Запустите программу и возьмите два вытащил микрокапилляров.
   6. Вырезать капиллярный кончик вручную, скальпелем, под стереомикроскоп, чтобы получить наконечник с внешним диаметром 200-250 мкм.
   7. Поместите капилляры на глиняную глину (например, пластилин) в закрытом блюде Петри и перенесите ее под капотом.
2. Настройка капота и подготовка решения для трассировщика ячеек
   1. Тщательно очистите капот горизонтального потока и дезинфицируйте его с помощью 70% этанола.
   2. Дезинфекция оптических волокон с использованием 70% этанола и поместить их под капотом.
   3. Смешайте 10 юл 125 мМ EGTA раствор и 10 л быстрого зеленого, чтобы подготовить "решение для ячеечного трассировщика" и поместить его под капот.
   4. Вырезать мелкие кусочки (4 см х 2 см размера) лабораторной пленки герметизации для клеточной подвески пятнистости.
   5. Приготовьте раствор стерильного доксициклина 1 мг/мл и сагите его в шприц 0,3 мл.
   6. Включите капот и держите ламинарный поток на 20 минут до операции.
3. Сборка трубки для инъекций
   1. Возьмите жесткий пластиковый мундштук, две латексные трубки (каждый около 30 см в длину) и капиллярный держатель из комплекта сборки трубки аспиратора для откалиброванных микрокапиллярных пипетки.
   2. Закрепите жесткий пластиковый мундштук на одном конце латексной трубки.
   3. Закрепите держатель капилляра на одном конце другой латексной трубки.
   4. Соедините свободные концы двух латексных трубок с стерильным фильтром 0,45 мкм в качестве барьера против микробов оператора.
   5. Поместите полученную сборку трубки аспиратора на держатель глины для моделирования, который будет храниться под капотом.

3. Клеточное сочетание и внутрижелудочковая трансплантация

1. Смешивание "тест" и "контроль" зеленых клеток подпулы
   1. Сбор "тест" и "контроль" нейросфер (см. шаг 1.2.5) в отдельных 1,5 мл труб.
   2. Центрифуга нейросферы подвески на 200 г в течение 5 мин.
   3. Соберите и отбросьте супернатант, избегая нарушения клеточных гранул.
   4. Аккуратно повторно притяжать нейросферы в 500 Л 1x PBS.
   5. Центрифуге их на 200 г в течение 1 мин.
   6. Удалите супернатант.
   7. Повторите шаги 3.1.4-3.1.6 еще два раза.
   8. Аккуратно resuspend сферы в 200 Зл 2x трипсин раствор (2x трипсин, 1x PBS) и пипетки клеток гранулы вверх и вниз 4x-5x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, чтобы не сделать пузырьки воздуха.
   9. Оставьте клетки в инкубаторе в течение 5 мин при 37 градусах по Цельсию для достижения одноклеточной подвески.
   10. Блок трипсин с 200 л раствора ингибитора трипсина (DMEM-F12, 10 мкг/мл DNAse I, 0,28 мг/мл трипсин ингибитор) путем pipetting вверх и вниз 4x-5x.
   11. Клетки центрифуги при 200 х г в течение 5 мин и повторно притяжают их в 1 мл свежей пролиферативной среды (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 мг/мл BSA, 0,6% глюкозы, 2 мкг/мл гепарина, 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мЛ EGF, 1x pen-strep, 10 пг/мл амфотерицин B).
   12. Подсчитайте ячейки двух бассейнов с методом исключения trypan blue в камере Бюркера.
   13. Отрегулируйте их концентрацию до 100 000 клеток/Л в пролиферативной среде.
   14. Смешайте 1:1 "тест" клетки с "контрольными" из них.
   15. Проверьте полученную смесь под флуоресцентным микроскопом (объективное увеличение: 10x), чтобы убедиться, что смесь представляет собой одноклеточную подвеску двух бассейнов(рисунок 3C).
   16. Поместите смесь на лед под капотом.
2. Внутрижелудочковая трансплантация
   1. Подготовка клетки с матерью и P0 щенки на столе далеко от хирургического оператора области.
   2. Поместите клетку восстановления на тележку рядом с капотом.
   3. Положите смесь опилок, взятых из клетки матери на дно клетки восстановления и поместите его под лампу.
   4. Кроме того, установите ледяную коробку, покрытую алюминиевой фольгой, для анестезии p0 щенков.
   5. Незадолго до трансплантации добавьте 1/10 объема клеточного трассирующего раствора (от шага 2.2.3) к 1 тому клеточной подвески (от ступени 3.1.16) и наместе 3 злицы полученной «инъекционной смеси» на кусок лабораторной герметичной пленки.
   6. Поместите щенка на холодную алюминиевую фольгу на 1 мин и убедитесь, что он полностью обезожжен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить анестезию, аккуратно сжать лапу и контролировать щенка за отсутствием движений, в то же время дыхание.
   7. Между тем, аспирируйте смесь впрыска 3 зЛ (от шага 3.2.5) в стеклянную капиллярную капиллярию.
   8. Аккуратно протрите голову обезболиваемого щенка 70% этанола.
   9. Поместите подбородок щенка на кончик оптического волокна, чтобы четко определить корковых полушарий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На P0-P1, кожа головы очень тонкая, что позволяет для прямой визуальной идентификации полушарий чуть выше глазных яблок и за обонятельные луковицы.
   10. Держите капилляр (загруженный, как описано в шаге 3.2.7) в одном из двух среднепарасагиттальных плоскостей (слева или справа), над обонятельной лампой, и проколить кожу лба на ее пересечении с лобной плоскостью, содержащей центры глазных яблок. Обратите внимание, чтобы не повредить кровеносные сосуды. Введите капилляр в лобную кору и доступ к полости желудочков(рисунок 4A).
   11. Для предотвращения случайного повреждения ганглияского преосвященства, поверните иглу боково на 30 градусов, указывая на ее кончик каудально-медиаль-палате(рисунок 4B).
   12. Аккуратно впрысните клетки в желудочковую полость и следите за их диффузией с помощью fast Green(рисунок 4C).
   13. Подождите 5-10 с.
   14. Удалите стеклянную иглу, заботясь, чтобы не аспирировать клеточной подвески и выбросить его в подходящий мусорный бак.
   15. Перед восстановлением щенка после анестезии вводят 150 Л доксициклинового раствора интраперитоне, чтобы сохранить трансгенное выражение еще после трансплантации.
   16. После инъекции поместите щенка сразу под лампу для выздоровления.
   17. Оставьте щенков под лампой на 5-10 минут и, как только полностью проснуться, поместите их в клетку с матерью.
   18. Наблюдайте за оперированными щенками в течение 2-3 ч, чтобы убедиться, что мать принимает их.
   19. Поставка клетки с питьевой водой, содержащей 0,5 мг /мл доксициклина и 50 г / l сахарозы для поддержания трансгенного экспрессии.
   20. Замените доксициклинсодержащие воды докси-свободной водой через 4 дня после трансплантации, тем самым активируя трансген в постмитотических нейронах. Держите мышей в режиме, свободном от докси, в течение 6 дней и эвтаназии их на P10 путем вдыхания углекислого газа с последующим обезглавливанием.

4. Анализ пересаженных мозгов

1. Гистология и иммунофлуоресценция
   1. Эвтаназия пересаженных щенков через 10 дней после пересадки клеток путем вдыхания углекислого газа с последующим обезглавливанием. Исправить мозг эвтанированных щенков в 4% параформальдегида (PFA) на 4 градуса Цельсия в одночасье.
      ВНИМАНИЕ: ПФА является высокотоксичным; обращаться с ним с осторожностью, строго соблюдая предписания производителя, под химическим капотом дыма; отбросить раствор PFA, остаточный в маркированном контейнере для отходов.
   2. Удалите раствор PFA и замените его 30% сахарозным раствором.
   3. Оставьте мозги при 4 градусах Цельсия или пока они не опустятся на дно флакона.
   4. Передача мозгов в одноразовые встраивания формы примерно наполовину заполнены крио-включения среды.
   5. Заморозить включенные мозги при -80 градусов по Цельсию.
   6. Вырезать 60 мкм толщиной корональных секций с помощью криостата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования более тонких секций, так как это может привести к неприемлемой потере информации о всей архитектуре одиночных нейронов.
   7. Обработка разделов для иммунофлуоресценции^18,19, с использованием анти-GFP (1:400) и анти-RFP (mCherry) антитела. Противостопотоловые ядра с 1 мг/мл DAPI раствором 1:200.
2. Морфаметрия
   1. Установить рабочие параметры конфокального микроскопа следующим образом: z-stack высота - 40 мкм; шаг 2 мкм.
   2. Соберите фотографии иммуноанализированных ломтиков, выбирающих положительные нейронные полеи, богатые нейронами, слепые распределения сигналов RFP.
   3. Экспорт изображений как файлы .nd2.
   4. Создание максимальных s-проекций из них как .tiff файлов(рисунок 5A).
   5. Чтобы обеспечить субпоследовательный нейрональной скелетизации слепой к клеткам генотип, скрыть красный сигнал. Для этого откройте каждый файл .tiff подходящим программным обеспечением и добавьте коррективный слой. Выберите "уровни", "красный", а затем установите "выход" до нуля. Сохранить файл как таковой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скелетизация впоследствии выполняется новым оператором, который не имел предыдущего доступа к оригинальным простым красным файлам.
   6. Для каждого скрытого красного файла добавьте слой чертежа к основному изображению и выберите инструмент для карандаша (белый цвет). Проследите сому на основе сигнала GFP, а затем проследите невриты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: карандашный инструмент может быть установлен на 40 пикселей для сомы и на трех пикселях для невритов.
   7. Сохранить многослойный файл, включая нейронные силуэты(рисунок 5B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последующий анализ нейронального скелета может быть выполнен любым оператором.
   8. Создайте новый 1024 x 1024 16-битный серый файл с черным фоном, по одному на нейрон.
   9. Копировать и вставить одиночные нейрональные силуэты от основного изображения до нового серого файла. Вернитесь к многослойному файлу и выключите корректироворовый слой, чтобы раскрыть нейрональные генотипы. Сохраните 16-битный серый файл, аннотируя соответствующий нейрональный генотип.
   10. Импорт серых изображений в ImageJ один за другим и анализ скелетов по NeurphologyJ плагин программного обеспечения ImageJ²⁰ (Рисунок 5C).
   11. Копировать первичные данные NeurphologyJ(нейритнаядлина, вложения и конечные точки;для каждого, возьмите значения "Общая площадь"), вставьте их в электронную таблицу и нанимите их для вычисления вторичных морфометрических параметров ( средняя длина неврита, индекс ветвления) (рисунок5D).

Результаты

Существует пять первичных наборов данных, предоставляющих полезную информацию о ключевых аспектах процедуры, первый из которых (1) эффективность трансдукции нейронных прекурсоров и ко-трансдукции с помощью лентивирных векторов. (2) Пример ключевых особенностей промо?...

Обсуждение

Конкретные аспекты/шаги этой процедуры имеют решающее значение и требуют особого внимания. Во-первых, а) операторы должны быть надлежащим образом подготовлены к безопасному манипулированию лентивирусами в лабораторной среде, соответствующей требованиям BSL-2. Во-вторых, b) до смешивания...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL syringe	BD	320840	store at RT
0.45 μm sterile filter	Millex-HV	SLHU033RS	store at RT
12 multiwell plate	Falcon	353043	store at RT
1X PBS	Gibco	14190-094	store at RT
24 multiwell plate	Falcon	351147	store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416	Tebubio	GTX13970	store at -20 °C
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839	Antibodies Online	ABIN334653	store at -20 °C
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773	Covance	MMS-435P	store at -20 °C
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA	store at RT
Blue light lamp	Nightsea	BLS2	store at RT
Borosilicate capillaries	Kwik-Fil	TW150-4	store at RT
BSA	Sigma	A9647	store at -20 °C
Bürker chamber	Sigma	BR719520	0.0025 mm2, 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik)	Bio-Optica	05-9801	store at RT
DAPI	Sigma	D9542	store at -20 °C
Disposable embedding mold	Bio-Optica	07MP7070	store at RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	store at +4 °C
Dnase I	Roche	10104159001	store at -20 °C
Doxycicline	Sigma	D1822	store at -20 °C
Dumont forceps #3c	Fine Science Tools	11231-20	store at RT
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-20	store at RT
EGF	Gibco	PHG0311	store at -20 °C
EGTA	Sigma	E3889	store at RT
FGF	Gibco	PHG0261	store at -20 °C
Fine scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	store at RT
Fungizone (Amphotericin B)	Gibco	15290018	store at -20 °C
Glucose	Sigma	G8270	store at RT
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488	Invitrogen	A11039	store at -20 °C
Goat anti-rat Alexa 594	Invitrogen	A11007	store at -20 °C
Heparin Solution	Stem Cell Technologies	07980	store at -20 °C
N2 Supplement	Gibco	17502048	store at -20 °C
Optical fibers	Leica	CLS150X
P1000 puller	Sutter Instruments	P-1000 model
Parafilm	Bemis	PM-996	store at RT
Pen Strep	Sigma	P0781	store at -20 °C
Petri dish	Falcon	353003	store at RT
PFA	Sigma	158127	store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	store at -20 °C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Scalpel	Braun	BB515	store at RT
Steromicroscope	Leica	MZ6	store at RT
Trypan blue	Gibco	15250-061	store at RT
Trypsin	Gibco	15400-054	store at -20 °C
Trypsin inhibitor	Sigma	T6522	store at -20 °C