Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Zusammenfassung

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Zusammenfassung

Die Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur wird derzeit intensiv untersucht. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, die entwickelt wurde, um die in vivo Genkontrolle der neokortikalen Projektionsneuronenmorphologie zu untersuchen. Diese Methode basiert auf (1) in vitro lentiviralen Engineering sernischen Vorläufern als "Test"- und "Kontrollzellen", (2) ihrer Co-Transplantation in Wild-Gehirne und (3) gepaarter morphometrischer Auswertung ihrer neuronalen Derivate. Konkret werden dafür E12.5 palliale Vorläufer von panneuronalen, genetisch gekennzeichneten Spendern eingesetzt. Sie sind so konzipiert, dass sie ausgewählte Promotoren und tetON/OFF-Technologie nutzen, und sie werden freihändig in neonatale Querventrikel transplantiert. Später, nach der Immunfluoreszenzprofilierung von Empfängergehirnen, werden Silhouetten transplantierter Neuronen in NeurphologyJ Open Source Software eingespeist, ihre morphometrischen Parameter extrahiert und die durchschnittliche Länge und der Verzweigungsindex berechnet. Im Vergleich zu anderen Methoden bietet diese drei Hauptvorteile: Sie ermöglicht die Erzielung einer feinen Kontrolle der Transgenexpression zu erschwinglichen Kosten, sie erfordert nur grundlegende chirurgische Fähigkeiten und liefert statistisch zuverlässige Ergebnisse bei der Analyse einer begrenzten Anzahl der Tiere. Aufgrund seines Designs reicht es jedoch nicht aus, die nicht zellautonome Kontrolle der Neuroarchitektur zu adressieren. Darüber hinaus sollte es vorzugsweise verwendet werden, um die Kontrolle der Neuritenmorphologie nach Abschluss der neuronalen Migration zu untersuchen. In ihrer gegenwärtigen Formulierung ist diese Methode exquisit abgestimmt, um die Genkontrolle der glutamatergen neokortikalen Neuronenarchitektur zu untersuchen. Unter Ausnutzung transgener Linien, die EGFP in anderen spezifischen neuronalen Zelltypen exemiten, kann es umfunktioniert werden, um die Genkontrolle ihrer Architektur zu adressieren.

Einleitung

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die wir entwickelt haben, um die in vivo Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur zu sezieren. Basierend auf in vitro Engineering von neuronalen Vorläufern, ihre Transplantation in neonatale Gehirn und gepaart morphometrische Bewertung von "Test" und "Kontroll" Zellen, ermöglicht es, funktionelle Auswirkungen von Testgenen in der feinen Kontrolle der neuronalen Morphologie in einem schnell und erschwinglich. Um die In-vivo-Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, müssen drei wichtige technische Fragen angegangen werden: (1) Die Erreichung einer angemessen gemusterten Gen-of-Interest-Expression (GOI) und eine genaue quantitative Kontrolle dieser Expression; (2) Eine korrekt segmentierte Visualisierung unterschiedlicher neuronaler Silhouetten zu erhalten; (3) Statistische Signifikanz der Ergebnisse bei der Verwendung einer begrenzten Anzahl von Tieren.

Wenn verfügbar, können Maus-Mutantenlinien, die Tetracyclin (tet)-gesteuerte Transgene beherbergen, das beste Werkzeug sein, um das erste Problem zu beheben¹. Alternativ kann eine somatische Transgenese eingesetzt werden. In solchen Fällen wird das Transgen über Elektroporation² oder virale Transduktion³geliefert. Als nächstes wird es als Episom (z.B. bei Standardelektroporation⁴) beibehalten oder in das Genom integriert (zufällig über retrovirale Integrase⁵; oder an einem definierten Ort, über CRISPR-geförderte homologe Rekombination (SLENDR)⁶ ).

Zweitens kann die neuronale Silhouettenvisualisierung durch (a) eine spärliche einheitliche Kennzeichnung oder (b) dichte Differentialbeschriftung erreicht werden. Wie für die spärliche Etikettierung können fortschrittliche Golgi-ähnliche Methoden verwendet werden⁷, ausgewählte neuronale Minisets können mit Biocytin⁸gefüllt werden, und Salz-und-Pfeffer-Etikettierung kann dank einer spärlich exprimierenden Transgene erhalten werden. Ein solches Transgen kann eine bunte Transkription (Thy-EGFP)⁹ aufweisen oder durch stochastische Rekombination (MORF) aktiviert werden¹⁰. Was (b) betrifft, so umfassen die modernsten Strategien die cre-vermittelte stochastische Rekombination innerhalb eines multi-floxierten Fluorprotein-Transgen-Arrays (Brainbow)¹¹, sowie die piggyBac-transposase-getriebene genomische Integration von Fluorproteingenen, über somatische Transgenese (CLoNE)¹²geliefert.

Was die dritte Ausgabe betrifft, so wird das morphometrische Ergebnis häufig durch eine große zufällige Variabilität beeinflusst, die auf Unterschiede zwischen den Tieren und Zellinjektionskontingenten beruht. Aus diesem Grund wird in der Regel eine große Anzahl von Tieren eingesetzt, um die statistische Leistung zu erreichen, die für die Bewertung der morphometrischen Aktivität der ausländischen Aktivitäten erforderlich ist.

Die zuvor beschriebenen Ansätze beruhen häufig auf fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten und erfordern auffällige finanzielle Ressourcen, die ihre Verbreitung innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft einschränken können. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine einfache und einfache Pipeline konzipiert, um die Genkontrolle der Neuroarchitektur in vivo schnell und erschwinglich zu sezieren. Dies ist inspiriert von einem ähnlichen Co-Transplantations-Design, das zuvor für die schnelle in vivo-Bewertung der antiblastischen Transgenaktivität¹³entwickelt wurde.

Insbesondere wird angenommen, dass die Co-Transplantation von in vitro entwickelten "grünen" neuronalen Vorläufern ("Test"- und "Kontrollzellen") in ein "schwarzes" neonatales Gehirn gleichzeitig die drei oben aufgeführten Schlüsselprobleme beheben kann. Tatsächlich ermöglicht die in vitro lentivirale Entwicklung von Vorläufern unter gut kontrollierten Bedingungen die Aufrechterhaltung der Variabilität der neuronalen Transgenexpression auf ein Minimum, weit unter dem, das normalerweise mit in vivo somatischen Manipulationen verbunden ist (zuvor durchgeführt ^{14 , 15} und in unseren unveröffentlichten Ergebnissen). Die daraus resultierende genaue Kontrolle der Genexpression ist vergleichbar mit der von tet-kontrollierten transgenen Modellen. Die Kosten dieses Verfahrens liegen jedoch weit unter denen, die aus der Wartung einer transgenen Mauslinie stammen. Als nächstes ist die Freihandinjektion einfach und erfordert minimales Training. Darüber hinaus kann die Menge der in jedes Gehirn injizierten markierten Vorläufer leicht darauf abgestimmt werden, eine ausreichende kumulative Anzahl von dünn verteilten Vorläufern zu erreichen, während gleichzeitig die Gesamtzahl der transplantierten Tiere auf ein Minimum beschränkt bleibt. Last but not least wirken die Co-Injektion unterschiedlich fluormarkierter, "test" und "kontrollierter" Vorläufer und die anschließende paarweise statistische Analyse der Ergebnisse den Auswirkungen der versuchsweisen Variabilität zwischen Dentieren entgegen, die das Erreichen von statistische Signifikanz der Ergebnisse, auch nach der Analyse einer begrenzten Anzahl von Personen¹³.

Es sollte betont werden, dass diese Methode, wenn auch schnell und billig, zwei Hauptbeschränkungen hat. Erstens wurde es entwickelt, um die zellautonome Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, und es ist nicht angemessen, sich mit der Umweltkontrolle zu befassen. Zweitens ist diese Methode, da transplantierte neuronale Vorläufer durch einen heterochronischen Zeitplan ihren endgültigen Standort erreichen, dem Modell der neuroarchitektonischen Kontrolle nach der Migration vorzuziehen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden und Verfahren wurden vom SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC) zugelassen.

1. Erzeugung von "grünen" Vorläuferpools

1. Vorbereitung des "grünen" Pools
   1. Mate eine wilde CD1 Hündin mit einem Mtapt^EGFP/+ Gründer¹⁶. Euthanisieren Sie die schwangere Mutter durch Zervixdislokation bei 12,5 Tagen nach dem Koitum (Tag 0 wird durch vaginale Steckerinspektion bestimmt) und ernten Sie den embryonalen Tag 12.5 (E12.5) Embryonen. Stellen Sie sie in einzelne Brunnen einer 24 Multiwell-Platte in kalter PBS-Lösung ein.
   2. Schnell genotypisieren die Embryonen durch visuelle Inspektion unter einer blauen Lichtlampe, Überprüfung auf grüne Fluoreszenzemission im Gehirn.
   3. Legen Sie die "grünen" Embryonen in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm, gefüllt mit kalten 1x PBS mit 0,6% Glukose, und übertragen Sie sie unter ein Stereomikroskop.
   4. Schneiden Sie die Embryoköpfe mit standardscheren und extrahieren Sie das Telencephalon aus ihnen mittels #3 und #5 Zangen.
   5. Trennen Sie die beiden telenzephalen Vesikel und sezieren Sie die Neokortika mit Zangen; achten Sie darauf, den Hippocampus und die Basalganglien¹⁷zu entfernen.
   6. Sammeln Sie Neokortika, indem Sie sie mit einer P1000 Pipette in ein 1,5 ml Rohr auf Eis gehalten.
   7. Lassen Sie die sezierten Neokortiker auf dem Boden der Röhre absetzen.
   8. Aspirieren Sie den Überstand so viel wie möglich.
   9. Setzen Sie die Neocortice in 400 l frischem proliferativen Medium [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 0,6% Glukose, 2 g/ml Heparin, 20 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 1X Pen-Strep, und 10 pg/ml Amphotericin B].
   10. Die Neokortiker nach oben und unten, sequenziell mit P1000- und P20-Spitzen, 4x pro Spitze, vorsichtig pipette, um eine trübe Zellsuspension zu erhalten.
       HINWEIS: E12.5 neokortikales Gewebe ist sehr weich; Die Dissoziierung an einzelne Zellen erfordert überhaupt keine enzymatische Verdauung; wiederholte Pipettierung ist ausreichend.
   11. Lassen Sie die Meningen und restlichen neokortikalen Klumpen für 2 min absetzen.
   12. Übertragen Sie 150 l von der Oberseite der Zellsuspension (hauptsächlich mit Einzelzellen) in ein neues 1,5 ml steriles Rohr.
   13. Fügen Sie 150 l frisches proliferatives Medium hinzu und wiederholen Sie die Schritte 1.1.10-1.1.12, bis keine Gewebeklumpen mehr sichtbar sind. Lassen Sie dabei den Pipettierschritt P1000 aus (in Schritt 1.1.10).
       HINWEIS: Drei Iterationen der Schritte 1.1.10-1.1.12 reichen in der Regel aus, um eine vollständige Gewebetrennung zu erreichen.
   14. Zählzellen ("grüner" Pool) mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode in einer Bürker-Kammer¹⁷ und frisches proliferatives Medium hinzufügen, um die Konzentration auf 10³ Zellen/L einzustellen.
       HINWEIS: Die Schritte 1.1.7-1.1.14 müssen unter einer sterilen laminaren Durchflusshaube durchgeführt werden, die mit 70 % Ethanol desinfiziert und mindestens 20 min belüftet bleibt.
2. Engineering der "grünen" Subpools
   1. Unterteilen Sie den "grünen" Pool in zwei Unterpools in zwei unterschiedliche 1,5 ml-Röhren für lentivirale Infektionen.
   2. Infizieren Sie die Subpools unabhängig mit den beiden dedizierten lentiviralen Mischungen. Jede Mischung enthält "red label" Virus (Pgk1_mCherry) oder "black" Virus (pCAG_lacZ) als Kontrolle, sowie Viren für tetOFF getriebentransgene (Pgk1p_tTA und TRE_transgene) oder Kontrolle (Pgk1p_tTA und TRE_PLAP) Ausdruck.
      VORSICHT: Manipulieren Sie Lentiviren in einer BLS-2-Umgebung mit allen Schutzmessungen, die in den geltenden Regeln und Gesetzen vorgeschrieben sind.
      HINWEIS: Jedes Lentivirus muss bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 8 verabreicht werden, die (wie zuvor gezeigt¹⁴) ausreichen, um die überwiegende Mehrheit der Nervenzellen unter solchen experimentellen Bedingungen zu transduzieren (Abbildung 1). Das Lentivirus, das Tet-Transaktivatoren beherbergt, kann durch den Einsatz verschiedener neuronaler Promotoren, die die tTA/rtTA-Expression antreiben (z. B. pT-1, pSyn, pCaMKII, pGAD1 usw.), aufgebaut werden. (Abbildung 2). Das MOI ist das Verhältnis von (a) der Anzahl der infektiösen Viruspartikel, die zu (b) der Anzahl ihrer Zielzellen abgegeben werden. Hierbei wird ersteres (a) nach dem an anderer Stelle beschriebenen konventionellen Verfahren berechnet¹⁴, letzteres (b) wird einfach mit einer Bürkerkammer ausgewertet.
   3. Platte 600.000 Zellen jedes infizierten Subpools pro Brunnen einer 12 Mehrwellplatte, in 600 l proliferativem Medium mit 2 g/ml Doxycyclin.
      HINWEIS: Hier werden Brunnen nicht mit Polylysin vorbehandelt, was die Anhaftung von nerventonenförmigen Zellen an ihren Böden verhindert.
   4. Übertragen Sie die Zellen in 5%_CO2 bei 37 °C in den Inkubator.
   5. Nach 2 Tagen, um die Effizienz der Infektion und die Differentialmarkierung der technischen Pools zu bewerten, inspizieren Sie die Zellen unter einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop. Die beiden Unterpools müssen als Suspensionen kleiner Neurosphären erscheinen, die das rote fluoreszierende Protein homogen ausdrücken ("Kontrollprobe") oder nicht ("Test"-Probe). Innerhalb dieser Neurosphären ist das Mtapt EGFP-Transgen auf eine Minderheit von Zellen (post-mitotische Neuronen) beschränkt und in den meisten von ihnen stumm (prolifeierende Vorläufer) (Abbildung3).

2. Einrichtung der chirurgischen Instrumente und des Operationsbereichs

1. Zubereitung von Borosilikatnadeln
   1. Verwenden Sie die Borosilikatglaskapillaren mit Außen- und Innendurchmessern von 1,5 mm bzw. 1,12 mm.
   2. Ziehen Sie die Kapillare mit einem P 1000 Abzieher.
   3. Richten Sie das Ziehprogramm ein. Typische Programmparameter sind: Wärme = 614; vel = 60; Zeit = 1; Druck = 600. Sie müssen entsprechend dem Abziehermodell und dem eingesetzten Heizwiderstand eingestellt werden.
   4. Legen Sie die Kapillare in die Pullerhalter und ziehen Sie sie fest.
   5. Starten Sie das Programm und nehmen Sie die beiden gezogenen Mikrokapillaren.
   6. Schneiden Sie die Kapillarspitze mit einem Skalpell unter dem Stereomikroskop von Hand, um eine Spitze mit einem Außendurchmesser von 200-250 m zu erhalten.
   7. Die Kapillaren auf einen Modellton (z.B. Plastilin) in eine geschlossene Petrischale legen und unter die Haube geben.
2. Einrichten der Haube und Vorbereitung der Zell-Tracer-Lösung
   1. Reinigen Sie die horizontale Durchflusshaube sorgfältig und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol.
   2. Disfizieren Sie optische Fasern mit 70% Ethanol und legen Sie sie unter die Haube.
   3. Mischen Sie 10 l von 125 mM EGTA-Lösung und 10 l Fast Green, um die "Zell-Tracer-Lösung" vorzubereiten und unter die Haube zu legen.
   4. Kleine Stücke (4 cm x 2 cm Größe) von Labor-Dichtungsfolie für Zellsuspensions-Spotting schneiden.
   5. Bereiten Sie eine Lösung von 1 mg/ml sterilem Doxycyclin vor und aspirieren Sie sie in eine 0,3 ml Spritze.
   6. Schalten Sie die Haube ein und halten Sie den laminaren Durchfluss 20 min vor dem Betrieb eingeschaltet.
3. Montage des Injektionsrohres
   1. Nehmen Sie ein Hartplastik-Mundstück, zwei Latexrohre (jeweils ca. 30 cm lang) und einen Kapillarhalter aus einem Aspiratorrohr-Montagesatz für kalibrierte Mikrokapillarpipetten.
   2. Befestigen Sie das Hartplastik-Mundstück an einem Ende eines Latexrohrs.
   3. Befestigen Sie den Kapillarhalter an einem Ende eines anderen Latexrohrs.
   4. Verbinden Sie die freien Enden der beiden Latexröhren mit einem 0,45 m sterilen Filter als Barriere gegen Bedienerkeime.
   5. Legen Sie die resultierende Aspiratorrohranordnung auf einen Modelltonhalter, der unter der Haube aufbewahrt werden soll.

3. Zellmischung und intraventrikuläre Transplantation

1. Mischen von "Test" und "Control" grüner Zell-Unterpools
   1. Sammeln Sie "Test" und "Kontroll" Neurosphären (siehe Schritt 1.2.5) in separaten 1,5 ml Röhren.
   2. Zentrifugen-Neurosphären Suspension bei 200 g für 5 min.
   3. Sammeln und entsorgen Sie den Überstand, um Störungen des Zellpellets zu vermeiden.
   4. Resuspendneurosphären in 500 l von 1x PBS.
   5. Zentrifugieren Sie sie bei 200 g für 1 min.
   6. Entfernen Sie den Überstand.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.4-3.1.6 zwei weitere Male.
   8. Heben Sie Kugeln in 200 l 2x Trypsin-Lösung (2x Trypsin, 1x PBS) und Pipettenzellpellet auf und ab 4x-5x ab.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu machen.
   9. Lassen Sie die Zellen 5 min bei 37 °C im Inkubator, um eine einzellige Suspension zu erreichen.
   10. Blockieren Sie Trypsin mit 200 L Trypsin-Inhibitorlösung (DMEM-F12, 10 g/mL DNAse I, 0,28 mg/ml Trypsin-Inhibitor) durch Pipettieren von 4x-5x.
   11. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min und setzen sie in 1 ml frischem proliferativen Medium (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 mg/mL BSA, 0,6% Glukose, 2 g/ml Heparin, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x Pen-Strep, 10 pg/ml Amphotericin B).
   12. Zählen Sie Zellen der beiden Becken mit Trypanblau-Ausschlussmethode in einer Bürker-Kammer.
   13. Passen Sie ihre Konzentration auf 100.000 Zellen/L in proliferativem Medium an.
   14. Mischen Sie 1:1 "Test"-Zellen mit "Kontrollzellen".
   15. Überprüfen Sie die resultierende Mischung unter einem Fluoreszenzmikroskop (Objektivvergrößerung: 10x), um sicherzustellen, dass es sich bei der Mischung um eine einzellige Suspension der beiden Becken handelt (Abbildung 3C).
   16. Legen Sie die Mischung auf Eis unter der Haube.
2. Intraventrikuläre Transplantation
   1. Bereiten Sie den Käfig mit der Mutter und den P0 Welpen auf einem Tisch weit weg vom chirurgischen Bedienerbereich vor.
   2. Legen Sie einen Bergungskäfig auf einen Wagen in der Nähe der Motorhaube.
   3. Legen Sie eine Mischung aus Sägemehl aus dem Käfig der Mutter auf den Boden des Bergungskäfigs und legen Sie es unter eine Lampe.
   4. Beiseite, stellen Sie eine Eiskiste mit einer Aluminiumfolie für die Anästhesie von P0 Welpen bedeckt.
   5. Kurz vor der Transplantation 1/10 Volumen der Zelltracerlösung (ab Schritt 2.2.3) auf 1 Volumen der Zellsuspension (ab Schritt 3.1.16) und Punkt 3 l des resultierenden "Injektionsmixes" auf einem Stück Labor-Dichtungsfolie hinzufügen.
   6. Legen Sie den Welpen 1 min auf die kühle Aluminiumfolie und überprüfen Sie, ob er vollständig beästhetisiert ist.
      HINWEIS: Um die Anästhesie zu bestätigen, drücken Sie vorsichtig eine Pfote und überwachen Sie den Welpen auf Bewegungsmangel, während Sie noch atmen.
   7. In der Zwischenzeit die 3 l Injektionsmischung (ab Schritt 3.2.5) in die Glaskapillare aspirieren.
   8. Wischen Sie den Kopf des anästhesierten Welpen vorsichtig mit 70% Ethanol ab.
   9. Legen Sie das Kinn des Welpen auf die Spitze der optischen Faser, um die kortikalen Hemisphären eindeutig zu identifizieren.
      HINWEIS: Bei P0-P1 ist die Kopfhaut sehr dünn, was eine einfache visuelle Identifizierung der Hemisphären direkt über den Augäpfeln und hinter den Olfaktor-Lampen ermöglicht.
   10. Bewahren Sie die Kapillare (wie in Schritt 3.2.7 beschrieben) in einer der beiden Mittelparasagittalebenen (links oder rechts) über der Olfaktor-Glühbirne auf und durchstechen Sie die Stirnhaut an ihrer Schnittweite mit der Frontalebene, die die Augäpfelzentrierten enthält. Achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Geben Sie die Kapillare in den frontalen Kortex ein und greifen Sie auf die ventrikuläre Kavität zu (Abbildung 4A).
   11. Um eine versehentliche Beschädigung der Ganglioneneing zu verhindern, drehen Sie die Nadel seitlich um 30 Grad und zeigen ihre Spitze kaudal-medial-ward (Abbildung 4B).
   12. Injizieren Sie die Zellen vorsichtig in die ventrikuläre Höhle und überwachen Sie deren Diffusion mit Fast Green (Abbildung 4C).
   13. Warten Sie 5-10 s.
   14. Entfernen Sie die Glasnadel, um die Zellsuspension nicht zu aspirieren und entsorgen Sie sie in einem geeigneten Entsorgungsbehälter.
   15. Vor der Rückgewinnung des Welpen von der Anästhesie injizieren 150 l Doxycyclinlösung intraperitoneal, um die Transgenexpression nach der Transplantation noch ausschalten zu lassen.
   16. Legen Sie den Welpen nach der Injektion sofort unter die Lampe, um sich zu erholen.
   17. Lassen Sie die Welpen unter der Lampe für 5-10 min und, einmal vollständig wach, legen Sie sie in den Käfig mit der Mutter.
   18. Beobachten Sie die operierten Welpen für 2-3 h, um sicherzustellen, dass die Mutter sie akzeptiert.
   19. Den Käfig mit Trinkwasser zu versorgen, das 0,5 mg/ml Doxycyclin und 50 g/L Saccharose enthält, um die Transgenexpression fern zu halten.
   20. Ersetzen Sie das doxycyclinhaltige Wasser 4 Tage nach der Transplantation durch doxyfreies Wasser und aktivieren Sie so das Transgen in postmitotischen Neuronen. Halten Sie Mäuse 6 Tage lang in einem doxyfreien Regime und einschläfern Sie sie bei P10 durch Kohlendioxid-Inhalation, gefolgt von Enthauptung.

4. Analyse transplantierter Gehirne

1. Histologie und Immunfluoreszenz
   1. Euthanisieren Sie die transplantierten Welpen 10 Tage nach der Zelltransplantation durch Kohlendioxid-Inhalation, gefolgt von Enthauptung. Fix Gehirne von eingeschläferten Welpen in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C über Nacht.
      VORSICHT: PFA ist hochgiftig; mit Sorgfalt, streng nach Herstellervorschriften, unter einer chemischen Rauchhaube zu behandeln; PFA-Lösung restaiiert in einem markierten Abfallbehälter zu entsorgen.
   2. Entfernen Sie die PFA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 30% Saccharoselösung.
   3. Lassen Sie das Gehirn bei 4 °C oder bis sie auf den Durchstechflasche boden sinken.
   4. Übertragen Sie die Gehirne in eine Einweg-Einbettform etwa halb gefüllt mit Kryo-Inklusionsmedium.
   5. Einfrieren der mitgelieferten Gehirne bei -80 °C.
   6. Schneiden Sie 60 'm dicke koronale Abschnitte mit einem Kryostat.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung dünnerer Abschnitte, da dies zu einem inakzeptablen Verlust von Informationen über die gesamte Architektur einzelner Neuronen führen kann.
   7. Prozessabschnitte für Immunfluoreszenz^18,19, mit Anti-GFP [1:400] und Anti-RFP (mCherry) [1:500] Antikörper. Counterstain-Kerne mit 1 mg/ml DAPI-Lösung [1:200].
2. Morphometrie
   1. Einstellen der Arbeitsparameter des konfokalen Mikroskops wie folgt: Z-Stack-Höhe = 40 m; Schritt = 2 m.
   2. Sammeln Sie Bilder von immunoassayed Scheiben Auswahl GFP positive neuronreiche fotografische Felder, blind von RFP-Signalverteilung.
   3. Exportieren Sie die Bilder als .nd2-Dateien.
   4. Generieren Sie maximale Z-Projektionen von ihnen als .tiff-Dateien (Abbildung 5A).
   5. Um eine subsesequenzielle neuronale Skelettierung zu ermöglichen, die blind für den Zellgenotyp ist, blenden Sie das rote Signal aus. Öffnen Sie dazu jede .tiff-Datei mit einer geeigneten Software, und fügen Sie eine Anpassungsschicht hinzu. Wählen Sie "levels", "red", dann setzen Sie "Output" auf Null. Speichern Sie die Datei als solche.
      HINWEIS: Die Skelettierung wird anschließend von einem neuen Operator durchgeführt, der zuvor keinen Zugriff auf originale rote Dateien hatte.
   6. Fügen Sie für jede ausgeblendete rote Datei dem primären Bild eine Zeichnungsebene hinzu, und wählen Sie das Bleistiftwerkzeug (weiße Farbe). Verfolgen Sie das Soma auf der Grundlage des GFP-Signals, und verfolgen Sie dann die Neuriten.
      HINWEIS: Das Bleistiftwerkzeug kann für das Soma auf 40 Pixel und für Neuriten auf drei Pixel eingestellt werden.
   7. Speichern Sie die mehrschichtige Datei einschließlich neuronaler Silhouetten (Abbildung 5B).
      HINWEIS: Die anschließende Analyse des neuronalen Skeletts kann von beiden Operatoren durchgeführt werden.
   8. Erstellen Sie eine neue 1024 x 1024 16-Bit-Graustufendatei mit schwarzem Hintergrund, eine pro Neuron.
   9. Kopieren und fügen Sie einzelne neuronale Silhouetten aus dem primären Bild in die neue Graustufendatei ein. Kehren Sie zur Mehrschichtdatei zurück und schalten Sie die Einstellungsschicht aus, um neuronale Genotypen zu enthüllen. Speichern Sie die 16-Bit-Graustufendatei mit Anmerkungen zum entsprechenden neuronalen Genotyp.
   10. Importieren Sie Graustufenbilder in ImageJ nacheinander und analysieren Sie Skelette von NeurphologyJ Plugin der ImageJ-Software²⁰ (Abbildung 5C).
   11. Kopieren Sie NeurphologyJ-Primärdaten (neurit_length, attachment_points und endpoints; für jeden nehmen Sie "Gesamtfläche"-Werte), fügen Sie sie in eine Kalkulationstabelle ein und verwenden Sie sie, um sekundäre morphometrische Parameter zu berechnen ( durchschnittliche Neuritenlänge, Verzweigungsindex) (Abbildung 5D).

Ergebnisse

Es gibt fünf primäre Datensätze, die nützliche Informationen über schlüsselwichtige Aspekte des Verfahrens liefern, wobei der erste (1) die Effizienz der transdiven Neuronater-Vorläufertransduktion und Co-Transduktion durch lentivirale Vektoren ist. (2) Ein Beispiel für die wichtigsten Merkmale der Promotor, die für den Antrieb des "Testgens" eingesetzt werden. (3) Ein Beispiel für vermehrt transplantierte technische Zellen. (4) Eine Karikatur mit wichtigen Verfahrensdetails der...

Diskussion

Spezifische Aspekte/Schritte dieses Verfahrens sind von entscheidender Bedeutung und erfordern besondere Aufmerksamkeit. Erstens müssen (a) die Bediener ausreichend vortrainiert sein, um Lentiviren in einer BSL-2-kompatiblen Laborumgebung sicher zu manipulieren. Zweitens, b) vor dem Mischen von "Test" und "Kontrolle" neuronaler Präparate ist es obligatorisch, die beiden entsprechenden Neurosphärensuspensionen wie beschrieben sorgfältig zu waschen, um eine verzögerte Kreuzinfektion der beiden Präparate aufgrund uner...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL syringe	BD	320840	store at RT
0.45 μm sterile filter	Millex-HV	SLHU033RS	store at RT
12 multiwell plate	Falcon	353043	store at RT
1X PBS	Gibco	14190-094	store at RT
24 multiwell plate	Falcon	351147	store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416	Tebubio	GTX13970	store at -20 °C
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839	Antibodies Online	ABIN334653	store at -20 °C
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773	Covance	MMS-435P	store at -20 °C
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA	store at RT
Blue light lamp	Nightsea	BLS2	store at RT
Borosilicate capillaries	Kwik-Fil	TW150-4	store at RT
BSA	Sigma	A9647	store at -20 °C
Bürker chamber	Sigma	BR719520	0.0025 mm2, 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik)	Bio-Optica	05-9801	store at RT
DAPI	Sigma	D9542	store at -20 °C
Disposable embedding mold	Bio-Optica	07MP7070	store at RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	store at +4 °C
Dnase I	Roche	10104159001	store at -20 °C
Doxycicline	Sigma	D1822	store at -20 °C
Dumont forceps #3c	Fine Science Tools	11231-20	store at RT
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-20	store at RT
EGF	Gibco	PHG0311	store at -20 °C
EGTA	Sigma	E3889	store at RT
FGF	Gibco	PHG0261	store at -20 °C
Fine scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	store at RT
Fungizone (Amphotericin B)	Gibco	15290018	store at -20 °C
Glucose	Sigma	G8270	store at RT
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488	Invitrogen	A11039	store at -20 °C
Goat anti-rat Alexa 594	Invitrogen	A11007	store at -20 °C
Heparin Solution	Stem Cell Technologies	07980	store at -20 °C
N2 Supplement	Gibco	17502048	store at -20 °C
Optical fibers	Leica	CLS150X
P1000 puller	Sutter Instruments	P-1000 model
Parafilm	Bemis	PM-996	store at RT
Pen Strep	Sigma	P0781	store at -20 °C
Petri dish	Falcon	353003	store at RT
PFA	Sigma	158127	store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	store at -20 °C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Scalpel	Braun	BB515	store at RT
Steromicroscope	Leica	MZ6	store at RT
Trypan blue	Gibco	15250-061	store at RT
Trypsin	Gibco	15400-054	store at -20 °C
Trypsin inhibitor	Sigma	T6522	store at -20 °C