In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Özet

Nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendisliğine dayanarak, vahşi tip beyinleri ve "test" ve "kontrol" türevlerinin eş-transplantasyonu, bu yöntem, neokortikal in vivo gen kontrolünde doğru modelleme sağlar basit ve ekonomik bir şekilde nöron morfoloji.

Özet

Nöronal sitanmiminin gen kontrolü Şu anda yoğun soruşturmanın konusu. Burada tarif edilen, neokortikal projeksiyon nöron morfolojisinin in vivo gen kontrolünü incelemek için geliştirilen basit bir yöntemdir. Bu yöntem, (1) "test" ve "kontrol" hücreleri olarak nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendislik dayanmaktadır (2) vahşi tip beyinleri içine onların Co-transplantasyonu, ve (3) onların nöronal türevleri eşleştirilmiş morfometrik değerlendirilmesi. Özellikle, e 12.5 pallial öncüleri panneuronal, genetik olarak etiketlenmiş bağışçılar, bu amaçla istihdam edilmektedir. Bunlar, seçilen organizatör ve Teton/off teknolojisinin avantajlarından yararlanmak için tasarlanmıştır ve onlar yenidoğan lateral ventrikül içine serbest el nakledilir. Daha sonra, alıcı beyinleri immünofluorescence profil üzerine, nakledilen nöronların siluetleri NeurphologyJ açık kaynaklı yazılım içine beslenir, onların morfometrik parametreleri ayıklanır, ve ortalama uzunluğu ve dallanma endeksi hesaplanır. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu üç ana avantaj sunar: uygun maliyetlerde transgen ifadesinin ince kontrolünü elde etmesini sağlar, sadece temel cerrahi becerileri gerektirir ve sınırlı bir analiz üzerine istatistiksel olarak güvenilir sonuçlar verir hayvan sayısı. Onun tasarımı nedeniyle, ancak, nöromimarlık non Cell-otonom kontrol adrese yeterli değildir. Dahası, tercihen nöronal göç tamamlandıktan sonra nörit morfoloji kontrolünü incelemek için kullanılmalıdır. Şu anki formülasyonunda, bu yöntem glutamatergik neokortikal nöron mimarisinin gen kontrolünü incelemek için zarif bir şekilde ayarlanmıştır. Diğer belirli nöral hücre türlerinde EGFP ifade transgenik hatları yararlanarak, kendi mimarisi gen kontrolünü ele almak için yeniden yapılabilir.

Giriş

Burada, nöronal sitonyonunda in vivo gen kontrolünü incelemek için geliştirdiğimiz basit bir yöntem açıklanmaktadır. Nöronal öncülerin in vitro mühendisliğine dayanarak, yenidoğan beynine nakli ve "test" ve "kontrol" hücrelerinin eşlenmiş morfometrik değerlendirilmesi, test genlerinin fonksiyonel etkilerini, nöronal morfolojinin ince kontrolünde bir hızlı ve uygun fiyatlı bir şekilde. Nöronal mimarinin in vivo gen kontrolünü araştırmak için, üç önemli teknik sorun ele alınmalıdır: (1) yeterince desenli gen-of-faiz (GOı) ifade ve doğru bir nicel kontrolü elde; (2) farklı nöronal siluetlerin düzgün segmentlenmiş görselleştirme elde etmek; (3) hayvanların sınırlı sayıda istihdam ederken sonuçların istatistiksel önemi eliciting.

Mevcut olduğunda, tetrasiklin (Tet) kontrollü transgenler taşıyan fare mutant hatları ilk sorunu gidermek için en iyi araç olabilir¹. Alternatif olarak, somatik nakliyle istihdam edilebilir. Bu gibi durumlarda transgeni Elektroporasyon² veya viral dönüştürücü³ile teslim edilir. Sonra, bir episome olarak korunur (örneğin, standart Elektroporasyon⁴), ya da GENOMA entegre edilmiştir (rasgele, retroviral integrase⁵ile; veya tanımlanmış bir konumda, Crispr tarafından terfi Homolog rekombinasyon (slendr)⁶ ).

İkinci olarak, nöronal siluet görselleştirme (a) seyrek üniforma etiketleme veya (b) yoğun diferansiyel etiketleme yoluyla elde edilebilir. Seyrek etiketleme gelince, gelişmiş Golgi benzeri metodolojiler istihdam edilebilir⁷, seçilmiş nöronal minisetler biocytin tarafından doldurulabilir⁸, ve tuz-ve-biber etiketleme seyrek ifade transgeni sayesinde elde edilebilir. Böyle bir transgeni (THY-EGFP)⁹ ya da Stokastik rekombinasyon (Morf)¹⁰tarafından aktive edilebilir alacalı transkripsiyon gösterebilir. Gibi (b), devlet sanat stratejileri bir multi-floxed fluoroprotein transgene dizi içinde CRE-aracılı Stokastik rekombinasyon içerir (bRainbow)¹¹, flororoprotein genler piggyBac-transposaz odaklı genomik entegrasyonu yanı sıra, daha önce somatik nakliyle (klon)¹²ile teslim edilir.

Üçüncü konuya gelince, morfometrik sonuç genellikle büyük bir rasgele değişkenlik etkilenir, hayvan farklılıkları ve hücre enjeksiyon olasılıklardan kaynaklanan. Bu nedenle, çok sayıda hayvan genellikle GOı morfometrik aktivite değerlendirmek için gerekli istatistiksel güç elde etmek için istihdam edilir.

Daha önce açıklanan yaklaşımlar genellikle gelişmiş teknik becerilere güveniyor ve bilimsel toplumlarda difüzyon sınırlarını sınırlayabilen göze çarpan finansal kaynaklara ihtiyaç duyar. Bu sorunları aşmak için, biz hızlı ve uygun bir şekilde nöromimarlık in vivo gen kontrolünü parçalamak için kolay ve basit bir boru hattı tasarlanmış. Bu, daha önce antiblastik transgen aktivitesi¹³' ün hızlı in vivo değerlendirilmesi için geliştirilen benzer bir ortak transplantasyon tasarımından esinlenilmiştir.

Özellikle, in vitro mühendislik "yeşil" sinir öncüleri ("test" ve "kontrol" hücrelerinin) bir "siyah" alıcı yenidoğan beyin içine Co-transplantasyonu aynı anda yukarıda listelenen üç önemli sorunları düzeltebilirsiniz düşünülmektedir. Aslında, iyi kontrollü koşullarda, precursors In vitro lentiviral mühendislik, en az, genellikle in vivo somatik manipülasyonlar ile ilişkili nöronal transgen ifade değişkenlik bakım sağlar (daha önce gerçekleştirilen ^{14 , 15} ve bizim yayımlanmamış sonuçlar). Gen ifadesinin elde edilen doğru kontrolü, Tet kontrollü transgenik modellerde elde edilen ile karşılaştırılabilir. Ancak, bu prosedürün maliyetleri, transgenik fare çizgisinin bakımından kaynaklanan bunlardan çok daha fazladır. Sonra, serbest hücre enjeksiyonu kolaydır ve minimal eğitim gerektirir. Dahası, her beyne enjekte etiketli öncülerin miktarı kolayca seyrek dağıtılmış öncüleri yeterli birikimli sayısı elde etmek için ayarlanabilir, aynı zamanda en az nakledilen hayvanların toplam sayısını tutarak. Son olarak, Co-enjeksiyon farklı Fluoro etiketli, "test" ve "kontrol" öncüleri ve sonuçların sonraki ikili istatistiksel analiz, inter-hayvan deneysel değişkenlik etkilerini karşı, ulaşmasına izin sonuçlar istatistiksel önemi, bireylerin sınırlı sayıda Analizi bile¹³.

Bu, hızlı ve ucuz olsa da, bu yöntemin iki ana sınırlamalara sahip olduğu vurgulanmalıdır. İlk olarak, nöronal mimarinin hücre otonom gen kontrolünü araştırmak için tasarlanmıştır ve çevre kontrolünü ele almak uygun değildir. İkinci olarak, nakledilen nöronal öncüleri heterokronik bir program ile son konumuna ulaştığınızda, bu yöntem geçmiş göç tamamlanma oluşan nöromimarilik kontrolü modeli için tercih edilir.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler ve prosedürler SıSıS Organizmo preposto al Benessere Animale (SıSAM ıERUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Mühendislik "yeşil" progenitör havuzları üretimi

1. "Yeşil" havuzun hazırlanması
   1. Mate bir Wild-tip CD1 kadın bir Mtapt^EGFP/+ kurucusu¹⁶. 12,5 gün Post-coitum (gün 0 vajinal fiş denetimi ile belirlenir) ve embriyonik gün 12,5 (e 12.5) embriyolar hasat servikal çıkığı tarafından hamile baraj euthanize. Soğuk PBS solüsyonlarında 24 multiwell plakanın bireysel kuyularında ayarlayın.
   2. Hızlı bir şekilde, mavi ışık lambası altında görsel muayene ile embriyolar genotip, beyinde yeşil floresan emisyon kontrol.
   3. % 0,6 glikoz ile soğuk 1x PBS dolu 10 cm çap Petri çanak içine "yeşil" embriyo yerleştirin ve bir stereomicroscope altına aktarın.
   4. Standart makas kullanarak embriyo kafaları kesip #3 ve #5 forseps yoluyla onlardan telencephalon ayıklamak.
   5. İki telensefalik vezikülleri ayırın ve forseps kullanarak neokortikleri çıkarın; Hippocampus ve bazal ganglionlar kaldırmak için emin olun¹⁷.
   6. Bir P1000 pipet ile bir 1,5 mL tüp buz üzerinde tutulan içine aktararak neokortikler toplayın.
   7. Disseke neokortikler tüp altına yerleşmek edelim.
   8. Süpernatant mümkün olduğunca aspirate.
   9. Yeni proliferatif Orta 400 μL içinde neokortikat resuspend [dmem-F12, 1x glutamax, 1x N2, 1 mg/ml Sığır serum albümin (BSA), 0,6% glikoz, 2 μg/ml heparin, 20 ng/ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 20 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF), 1x pen-strep, ve 10 pg/ml Amfoterisin B].
   10. Bulutlu bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir uç başına, P1000, P200 ve P20 ipuçları ile ardışık olarak, neokortikleri yukarı ve aşağı hafifçe pipet.
       Not: E 12.5 neokortikal doku çok yumuşak; tek hücrelere bunalımları tüm enzimatik sindirim gerektirmez; tekrarlanan pipetleme yeterlidir.
   11. Menenjlerin ve kalıntı neokortikal kümeleri 2 dakika boyunca yerleşmek edelim.
   12. Transfer 150 μL hücre süspansiyon üst (ağırlıklı olarak tek hücreler içeren) yeni bir 1,5 mL steril tüp içine.
   13. Ekle 150 yeni proliferatif orta μL ve 1.1.10-1.1.12 daha fazla doku kümeleri belirgin olana kadar adımları tekrarlayın. Bunu yaparken, P1000 pipetleme adımını (adım 1.1.10) atlayın.
       Not: 1.1.10-1.1.12 adımlarının üç yineleme genellikle tam doku dissociation elde etmek için yeterlidir.
   14. BüRkEr odası¹⁷ ' de tripan mavi dışlama yöntemiyle hücreleri sayma ("yeşil" havuz) ve konsantrasyonu 10³ hücreye/μL 'ye ayarlamak için taze proliferatif ortam ekleyin.
       Not: adım 1.1.7-1.1.14,% 70 etanol tarafından dezenfekte edilmiş steril bir laminar akış kaputu altında yapılmalıdır ve en az 20 dakika boyunca havalandırılmış tutulmalıdır.
2. "Yeşil" alt havuzları mühendislik
   1. İki ayrı 1,5 mL tüpler lentiviral enfeksiyon için iki alt havuzları içine "yeşil" havuzu alt bölümlere ayırın.
   2. İki adanmış lentiviral karışımları ile bağımsız olarak alt havuzları bulaştırmak. Her Mix "kırmızı etiket" virüs (Pgk1_mCherry) veya "siyah" virüs (pCAG_lacZ) bir kontrol olarak, yanı sıra tetOFF tahrik transgene (Pgk1p_tTA ve TRE_transgene) veya kontrol (Pgk1p_tTA ve TRE_PLAP) ifade için virüsler içerir.
      DIKKAT: BLS-2 ortamında lentivirüsleri geçerli kurallar ve yasalar tarafından reçete edilen tüm koruyucu ölçümlerle değiştirin.
      Not: her Lentivirus, (önceden gösterilen¹⁴) bu tür deneysel koşullarda nöral hücrelerin büyük çoğunluğunu vermek için yeterli olan 8 ' lik bir ENFEKSIYONUN (MOI) çokluğu ile yönetilmelidir (Şekil 1). Lentivirus kullanan Tet transaktipiyatörler, tTA/rtTA ifadesi (örn., pTα1, pSyn, Pcamkıa, pGAD1, vb.) sürüş farklı nöronal promotörler istihdam ederek inşa edilebilir (Şekil 2). MOı (a) ' nın (b) hedef hücrelerinin sayısına teslim edilen enfeksiyöz viral partiküllerin sayısına oranıdır. Burada, eski (a)¹⁴başka bir yerde açıklanan geleneksel prosedüre göre hesaplanır, ikincisi (b) sadece bir BüRkEr odası kullanılarak değerlendirilir.
   3. Plaka 600.000, 2 μg/mL Doksisiklin ile proliferatif orta 600 μL olarak, 12 multiwell plaka başına her enfekte alt havuz hücreleri.
      Not: burada, kuyuları Poly-lizin ile önceden tedavi edilmez, hangi kendi diplerine nöral hücre eki önler.
   4. 37 °C ' de% 5 CO₂ ' de hücreleri inkükoye aktarın.
   5. 2 gün sonra, enfeksiyonun verimliliğini ve mühendislik havuzlarının diferansiyel işaretlemesi değerlendirmek için, geleneksel floresan mikroskop altında hücreleri inceleyin. İki alt havuzlar küçük nörokürlerin süspansiyonları olarak görünür, homojen kırmızı floresan protein ifade ("kontrol" örnek) ya da değil ("test" örnek). Bu nöroküreler içinde, Mtapt^EGFP transgeni bir hücre azınlığı (sonrası mitotik nöronlar) ile sınırlıdır ve bunların çoğunda sessiz (proliferasyon Öncüller) (Şekil 3).

2. cerrahi enstrümanların ve çalışma alanının ayarlanması

1. Borosilikat iğneler hazırlanması
   1. Sırasıyla 1,5 mm ve 1,12 mm 'lik dış ve iç çaplı borosilikat cam kapillarlerini kullanın.
   2. Bir P 1000 çektirme ile kapiller çekin.
   3. Çekme programını ayarla. Tipik program parametreleri şunlardır: ısı = 614; Vel = 60; zaman = 1; basınç = 600. Onlar çektirme modeli ve Isıtma direnci istihdam göre ayarlanması gerekir.
   4. Kapiller çektirme tutucular yerleştirin ve onları sıkın.
   5. Programı başlatın ve iki çekti mikrokapillaries alın.
   6. Harici çapı ~ 200-250 μm ile bir ipucu elde etmek için stereomikoskop altında, bir neşter ile, el ile kılcal ucu kes.
   7. Kapiller bir modelleme kil (örn., plastikin) kapalı bir petri tabak destek ve kaput altına aktarmak yerleştirin.
2. Kapağı kurma ve hücre izleyici çözümünü hazırlama
   1. Yatay Akış kaputu dikkatle temizleyin ve% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin.
   2. % 70 etanol kullanarak optik lifleri dezenfekte edin ve kaput altına yerleştirin.
   3. "Hücre izleyici çözümünü" hazırlamak ve kaput altına yerleştirmek için 10 μL 125 mM EGTA çözeltisi ve 10 μL Fast Green karıştırın.
   4. Hücre süspansiyon tespit için laboratuvar sızdırmazlık filmi (4 cm x 2 cm) küçük parçalar kes.
   5. 1 mg/ml steril doksisiklin çözeltisi hazırlayın ve 0,3 ml şırınga içine Aspire.
   6. Kaputu açın ve operasyondan önce 20 dakika boyunca laminar akışını tutun.
3. Enjeksiyon tüpünün montajı
   1. Sabit plastik bir ağızlık, iki lateks tüpler (her biri 30 cm uzunluğunda) ve kalibre edilmiş mikrokapiller pipetler için bir aspiratör tüp montaj kiti bir kapiller tutucu alın.
   2. Sert plastik ağızlı bir lateks tüp bir ucunu düzeltin.
   3. Başka bir lateks tüpün bir ucuna kapiller tutucu düzeltin.
   4. Operatör mikropları karşı bir bariyer olarak, bir 0,45 μm steril filtre ile iki lateks tüpler serbest uçları bağlayın.
   5. Elde edilen aspiratör tüp aksamını, başlık altında tutulacak bir modelleme kil tutucusuna yerleştirin.

3. hücre karışımı ve intraventriküler transplantasyon

1. "Test" ve "kontrol" yeşil hücre alt havuzları karıştırma
   1. Toplamak "test" ve "kontrol" nörokürler (adım 1.2.5 bakın) ayrı 1,5 mL tüpler.
   2. Santrifüjler, 5 dakika 200 g 'de süspansiyon
   3. Toplamak ve hücre Pellet rahatsızlık kaçınarak, supernatant atın.
   4. 500 μL 1x PBS 'de yavaşça pelletini nörokürler.
   5. 1 dakika için 200 g 'de Santrifüjü.
   6. Süpernatant çıkarın.
   7. 3.1.4 adımları yineleyin-3.1.6 iki kez daha.
   8. 200 μL 2x tripsin çözeltisi (2x tripsin, 1x PBS) ve pipet hücresi Pelet yukarı ve aşağı 4X-5x yavaşça pelletini küreler.
      Not: hava kabarcıkları yapmak için dikkat edin.
   9. Tek hücreli süspansiyon elde etmek için 37 °C ' de 5 dakika boyunca kuluçte hücreleri bırakın.
   10. 200 μL tripsin inhibitörü çözeltisi ile blok tripsin (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse ı, 0,28 mg/mL tripsin inhibitörü) yukarı ve aşağı 4X-5x pipetleme ile.
   11. 5 dakika için 200 x g 'de santrifüjler ve 1 ml taze proliferatif Orta (dmem-F12, 1x glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glikoz, 2 μg/ml heparin, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 1x kalem strep, 10 pg/ml Amfoterisin B).
   12. BüRkEr odasında tripan mavi dışlama yöntemiyle iki havuzun hücrelerini saymak.
   13. Proliferatif ortamdaki Cells/μL 100.000 için konsantrasyonlarını ayarlayın.
   14. Mix 1:1 "kontrol" olanlar ile "test" hücreleri.
   15. Karışımı iki havuzların tek hücreli bir süspansiyon olduğundan emin olmak için Floresan Mikroskobu (objektif büyütme: 10X) altında elde edilen karışımı kontrol edin (Şekil 3c).
   16. Karışımı kaput altında buz üzerine yerleştirin.
2. İntraventriküler transplantasyon
   1. Kafesi anne ve P0 yavruları ile cerrahi operasyon alanından uzak bir masada hazırlayın.
   2. Kaput yakın bir sepetinize bir kurtarma kafesi yerleştirin.
   3. Kurtarma kafesi altındaki annenin kafesinden alınan talaş karışımı koyun ve bir lamba altına yerleştirin.
   4. Bir kenara, P0 pups anestezi için bir alüminyum folyo ile kaplı bir buz kutusu ayarlayın.
   5. Transplantasyondan hemen önce, 1/10 hacim (adım 2.2.3) hücre süspansiyonunun 1 hacmine (adım 3.1.16) ve sonuç olarak 3 μL 'den oluşan "enjeksiyon karışımı" nın bir parça laboratuar sızdırmazlık filmi üzerine ekleyin.
   6. 1 dakika boyunca serin alüminyum folyo üzerinde PUP yerleştirin ve tam anestezize olduğunu kontrol edin.
      Not: anestezi onaylamak Için, yavaşça bir pençe sıkmak ve hareketleri eksikliği için PUP izlemek, hala nefes alırken.
   7. Bu arada, 3 μL enjeksiyon karışımı (adım 3.2.5) cam kapiller içine Aspire.
   8. % 70 etanol ile anestezili yavru kafasını yavaşça silin.
   9. Açıkça kortikal yarımküreler tanımlamak için optik fiber ucunda yavru 's çene yerleştirin.
      Not: at P0-P1, baş cilt çok ince, sadece gözbebekleri üzerinde ve koku ampuller arkasında hemheres basit görsel kimlik için izin.
   10. İki orta parasagittal düzlemlerden biri (sol veya sağ), koku ampul yukarıda (adım 3.2.7 içinde açıklandığı gibi) kapiller tutun ve gözbebekleri merkezleri içeren frontal düzlem ile kesişiminde alın Cilt delinme. Kan damarlarına zarar vermemek için dikkat edin. Frontal korteks içine kapiller girin ve ventriküler boşluğa erişim (Şekil 4A).
   11. Ganglionik Kardinal 'in kazara zarar görmesini önlemek için, iğneyi 30 derece yanal olarak döndürün, ucu caudal-mediel-Ward ' ı (Şekil 4b) işaret ediyor.
   12. Hücreleri yavaşça ventriküler boşluğa enjekte eder ve hızlı yeşil (Şekil 4c) ile difüzyonlarını izleyin.
   13. Bekleyin 5-10 s.
   14. Hücre süspansiyonunu Aspire değil, uygun bir bertaraf kutusu içinde atmak için dikkat çekerken cam iğne çıkarın.
   15. Anestezi önce PUP kurtarma enjekte 150 enjitoneally trangen ifade hala kapalı transplantasyon sonra tutmak için doksisiklin çözeltisi μL.
   16. Enjeksiyon sonra, kurtarma için lamba hemen altında PUP yerleştirin.
   17. 5-10 dk için lamba altında pups bırakın ve, bir kez tam uyanık, Anne ile kafese yerleştirin.
   18. Anne onları kabul emin olmak için, 2-3 h için işletilen pups gözlemlemek.
   19. 0,5 mg/mL doksisiklin ve 50 g/L sakaroz içeren içme suyu ile kafes tedarik transgen ifade kapalı korumak için.
   20. Doksisiklin içeren suyu, transplantasyondan sonraki 4 gün sonra doksi içermeyen suyla değiştirin, böylece sonrası mitotik nöronların transgeni aktive edilir. 6 gün boyunca bir Doxy-Free rejimde fareler tutun ve onları ötenize ile P10 karbon dioksit inhalasyon tarafından takip debelasyonu.

4. nakil beynin Analizi

1. Histoloji ve immünofluoresesans
   1. Nakledilen yavruları, karbon dioksit inhalasyonu ile hücre nakli yapıldıktan 10 gün sonra deptübasyon sonrasında ötenize eder. 4 °c ' de gece 4% civarında formaldehite (PFA) içinde ötenize yavruları düzelt.
      DIKKAT: PFA son derece zehirlidir; bir kimyasal duman kaputu altında, kesinlikle üreticinin reçeteleri ile uyumlu, bakım ile ele; etiketli bir atık kabında PFA çözeltisi kalıntılarını atabilirsiniz.
   2. PFA çözümünü çıkarın ve% 30 sakaroz çözeltisi ile değiştirin.
   3. Beyni 4 °C ' de ya da şişenin dibine kadar batırıncaya kadar bırakın.
   4. Bir tek kullanımlık gömme kalıp içine beyin transfer yaklaşık yarı Cryo-dahil orta dolu.
   5. Dahil edilen beyinleri-80 °C ' de dondur.
   6. Kesme 60 μm kalın koronal bölümler bir kriyostat kullanarak.
      Not: Bu tek nöronların tüm mimarisi ile ilgili kabul edilemez bilgi kaybına neden olabilir, daha ince bölümler istihdam kaçının.
   7. İmmünofluorescence için proses bölümleri^18,19, Anti-Gfp kullanarak [1:400] ve anti-RFP (MCherry) [1:500] antikorlar. 1 mg/mL DAPı çözeltisi ile karşı leke çekirdekleri [1:200].
2. Morfometri
   1. Konfokal mikroskobun çalışma parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: z-yığın yüksekliği = 40 μm; Adım = 2 μm.
   2. GFP pozitif nöron zengin fotoğraf alanları, RFP sinyal dağılımı kör seçerek immünassayed dilimleri resimleri toplayın.
   3. Görüntüleri. ND2 dosyaları olarak dışa aktarın.
   4. En fazla Z-projeksiyonları. tiff dosyaları (Şekil 5A) olarak oluşturun.
   5. Hücre Genotype için alt sıralı nöronal çerçeve yapısı çıkarma kör izin vermek için, kırmızı sinyali gizlemek. Bunu yapmak için, her. tiff dosyasını uygun bir yazılım ile açın ve bir ayarlama katmanı ekleyin. "Seviyeleri", "kırmızı" seçin ve sonra "çıkış" sıfırı ayarlayın. Dosyayı böyle kaydedin.
      Not: Iskeletonization daha sonra orijinal düz kırmızı dosyalara önceki erişimi olmayan yeni bir operatör tarafından gerçekleştirilir.
   6. Her gizli kırmızı dosya için, birincil görüntüye bir çizim katmanı ekleyin ve Kalem aracını (beyaz renk) seçin. GFP sinyal temelinde Soma iz, sonra nöronlar iz.
      Not: kalem aracı Soma için 40 piksel ve neurites için üç piksel olarak ayarlanabilir.
   7. Nöronal siluetler de dahil olmak üzere çok katmanlı dosyayı kaydedin (Şekil 5B).
      Not: nöronal iskelet sonraki Analizi her iki operatör tarafından gerçekleştirilebilir.
   8. Yeni bir 1024 x 1024 16-bit gri tonlamalı dosya siyah arka plan, bir nöron başına oluşturun.
   9. Tek nöronal silüetleri birincil görüntüden yeni gri tonlamalı dosyaya kopyalayın ve yapıştırın. Çok katmanlı dosyaya geri dönün ve nöronal genotürleri açığa çıkarmak için ayarlama katmanını kapatın. 16-bit gri tonlamalı dosya karşılık gelen nöronal Genotype açıklama kaydedin.
   10. Imagej tek tek ile gri tonlamalı görüntüleri ithalat ve ımagej yazılımı NeurphologyJ eklentisi tarafından iskelet analiz²⁰ (Şekil 5c).
   11. Nörophologyj birincil verileri kopyalayın (neurite_length, attachment_points ve uç noktalar; her biri için "Toplam alan" değerlerini alın), bir elektronik tabloya yapıştırın ve ikincil morfometrik parametreleri hesaplamak için bunları kullanın ( Ortalama nörit uzunluğu, dallanma indeksi) (Şekil 5D).

Sonuçlar

Prosedürün temel yönleri hakkında yararlı bilgiler sağlayan beş birincil veri kümesi vardır, ilk varlık (1) nöral öncülerin iletim ve lentiviral vektörler ile ortak Dönüştürücüsü verimliliği. (2) "test gen" sürücü için istihdam organizatörler temel özellikleri bir örnek. (3) transplantasyon için hazır tasarlanmış hücreler örneği. (4) yenidoğan beynin içine hücre Mikroenjeksiyonu anahtar usul detayları da dahil olmak üzere bir karikatür. (5) tüm m...

Tartışmalar

Bu prosedürün spesifik yönleri/adımları önemlidir ve özel dikkat gerektirir. İlk olarak, (a) operatörler, bir BSL-2 uyumlu laboratuvar ortamında lentivirüsleri güvenli bir şekilde yönetmek için yeterli derecede önceden eğitilmelidir. İkinci olarak, (b) önce Mix "test" ve "kontrol" nöral preparatlar, dikkatle açıklandığı gibi iki karşılık gelen nöroküre süspansiyonları yıkamak için zorunludur, istenmeyen lentiviral nedeniyle iki preparatların herhangi bir gecikme çapraz enfeksiyon önle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL syringe	BD	320840	store at RT
0.45 μm sterile filter	Millex-HV	SLHU033RS	store at RT
12 multiwell plate	Falcon	353043	store at RT
1X PBS	Gibco	14190-094	store at RT
24 multiwell plate	Falcon	351147	store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416	Tebubio	GTX13970	store at -20 °C
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839	Antibodies Online	ABIN334653	store at -20 °C
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773	Covance	MMS-435P	store at -20 °C
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA	store at RT
Blue light lamp	Nightsea	BLS2	store at RT
Borosilicate capillaries	Kwik-Fil	TW150-4	store at RT
BSA	Sigma	A9647	store at -20 °C
Bürker chamber	Sigma	BR719520	0.0025 mm2, 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik)	Bio-Optica	05-9801	store at RT
DAPI	Sigma	D9542	store at -20 °C
Disposable embedding mold	Bio-Optica	07MP7070	store at RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	store at +4 °C
Dnase I	Roche	10104159001	store at -20 °C
Doxycicline	Sigma	D1822	store at -20 °C
Dumont forceps #3c	Fine Science Tools	11231-20	store at RT
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-20	store at RT
EGF	Gibco	PHG0311	store at -20 °C
EGTA	Sigma	E3889	store at RT
FGF	Gibco	PHG0261	store at -20 °C
Fine scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	store at RT
Fungizone (Amphotericin B)	Gibco	15290018	store at -20 °C
Glucose	Sigma	G8270	store at RT
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488	Invitrogen	A11039	store at -20 °C
Goat anti-rat Alexa 594	Invitrogen	A11007	store at -20 °C
Heparin Solution	Stem Cell Technologies	07980	store at -20 °C
N2 Supplement	Gibco	17502048	store at -20 °C
Optical fibers	Leica	CLS150X
P1000 puller	Sutter Instruments	P-1000 model
Parafilm	Bemis	PM-996	store at RT
Pen Strep	Sigma	P0781	store at -20 °C
Petri dish	Falcon	353003	store at RT
PFA	Sigma	158127	store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	store at -20 °C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Scalpel	Braun	BB515	store at RT
Steromicroscope	Leica	MZ6	store at RT
Trypan blue	Gibco	15250-061	store at RT
Trypsin	Gibco	15400-054	store at -20 °C
Trypsin inhibitor	Sigma	T6522	store at -20 °C