Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Resumo

Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de "teste" e "controle", este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.

Resumo

O controle do gene da Citoarquitetura neuronal é atualmente o assunto da investigação intensiva. Descrito aqui é um método simples desenvolvido para estudar o controle genético in vivo da morfologia do neurônio da projeção neokortikalny. Este método é baseado em (1) Engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais como células de "teste" e "controle", (2) seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e (3) avaliação morfométrica pareada de seus derivados neuronais. Especificamente, os precursores paliais E 12.5 dos doadores panneuronal, geneticamente rotulados, são empregados para este fim. São projetados para tirar proveito dos promotores selecionados e da tecnologia tetON/OFF, e são transplantados à mão livre em ventrículos laterais neonatais. Mais tarde, após a criação de perfil de imunofluorescência de cérebros destinatários, silhuetas de neurônios transplantados são alimentados em software de código aberto NeurphologyJ, seus parâmetros morfométricos são extraídos, e o comprimento médio e índice de ramificação são calculados. Comparado a outros métodos, este oferece três vantagens principais: permite conseguir do controle fino da expressão do transgene a custos disponíveis, ele exige somente habilidades cirúrgicas básicas, e fornece resultados estatisticamente confiáveis em cima da análise de um limitado número de animais. Por causa de seu projeto, entretanto, não é adequado endereçar o controle não Cell-Autonomous do neuroarchitecture. Além disso, deve ser usado preferencialmente para investigar o controle da morfologia do neurite após a conclusão da migração neuronal. Em sua formulação atual, este método é afinado primorosamente para investigar o controle do gene da arquitetura neokortikalny glutamatérgico do neurônio. Aproveitando-se de linhas transgênicas expressando EGFP em outros tipos específicos de células neurais, pode ser re-purposed para abordar o controle genético de sua arquitetura.

Introdução

Aqui nós descrevemos um método simples que nós desenvolvemos para dissecar in vivo o controle do gene da Citoarquitetura neuronal. Com base na engenharia in vitro de precursores neuronais, seu transplante em cérebro neonatal e avaliação morfométrica pareada de células de "teste" e "controle", permite desvendar as implicações funcionais dos genes de teste no controle fino da morfologia neuronal em um forma rápida e acessível. Para investigar o controle genético in vivo da arquitetura neuronal, três questões técnicas fundamentais devem ser abordadas: (1) alcançar uma expressão de gene-de-interesse (GOI) adequadamente padronizada e um controle quantitativo exato da mesma; (2) obtenção de uma visualização segmentada adequada de silhuetas neuronais distintas; (3) elicitar a significância estatística dos resultados, empregando um número limitado de animais.

Quando disponível, as linhas mutantes do rato que abriam transgenes controlados do tetraciclina (Tet) podem ser a melhor ferramenta para endereçar a primeira edição¹. Alternativamente, a transgênese somática pode ser empregada. Nesses casos, o transgene é entregado através do Electroporation² ou da transdução viral³. Em seguida, é mantido como um episome (por exemplo, em cima do Electroporation padrão⁴), ou está integrado no genoma (aleatòria, através da integrase retroviral⁵; ou em uma posição definida, através do recombinação homous-promovido crispr (slendr)⁶ ).

Em segundo lugar, a visualização da silhueta neuronal pode ser conseguida através de (a) rotulagem uniforme esparsa ou (b) rotulagem diferencial densa. Quanto à rotulagem esparsa, as metodologias avançadas do tipo Golgi podem ser empregadas⁷, minisets neuronais selecionados podem ser preenchidos por biocitina⁸, e a rotulagem de sal e pimenta pode ser obtida graças a um transgene escassamente expresso. Tal transgene pode exibir a transcrição variegada (thy-EGFP)⁹ ou pode ser ativada por recombinação estocástica (Morf)¹⁰. Quanto a (b), as estratégias de estado de arte incluem recombinação estocástica mediada por CRE dentro de uma matriz de transgenes de fluoroproteína multifloxed (Brainbow)¹¹, bem como a integração genômica guiada por piggyBac-transposase de genes de fluoroproteína, anteriormente entregues via transgénese somática (CLoNE)¹².

Quanto à terceira questão, o desfecho morfométrico é freqüentemente afetado por uma grande variabilidade aleatória, originando-se de diferenças entre animais e contingências de injeção celular. Devido a isso, um grande número de animais geralmente é empregado para atingir o poder estatístico necessário para avaliar a atividade morfométrica GOI.

As abordagens anteriormente descritas freqüentemente dependem de habilidades técnicas avançadas e exigem recursos financeiros evidentes, o que pode limitar sua difusão dentro da comunidade científica. Para contornar essas questões, concebemos um pipeline fácil e direto para dissecar o controle genético da neuroarquitetura in vivo de forma rápida e acessível. Isto é inspirado por um projeto similar do cotransplante desenvolvido previamente para a avaliação in vivo rápida da atividade a¹³do transgene.

Especificamente, pensa-se que o cotransplante de in vitro projetado "verde" precursores neurais ("teste" e "controle" células) em um "preto" receptor neonatal cérebro pode simultaneamente corrigir as três principais questões listadas acima. De fato, a engenharia lentivirais in vitro de precursores, em condições bem controladas, permite a manutenção da variabilidade da expressão neuronal transgênica no mínimo, muito abaixo do que geralmente está associado com manipulações somáticas in vivo (realizadas anteriormente ¹⁴ anos de ^{, 15} e em nossos resultados inéditos). O controle exato resultante da expressão gênica é comparável com o obtido por modelos transgênicos controlados por Tet. No entanto, os custos deste procedimento são muito inferiores àqueles provenientes da manutenção de uma linha de rato transgénica. Em seguida, a injeção livre da pilha da mão é fácil e exige o treinamento mínimo. Além disso, a quantidade de precursores rotulados injetado em cada cérebro pode ser facilmente ajustada para alcançar um número cumulativo suficiente de precursores esparsamente distribuídos, ao mesmo tempo que mantém o número total de animais transplantados no mínimo. Por último, mas não menos importante, a coinjeção de precursores de "teste" e "controle" de forma diferente, com rótulo de fluoro, e posterior análise estatística pareada dos resultados neutram os efeitos da variabilidade experimental interanimal, permitindo o alcance de significância estatística dos resultados, mesmo após a análise de um número limitado de indivíduos¹³.

Ressalta-se que, embora rápido e barato, esse método tem duas limitações principais. Primeiramente, é projetada investigar o controle Cell-Autonomous do gene da arquitetura neuronal, e não é apropriado endereçar o controle ambiental. Em segundo lugar, como precursores neuronais transplantados chegar a sua localização final por um cronograma heterocrônico, este método é preferível para modelar neuroarchitectonics controle ocorrendo após a conclusão da migração.

Protocolo

Todos os métodos e procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo SISSA organismo preposto Al Benessere animale (SISSA IACUC).

1. geração de pools de progenitor "verdes" projetados

1. Preparação da piscina "verde"
   1. Mate uma fêmea CD1 de tipo selvagem com um fundador do Mtapt^{EGFP/+ 16}. Eutanizar a represa grávida por luxação cervical em 12,5 dias após o coitum (o dia 0 é determinado pela inspeção de plugue vaginal) e colher os embriões embrionários do dia 12,5 (E 12.5). Ajuste-os em poços individuais de uma placa de 24 na solução fria de PBS.
   2. Rapidamente genótipo os embriões por inspeção visual uma lâmpada de luz azul, verificando a emissão de fluorescência verde no cérebro.
   3. Coloc os embriões verdes em um prato de Petri do diâmetro de 10 cm enchido com o frio 1X PBS com 0,6% glicose e transfira-o a um stereomicroscope.
   4. Corte as cabeças do embrião usando a tesoura padrão e extraia o telencéfalo deles por meio de #3 e #5 fórceps.
   5. Separe as duas vesículas telencefálica e dissecar os neocortices usando fórceps; Certifique-se de remover o hipocampo e os gânglios basais¹⁷.
   6. Colete os neocortices transferindo-os com uma pipeta P1000 em um tubo de 1,5 mL mantido no gelo.
   7. Deixe os neocortices dissecados estabelecir-se à parte inferior do tubo.
   8. Aspirar o sobrenadante, tanto quanto possível.
   9. Resuspend os neocortices em 400 μL do meio proliferative fresco [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA), 0,6% de glicose, 2 μg/mL de heparina, 20 ng/mL fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), 1X caneta-strep, e 10 pg/mL de anfotericina B].
   10. Gentilmente pipeta os neocortices para cima e para baixo, seqüencialmente com P1000, P200, e P20 dicas, 4x por ponta, para obter uma suspensão de células nebulosos.
       Nota: o tecido neokortikalny e 12.5 é muito macio; dissociando-se a células individuais não requer digestão enzimática em todos os; a pipetagem repetida é suficiente.
   11. Deixe que as meninges e os aglomerados neokortikalny residuais se acalmem por 2 min.
   12. Transferir 150 μL do topo da suspensão celular (principalmente contendo células individuais) para um novo tubo estéril de 1,5 mL.
   13. Adicione 150 μL de meio proliferativo fresco e repita as etapas 1.1.10-1.1.12 até que não mais aglomerantes de tecido sejam evidentes. Ao fazer isso, omita a etapa de pipetagem P1000 (na etapa 1.1.10).
       Nota: três iteração das etapas 1.1.10-1.1.12 são geralmente suficientes para conseguir a dissociação cheia do tecido.
   14. Células de contagem (piscina "verde") com o método de exclusão azul de Tripan em uma câmara de Bürker¹⁷ e adicionar meio proliferativo fresco para ajustar a concentração para 10³ células/μl.
       Nota: as etapas 1.1.7-1.1.14 devem ser executadas uma capa de fluxo laminar estéril desinfectada pelo etanol 70% e mantida ventilada por pelo menos 20 minutos.
2. Engenharia das subpiscinas "verdes"
   1. Subdivida a associação "verde" em duas subpools em dois tubos distintos de 1,5 ml para a infecção lentivirais.
   2. Infecte as subpiscinas de forma independente com as duas misturas lentivirais dedicadas. Cada mistura contém "Red Label" vírus (Pgk1_mCherry) ou "Black" vírus (pCAG_lacZ) como um controle, bem como vírus para tetOFF conduzido transgene (Pgk1p_tTA e TRE_transgene) ou controle (Pgk1p_tTA e TRE_PLAP) expressão.
      Cuidado: manipule Lentivirus em um ambiente BLS-2 com todas as medidas protetoras prescritas pelas regras e leis aplicáveis.
      Nota: cada Lentivirus deve ser administrado em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 8, que (como mostrado anteriormente¹⁴) é suficiente para transduce a grande maioria das células neurais nessas condições experimentais (Figura 1). O Lentivirus abrigando os ativadores do Tet pode ser construído empregando os promotores neuronal diferentes que conduzem a expressão de TTA/rtta (por exemplo, ptα1, psyn, pcamkii, pGAD1, etc.) (Figura 2). O MOI é a proporção de (a) o número de partículas virais infecciosas entregues a (b) o número de suas células-alvo. Aqui, o primeiro (a) é calculado de acordo com o procedimento convencional descrito em outro lugar¹⁴, o último (b) é simplesmente avaliado usando uma câmara de Bürker.
   3. Placas 600.000 células de cada subpool infectado por poço de 12 placas multipoços, em 600 μL de meio proliferativo com 2 μg/mL de doxiciclina.
      Nota: aqui, os poços não são pré-tratados com poli-lisina, o que impede a fixação de células neurais em suas partes inferiores.
   4. Transfira as células para a incubadora em 5% CO₂ a 37 ° c.
   5. Após 2 dias, para avaliar a eficiência da infecção e a marcação diferencial das piscinas projetadas, inspecione as células um microscópio fluorescente convencional. As duas subpiscinas devem aparecer como suspensões de pequenas neuroesferas, homogeneamente expressando a proteína fluorescente vermelha (amostra de "controle") ou não (amostra de "teste"). Dentro dessas neuroesferas, o transgene Mtapt^EGFP é ativo limitado a uma minoria de células (neurônios pós-mitóticos) e silencioso na maioria deles (proliferating precursores) (Figura 3).

2. criação dos instrumentos cirúrgicos e da área de operação

1. Preparando agulhas de borosilicato
   1. Utilize os capilares de vidro de borosilicato com diâmetro externo e interno igualando 1,5 mm e 1,12 mm, respectivamente.
   2. Puxe o capilar com um extrator P 1000.
   3. Configurar o programa de puxar. Os parâmetros típicos do programa são: Heat = 614; vel = 60; tempo = 1; pressão = 600. Devem ser ajustados de acordo com o modelo do extrator e o resistor de aquecimento empregado.
   4. Coloque o capilar nos suportes de puxador e aperte-os.
   5. Inicie o programa e tome os dois microcapilares puxados.
   6. Cortar a ponta capilar à mão, com um bisturi, o estereomicroscópio para obter uma ponta com um diâmetro externo de ~ 200-250 μm.
   7. Coloque os capilares em uma argila de modelagem (por exemplo, plasticina) suporte em um prato de Petri fechado e transferi-lo para debaixo do capô.
2. Configurando o capô e preparando a solução de traçador de células
   1. Limpe a capa de fluxo horizontal com cuidado e Desinfecte-a usando 70% de etanol.
   2. Desinfete fibras ópticas usando 70% de etanol e coloque-as o capô.
   3. Misture 10 μL de solução de 125 mM EGTA e 10 μL de verde rápido para preparar a solução de traçador de células e coloque-a o capô.
   4. Corte pedaços pequenos (4 cm x 2 cm de tamanho) de película de vedação de laboratório para detecção de suspensão celular.
   5. Prepare uma solução de doxiciclina estéril de 1 mg/mL e aspire-a numa seringa de 0,3 mL.
   6. Ligue a capota e mantenha o fluxo laminar ligado durante 20 minutos antes da operação.
3. Montagem do tubo de injecção
   1. Pegue um bocal de plástico duro, dois tubos de látex (cada um com cerca de 30 cm de comprimento) e um suporte capilar de um kit de montagem de tubo aspirador para pipetas microcapilares calibradas.
   2. Fixe o bocal de plástico duro numa extremidade de um tubo de látex.
   3. Fixar o suporte capilar a uma extremidade de outro tubo de látex.
   4. Conecte as extremidades livres dos dois tubos de látex com um filtro estéril de 0,45 μm, como uma barreira contra os germes do operador.
   5. Coloc o conjunto resultante do tubo do aspirador em um suporte de modelagem da argila a ser mantido a capa.

3. mistura celular e transplante intraventricular

1. Misturando "teste" e "controle" sub-pools de células verdes
   1. Colete as neuroesferas "teste" e "controle" (ver etapa 1.2.5) em tubos separados de 1,5 mL.
   2. Suspensão de neuroesferas centrífuga a 200 g por 5 min.
   3. Recolher e descartar o sobrenadante, evitando a perturbação do pellet celular.
   4. Suspender suavemente as neuroesferas em 500 μL de 1X PBS.
   5. Centrifugue-os a 200 g durante 1 min.
   6. Retire o sobrenadante.
   7. Repita os passos 3.1.4-3.1.6 mais duas vezes.
   8. Reressuscite as esferas em 200 μL de solução de tripsina 2x (2x tripsina, 1X PBS) e a pelota da pilha da pipeta acima e para baixo 4x-5x.
      Nota: Preste atenção para não fazer bolhas de ar.
   9. Deixe as pilhas na incubadora por 5 minutos em 37 ° c para conseguir uma suspensão da único-pilha.
   10. Tripsina de bloco com 200 μL de solução de inibidor de tripsina (DMEM-F12, 10 μg/mL de DNAse I, inibidor da tripsina 0,28 mg/mL) pipetando para cima e para baixo 4x-5x.
   11. Células centrífugas a 200 x g durante 5 min e ressuscitem-nas em 1 ml de meio proliferativo fresco (DMEM-F12, 1x glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glicose, 2 μg/ml heparina, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 1x caneta-strep, 10 PG/ml anfotericina B).
   12. Contagem de células das duas piscinas com Tripan método de exclusão azul em uma câmara de Bürker.
   13. Ajuste a sua concentração para 100.000 células/μL em meio proliferativo.
   14. Misture 1:1 "teste" células com "controle" queridos.
   15. Verifique a mistura resultante um microscópio de fluorescência (ampliação objetiva: 10x) para garantir que a mistura é uma suspensão de uma única célula das duas piscinas (Figura 3C).
   16. Coloque a mistura no gelo o capô.
2. Transplante intraventricular
   1. Prepare a gaiola com a mãe e os filhotes P0 em uma tabela Faraway da área pós-operatório cirúrgica.
   2. Coloque uma gaiola de recuperação em um carrinho perto do capô.
   3. Coloque uma mistura de serragem retirado da gaiola da mãe na parte inferior da gaiola de recuperação e colocá-lo uma lâmpada.
   4. Além disso, defina uma caixa de gelo coberta por uma folha de alumínio para a anestesia de PUPs P0.
   5. Pouco antes da transplantação, adicione 1/10 volume da solução do Tracer da pilha (da etapa 2.2.3) a 1 volume de suspensão da pilha (da etapa 3.1.16) e do ponto 3 μL da mistura resultante da "injeção" em uma parte de película de selagem do laboratório.
   6. Coloque o filhote na folha de alumínio fria por 1 min e verifique se ele está totalmente anestesiado.
      Nota: para confirmar a anestesia, aperte suavemente uma pata e monitore o filhote por falta de movimentos, enquanto ainda respira.
   7. Enquanto isso, aspirar o 3 μL de mistura de injeção (a partir do passo 3.2.5) para o capilar de vidro.
   8. Limpe suavemente a cabeça do filhote anestesiado com 70% de etanol.
   9. Coloque o queixo do filhote na ponta da fibra óptica para identificar claramente os hemisférios corticais.
      Nota: em P0-P1, a pele da cabeça é muito fina, permitindo a identificação visual direta dos hemisférios logo acima dos globos oculares e atrás dos bulbos olfactory.
   10. Mantenha o capilar (carregado como descrito na etapa 3.2.7) em qualquer um dos dois planos de meio parasagittal (esquerda ou direita), acima do bulbo olfativo, e perfure a pele da testa em sua interseção com o plano frontal contendo os centros oculares. Preste atenção para não danificar os vasos sanguíneos. Entrar o capilar no córtex frontal e acessar a cavidade ventricular (figura 4a).
   11. Para evitar danos acidentais da Eminência gangliónica, gire a agulha lateralmente em 30 graus, apontando sua ponta caudal-medial-Ward (Figura 4B).
   12. Injete suavemente as células na cavidade ventricular e monitore sua difusão por meio de fast Green (Figura 4C).
   13. Aguarde 5-10 s.
   14. Retire a agulha de vidro, tomando cuidado para não aspirar a suspensão da célula e descartá-la em um compartimento de descarte adequado.
   15. Antes que a recuperação do filhote da anestesia injete 150 μl da solução do doxiciclina via intraperitoneal para manter a expressão do transgene ainda fora após a transplantação.
   16. Após a injeção, coloque o filhote imediatamente a lâmpada para a recuperação.
   17. Deixe os filhotes a lâmpada por 5-10 min e, uma vez totalmente acordado, coloque-os na gaiola com a mãe.
   18. Observe os filhotes operados para 2-3 h, para garantir que a mãe aceita-los.
   19. Fornecer a gaiola com água potável contendo 0,5 mg/mL de doxiciclina e 50 g/L de sacarose para manter a expressão transgênica fora.
   20. Substitua a água Doxycycline-contendo pela água Doxy-livre 4 dias após a transplantação, assim ativando o transgene em neurônios borne-mitotic. Mantenha os ratos em um regime Doxy-livre por 6 dias e eutanize-os no P10 pela inalação do dióxido de carbono seguida pela decapitação.

4. análise de cérebros transplantados

1. Histologia e imunofluorescência
   1. Eutanizar os filhotes transplantados 10 dias após a transplantação da pilha pela inalação do dióxido de carbono seguida pela decapitação. Corrigir cérebros de filhotes eutanasiados em 4% paraformaldeído (PFA) a 4 ° c durante a noite.
      Atenção: a PFA é altamente tóxica; Manuseie com cuidado, cumprindo rigorosamente as prescrições do fabricante, uma capa de fumaça química; descartar a solução de PFA residual em um recipiente de resíduos rotulado.
   2. Retire a solução de PFA e substitua-a por uma solução de sacarose a 30%.
   3. Deixe o cérebro a 4 ° c ou até que eles afundam na parte inferior do frasco.
   4. Transfira os cérebros em um molde de incorporação descartável aproximadamente metade-enchido com o meio da Cryo-inclusão.
   5. Congele os cérebros incluídos em-80 ° c.
   6. Corte 60 μm cortes coronais grossos usando um criostat.
      Nota: Evite empregar seções mais finas, pois isso pode resultar em perda inaceitável de informações sobre toda a arquitetura de neurônios únicos.
   7. Seções do processo para a imunofluorescência^18,19, usando anticorpos do anti-GFP [1:400] e do anti-RFP (mcherry) [1:500]. Núcleos de contratura com solução DAPI de 1 mg/mL [1:200].
2. Morfometria
   1. Defina os parâmetros de trabalho do microscópio confocal da seguinte forma: z-Stack Height = 40 μm; Passo = 2 μm.
   2. Colete imagens de fatias imunoensaiadas selecionando campos fotográficos ricos em Neuron GFP positivos, cegos de distribuição de sinal RFP.
   3. Exporte as imagens como arquivos. ND2.
   4. Gere as projeções Z máximas deles como arquivos. TIFF (Figura 5a).
   5. Para permitir a esqueletização neuronal subsequencial cega ao genótipo das células, oculte o sinal vermelho. Para fazer isso, abra cada arquivo. TIFF por um software adequado e adicione uma camada de ajuste. Selecione "níveis", "vermelho", em seguida, defina "saída" para zero. Guarde o ficheiro como tal.
      Observação: a esqueletização é posteriormente executada por um novo operador que não tinha acesso prévio a arquivos originais de vermelho simples.
   6. Para cada arquivo vermelho oculto, adicione uma camada de desenho à imagem principal e selecione a ferramenta lápis (cor branca). Trace o soma com base no sinal de GFP, a seguir Trace os neurites.
      Nota: a ferramenta lápis pode ser ajustada em 40 pixéis para o soma e em três pixéis para neurites.
   7. Salve o arquivo multicamada, incluindo silhuetas neuronais (Figura 5b).
      Nota: a análise subseqüente do esqueleto neuronal pode ser executada por um ou outro operador.
   8. Crie um novo arquivo de escala de cinza de 1024 x 1024 16 bits com fundo preto, um por Neuron.
   9. Copie e cole silhuetas neuronais únicas da imagem principal para o novo arquivo de escala de cinza. Volte para o arquivo multicamada e desligue a camada de ajuste para desvendar genótipos neuronais. Salve o arquivo de escala de cinza de 16 bits anotando o genótipo neuronal correspondente.
   10. Importe imagens em tons de cinza no ImageJ um por um e analise esqueletos pelo plugin NeurphologyJ do software ImageJ²⁰ (Figura 5C).
   11. Copie os dados primários do NeurphologyJ (neurite_length, attachment_points e Endpoints; para cada um, tome os valores de "área total"), Cole-os em uma planilha e empregue-os para calcular parâmetros morfométricos secundários ( comprimento médio de neurite, índice de ramificação) (Figura 5D).

Resultados

Há cinco conjuntos de dados primários que fornecem informações úteis sobre os principais aspectos do procedimento, sendo a primeira (1) eficiência da transdução de precursores neurais e a cotransdução por vetores lentivirais. (2) um exemplo de características-chave dos promotores empregados para conduzir o "gene de teste". (3) um exemplo de células de engenharia prontas para transplante. (4) uns desenhos animados que incluem detalhes processuais chaves da microinjeção da pil...

Discussão

Aspectos específicos/etapas deste procedimento são críticos e exigem atenção especial. Primeiro, (a) os operadores devem ser adequadamente treinados para manipular com segurança Lentivirus em um ambiente de laboratório compatível com BSL-2. Em segundo lugar, (b) antes de misturar "teste" e "controle" preparações neurais, é obrigatório lavar cuidadosamente as duas suspensões de neuroesfera correspondentes, como descrito, a fim de evitar qualquer atraso na infecção cruzada das duas preparações devido a Len...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL syringe	BD	320840	store at RT
0.45 μm sterile filter	Millex-HV	SLHU033RS	store at RT
12 multiwell plate	Falcon	353043	store at RT
1X PBS	Gibco	14190-094	store at RT
24 multiwell plate	Falcon	351147	store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416	Tebubio	GTX13970	store at -20 °C
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839	Antibodies Online	ABIN334653	store at -20 °C
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773	Covance	MMS-435P	store at -20 °C
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA	store at RT
Blue light lamp	Nightsea	BLS2	store at RT
Borosilicate capillaries	Kwik-Fil	TW150-4	store at RT
BSA	Sigma	A9647	store at -20 °C
Bürker chamber	Sigma	BR719520	0.0025 mm2, 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik)	Bio-Optica	05-9801	store at RT
DAPI	Sigma	D9542	store at -20 °C
Disposable embedding mold	Bio-Optica	07MP7070	store at RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	store at +4 °C
Dnase I	Roche	10104159001	store at -20 °C
Doxycicline	Sigma	D1822	store at -20 °C
Dumont forceps #3c	Fine Science Tools	11231-20	store at RT
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-20	store at RT
EGF	Gibco	PHG0311	store at -20 °C
EGTA	Sigma	E3889	store at RT
FGF	Gibco	PHG0261	store at -20 °C
Fine scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	store at RT
Fungizone (Amphotericin B)	Gibco	15290018	store at -20 °C
Glucose	Sigma	G8270	store at RT
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488	Invitrogen	A11039	store at -20 °C
Goat anti-rat Alexa 594	Invitrogen	A11007	store at -20 °C
Heparin Solution	Stem Cell Technologies	07980	store at -20 °C
N2 Supplement	Gibco	17502048	store at -20 °C
Optical fibers	Leica	CLS150X
P1000 puller	Sutter Instruments	P-1000 model
Parafilm	Bemis	PM-996	store at RT
Pen Strep	Sigma	P0781	store at -20 °C
Petri dish	Falcon	353003	store at RT
PFA	Sigma	158127	store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	store at -20 °C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Scalpel	Braun	BB515	store at RT
Steromicroscope	Leica	MZ6	store at RT
Trypan blue	Gibco	15250-061	store at RT
Trypsin	Gibco	15400-054	store at -20 °C
Trypsin inhibitor	Sigma	T6522	store at -20 °C