Trasplante Intraventricular de Precursores Neuronales Deingidos para Estudios de Neuroarquitectura In Vivo

Resumen

Basado en la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales, su co-trasplante en cerebros de tipo salvaje y evaluación morfométrica emparejada de derivados de "prueba" y "control", este método permite el modelado preciso del control genético in vivo del neocortical morfología de las neuronas de una manera simple y asequible.

Resumen

El control genético de la citoarquitectura neuronal es actualmente objeto de una investigación intensiva. Aquí se describe un método simple desarrollado para estudiar el control del gen in vivo de la morfología de la neurona de proyección neocortical. Este método se basa en (1) la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales como células de "prueba" y "control", (2) su cotrasplante en cerebros de tipo salvaje, y (3) la evaluación morfométrica emparejada de sus derivados neuronales. Específicamente, e12.5 precursores palliales de panneuronal, donantes genéticamente etiquetados, se emplean para este propósito. Están diseñados para aprovechar los promotores seleccionados y la tecnología tetON/OFF, y se trasplantan a mano alzada en ventrículos laterales neonatales. Más tarde, tras el perfil de inmunofluorescencia de los cerebros receptores, las siluetas de las neuronas trasplantadas se introducen en el software de código abierto NeurphologyJ, se extraen sus parámetros morfométricos y se calculan la longitud media y el índice de ramificación. En comparación con otros métodos, este ofrece tres ventajas principales: permite lograr un control fino de la expresión transgénica a costos asequibles, sólo requiere habilidades quirúrgicas básicas, y proporciona resultados estadísticamente confiables tras el análisis de una número de animales. Debido a su diseño, sin embargo, no es adecuado para abordar el control no autónomo celular de la neuroarquitectura. Además, se debe utilizar preferentemente para investigar el control morfológico de neurita después de la finalización de la migración neuronal. En su formulación actual, este método está exquisitamente ajustado para investigar el control genético de la arquitectura de neuronas neocorticales glutamatérgicas. Aprovechando las líneas transgénicas que expresan EGFP en otros tipos específicos de células neurales, se puede reutilizar para abordar el control genético de su arquitectura.

Introducción

Aquí describimos un método simple que desarrollamos para diseccionar el control genético in vivo de la citoarquitectura neuronal. Basado en la ingeniería in vitro de precursores neuronales, su trasplante en cerebro neonatal y evaluación morfométrica emparejada de células de "prueba" y "control", permite revelar implicaciones funcionales de genes de prueba en el control fino de la morfología neuronal en un manera rápida y asequible. Para investigar el control genético in vivo de la arquitectura neuronal, deben abordarse tres cuestiones técnicas clave: 1) lograr una expresión genética de interés (GOI) adecuadamente modelada y un control cuantitativo preciso de la misma; (2) obtener una visualización correctamente segmentada de siluetas neuronales distintas; 3) obtener una significancia estadística de los resultados mientras se emplea un número limitado de animales.

Cuando están disponibles, las líneas mutantes de ratón que albergan transgenes controlados por tetraciclina (tet) pueden ser la mejor herramienta para abordar el primer problema¹. Alternativamente, se puede emplear transgénesis somática. En tales casos, el transgén se entrega a través de la electroporación² o la transducción viral³. A continuación, se conserva como un epísmio (por ejemplo, sobre la electroporación estándar⁴), o se integra en el genoma (aleatoriamente, a través de la integrasa retroviral⁵; o en un lugar definido, a través de la recombinación homóloga promovida por CRISPR (SLENDR)⁶ ).

En segundo lugar, la visualización de la silueta neuronal puede lograrse mediante (a) etiquetado uniforme disperso o (b) etiquetado diferencial denso. En cuanto al etiquetado escaso, se pueden emplearmetodologías avanzadas similares a Golgi 7, los miniconjuntos neuronales seleccionados pueden ser llenados por biocictina^8,y el etiquetado de sal y pimienta se puede obtener gracias a un transgén escasamente expresado. Dicho transgén puede mostrar transcripción variada (Thy-EGFP)⁹ o puede activarse mediante recombinación estocástica (MORF)¹⁰. En cuanto a (b), las estrategias de vanguardia incluyen la recombinación estocástica mediada por Cre dentro de una matriz transgénica de fluoroproteínas multifloxadas (Brainbow)^11,así como la integración genómica impulsada por piggyBac-transposasa de genes de fluoroproteínas, anteriormente entregada a través de la transgénesis somática (CLoNE)¹².

En cuanto a la tercera cuestión, el resultado morfométrico a menudo se ve afectado por una gran variabilidad aleatoria, originada por diferencias entre animales y contingencias de inyección celular. Debido a esto, un gran número de animales se emplea generalmente para lograr el poder estadístico necesario para evaluar la actividad morfométrica GOI.

Los enfoques descritos anteriormente a menudo se basan en habilidades técnicas avanzadas y requieren recursos financieros visibles, lo que puede limitar su difusión dentro de la comunidad científica. Para eludir estos problemas, concebimos una canalización fácil y directa para diseccionar el control genético de la neuroarquitectura in vivo de una manera rápida y asequible. Esto se inspira en un diseño similar de co-trasplante previamente desarrollado para una evaluación rápida in vivo de la actividad transgén al trasgeno antiblástica^13.

Específicamente, se cree que el co-trasplante de precursores neuronales "verdes" de ingeniería in vitro ("células de prueba" y "control") en un cerebro neonatal receptor "negro" puede corregir simultáneamente los tres problemas clave mencionados anteriormente. De hecho, la ingeniería lentiviral in vitro de precursores, en condiciones bien controladas, permite el mantenimiento de la variabilidad de la expresión transgénica neuronal como mínimo, muy por debajo de la generalmente asociada con manipulaciones in vivo somáticas (realizadas previamente ^{14 , 15} y en nuestros resultados inéditos). El control preciso resultante de la expresión génica es comparable al logrado por los modelos transgénicos controlados por tet. Sin embargo, los costes de este procedimiento están muy por debajo de los derivados del mantenimiento de una línea de ratón transgénica. A continuación, la inyección de células a mano alzada es fácil y requiere un entrenamiento mínimo. Además, la cantidad de precursores etiquetados inyectados en cada cerebro se puede ajustar fácilmente para lograr un número acumulado suficiente de precursores escasamente distribuidos, manteniendo al mismo tiempo el número total de animales trasplantados como mínimo. Por último, pero no menos importante, la coinyección de precursores de etiqueta fluorada, "prueba" y "control" de manera diferente y el posterior análisis estadístico por pares de los resultados contrarrestan los efectos de la variabilidad experimental interanimal, permitiendo alcanzar significación estadística de los resultados, incluso tras el análisis de un número limitado de individuos¹³.

Cabe destacar que, aunque rápido y barato, este método tiene dos limitaciones principales. En primer lugar, está diseñado para investigar el control genético autónomo celular de la arquitectura neuronal, y no es apropiado para abordar el control ambiental. En segundo lugar, a medida que los precursores neuronales trasplantados llegan a su ubicación final por un horario heterocrónico, este método es preferible a modelar el control neuroarquitectónico que se produce después de la finalización de la migración.

Protocolo

Todos los métodos y procedimientos descritos aquí han sido aprobados por la SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).

1. Generación de piscinas de progenitores "verdes" de ingeniería

1. Preparación de la piscina "verde"
   1. Mate una hembra de CD1 de tipo salvaje con un fundador de Mtapt^{EGFP/+ 16}. Eutanasia la presa embarazada por luxación cervical a los 12,5 días después del coíto (el día 0 se determina mediante la inspección del tapón vaginal) y cosechar los embriones embrionarios del día 12,5 (E12.5). Establézcalos en pozos individuales de una placa multipocilla 24 en solución PBS fría.
   2. Genotipo rápidamente los embriones mediante inspección visual bajo una lámpara de luz azul, comprobando la emisión de fluorescencia verde en el cerebro.
   3. Coloque los embriones "verdes" en una placa Petri de 10 cm de diámetro llena de PBS frío 1x con 0.6% de glucosa y transfiera a bajo un estereomicroscopio.
   4. Cortar las cabezas de los embriones utilizando tijeras estándar y extraer el telencéfalo de ellos por medio de #3 y #5 fórceps.
   5. Separar las dos vesículas telencéfalas y diseccionar los neocortices usando fórceps; asegúrese de eliminar el hipocampo y los ganglios basales^17.
   6. Recoger los neocóticos transfiriéndolos con una pipeta P1000 en un tubo de 1,5 ml mantenido en hielo.
   7. Deje que los neocóticos diseccionados se asienten en la parte inferior del tubo.
   8. Aspira al sobrenadante tanto como sea posible.
   9. Resuspender los neocóticos en 400 l de medio proliferativo fresco [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA), 0,6% de glucosa, 2 g/ml de heparina, factor de crecimiento de fibroblasto básico de 20 ng/ml (bFGF), 20 ng/mL factor de crecimiento epidérmico (EGF), y 10 pg/ml de anfotericina B].
   10. Pipetee suavemente los neocóticos hacia arriba y hacia abajo, secuencialmente con puntas P1000, P200 y P20, 4 veces por punta, para obtener una suspensión celular turbia.
       NOTA: El tejido neocortical E12.5 es muy blando; disociándolo a células individuales no requiere digestión enzimática en absoluto; pipeteo repetido es suficiente.
   11. Deje que las meninges y los grumos neocorticales residuales se asienten durante 2 min.
   12. Transfiera 150 l desde la parte superior de la suspensión celular (principalmente concélulas individuales) a un nuevo tubo estéril de 1,5 ml.
   13. Añadir 150 l de medio proliferativo fresco y repetir los pasos 1.1.10-1.1.12 hasta que no se puedan ver más grumos de tejido. Al hacer esto, omita el paso de pipeteo P1000 (en el paso 1.1.10).
       NOTA: Tres iteraciones de los pasos 1.1.10-1.1.12 suelen ser suficientes para lograr la disociación completa del tejido.
   14. Contar las células (piscina "verde") con el método de exclusión azul trypan en una cámara de B-rker¹⁷ y añadir un medio proliferativo fresco para ajustar la concentración a 10³ células / L.
       NOTA: Los pasos 1.1.7-1.1.14 deben realizarse bajo una campana de flujo laminar estéril desinfectada por etanol en un 70% y mantenida ventilada durante al menos 20 minutos.
2. Ingeniería de las subpiscinas "verdes"
   1. Subdividir la piscina "verde" en dos sub-piscinas en dos tubos distintos de 1,5 ml para la infección lentiviral.
   2. Infectar los sub-pools de forma independiente con las dos mezclas lentivirales dedicadas. Cada mezcla contiene el virus "etiqueta roja" (Pgk1_mCherry) o el virus "negro" (pCAG_lacZ) como control, así como virus para transgén controlado por tetOFF (Pgk1p_tTA y TRE_transgene) o expresión de control (Pgk1p_tTA y TRE_PLAP).
      ADVERTENCIA: Manipule los lentivirus en un entorno BLS-2 con todas las medidas de protección prescritas por las normas y leyes aplicables.
      NOTA: Cada lentivirus debe administrarse con una multiplicidad de infección (MOI) de 8, que (como se ha demostrado anteriormente¹⁴) es suficiente para transducir la gran mayoría de las células neuronales en tales condiciones experimentales (Figura1). Los transactivadores de tet de lentivirus se pueden construir empleando diferentes promotores neuronales que impulsan la expresión tTA/rtTA (p. ej., pT-1, pSyn, pCaMKII, pGAD1, etc.) (Figura 2). El MOI es la proporción de (a) el número de partículas virales infecciosas entregadas a (b) el número de sus células diana. En este caso, la primera (a) se calcula de acuerdo con el procedimiento convencional descrito en otros lugares^14,la segunda (b) simplemente se evalúa utilizando una cámara de B-rker.
   3. Placa 600.000 células de cada subpool infectado por pozo de una placa multipocilla de 12, en 600 ml de medio proliferativo con 2 g/ml de doxiciclina.
      NOTA: Aquí, los pozos no son pretratados con polilisina, lo que impide la fijación de las células neurales a sus fondos.
   4. Transfiera las células a la incubadora en un_CO2 del 5% a 37 oC.
   5. Después de 2 días, para evaluar la eficiencia de la infección y el marcado diferencial de las piscinas de ingeniería, inspeccione las células bajo un microscopio fluorescente convencional. Los dos subgrupos deben aparecer como suspensiones de pequeñas neuroesferas, expresando homogéneamente la proteína fluorescente roja ("muestra de control") o no ("muestra de prueba"). Dentro de estas neuroesferas, el transgén Mtapt^EGFP es activo limitado a una minoría de células (neuronas postmitóticas) y silencioso en la mayoría de ellos (precursores proliferantes) (Figura 3).

2. Configuración de los instrumentos quirúrgicos y el área de operación

1. Preparación de agujas de borosilicato
   1. Utilice los capilares de vidrio borosilicato con diámetro externo e interno igual a 1,5 mm y 1,12 mm, respectivamente.
   2. Tire del capilar con un tirador P 1000.
   3. Configure el programa de tracción. Los parámetros típicos del programa son: heat 614; vel 60; tiempo 1; presión de 600. Deben ajustarse de acuerdo con el modelo de tirador y la resistencia de calefacción empleada.
   4. Coloque el capilar en los soportes del tirador y apriételos.
   5. Inicie el programa y tome los dos microcapilares tirados.
   6. Cortar la punta capilar a mano, con un bisturí, bajo el estereomicroscopio para obtener una punta con un diámetro externo de 200-250 m.
   7. Coloque los capilares en un soporte de arcilla de modelado (por ejemplo, plasticina) en un plato de Petri cerrado y transfieralo a debajo del capó.
2. Configuración del capó y preparación de la solución del trazador de células
   1. Limpie la campana de flujo horizontal cuidadosamente y desinfecte con 70% de etanol.
   2. Desinfecte las fibras ópticas con 70% de etanol y colóquelas debajo del capó.
   3. Mezclar 10 ml de solución EGTA de 125 mM y 10 ml de verde rápido para preparar la "solución de trazador celular" y colocarla debajo del capó.
   4. Corte piezas pequeñas (4 cm x 2 cm de tamaño) de película de sellado de laboratorio para el manchado de suspensión celular.
   5. Preparar una solución de 1 mg/ml de doxiciclina estéril y aspirarla en una jeringa de 0,3 ml.
   6. Encienda el capó y mantenga el flujo laminar encendido durante 20 minutos antes de la operación.
3. Montaje del tubo de inyección
   1. Tome una boquilla de plástico duro, dos tubos de látex (cada uno de unos 30 cm de largo) y un soporte capilar de un kit de montaje de tubo de aspirador para pipetas microcapilares calibradas.
   2. Fije la boquilla de plástico duro a un extremo de un tubo de látex.
   3. Fije el soporte capilar a un extremo de otro tubo de látex.
   4. Conecte los extremos libres de los dos tubos de látex con un filtro estéril de 0,45 m, como barrera contra los gérmenes del operador.
   5. Coloque el conjunto de tubo del aspirador resultante en un soporte de arcilla de modelado que se mantenga debajo del capó.

3. Mezcla celular y trasplante intraventricular

1. Mezcla de subpools de células verdes "test" y "control"
   1. Recoger las neuroesferas de "prueba" y "control" (ver paso 1.2.5) en tubos separados de 1,5 ml.
   2. Suspensión de las neuroesferas centrífugas a 200 g durante 5 min.
   3. Recoger y desechar el sobrenadante, evitando la perturbación del pellet celular.
   4. Resuspenda suavemente las neuroesferas en 500 ml de 1pbS.
   5. Centrifugarlos a 200 g durante 1 min.
   6. Retire el sobrenadante.
   7. Repita los pasos 3.1.4-3.1.6 dos veces más.
   8. Resuspenda suavemente las esferas en 200 ml de 2 x solución de trippsina (2x trypsin, 1x PBS) y pellets de células pipetas arriba y abajo 4x-5x.
      NOTA: Preste atención para no hacer burbujas de aire.
   9. Deje las células en la incubadora durante 5 min a 37 oC para lograr una suspensión de una sola célula.
   10. Bloquear la trippsina con 200 l de solución inhibidora de la trippsina (DMEM-F12, 10 g/ml de DNAse I, 0,28 mg/ml de inhibidor de trippsina) pipeteando 4 veces y hacia abajo 4 veces y más abajo.
   11. Células centrífugas a 200 x g durante 5 min y resuspenderlas en 1 ml de medio proliferativo fresco (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glucosa, 2 g/ml de heparina, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x pen-strep, 10 pg/mL de anfotericina B).
   12. Cuente las celdas de las dos piscinas con el método de exclusión azul trypan en una cámara de B-rker.
   13. Ajustar su concentración a 100.000 células/L en medio proliferativo.
   14. Mezclar las células de "prueba" 1:1 con las de "control".
   15. Compruebe la mezcla resultante bajo un microscopio de fluorescencia (ampliación objetiva: 10x) para asegurarse de que la mezcla es una suspensión de una sola célula de las dos piscinas (Figura3C).
   16. Coloque la mezcla sobre hielo debajo de la capucha.
2. Trasplante intraventricular
   1. Prepare la jaula con la madre y los cachorros P0 en una mesa lejos de la zona del operador quirúrgico.
   2. Coloque una jaula de recuperación en un carro cerca de la capucha.
   3. Coloque una mezcla de aserrín extraída de la jaula de la madre en la parte inferior de la jaula de recuperación y colóquela debajo de una lámpara.
   4. Aun así, ponga una caja de hielo cubierta por una lámina de aluminio para la anestesia de cachorros P0.
   5. Justo antes del trasplante, agregue 1/10 volumen de solución de trazador celular (desde el paso 2.2.3) a 1 volumen de suspensión celular (desde el paso 3.1.16) y detecte 3 l de la "mezcla de inyección" resultante en una pieza de película de sellado de laboratorio.
   6. Coloque el cachorro en la lámina de aluminio fría durante 1 min y compruebe que esté completamente anestesiado.
      NOTA: Para confirmar la anestesia, apriete suavemente una pata y controle el cachorro en busca de falta de movimientos, mientras respira.
   7. Mientras tanto, aspirar los 3 l de mezcla de inyección (del paso 3.2.5) en el capilar de vidrio.
   8. Limpie suavemente la cabeza del cachorro anestesiado con un 70% de etanol.
   9. Coloque la barbilla del cachorro en la punta de la fibra óptica para identificar claramente los hemisferios corticales.
      NOTA: En P0-P1, la piel de la cabeza es muy delgada, lo que permite una identificación visual directa de los hemisferios justo por encima de los globos oculares y detrás de las bombillas olfativas.
   10. Mantener el capilar (cargado como se describe en el paso 3.2.7) en cualquiera de los dos planos de medio parasagittal (izquierda o derecha), por encima de la bombilla olfativa, y perforar la piel de la frente en su intersección con el plano frontal que contiene los centros de los globos oculares. Preste atención para no dañar los vasos sanguíneos. Introduzca el capilar en la corteza frontal y acceda a la cavidad ventricular (Figura4A).
   11. Para evitar daños accidentales de la eminencia gangliónica, gire la aguja lateralmente 30 grados, apuntando su punta caudal-medial-ward (Figura4B).
   12. Inyecte suavemente las células en la cavidad ventricular y monitoree su difusión por medio de Fast Green (Figura4C).
   13. Espera 5-10 s.
   14. Retire la aguja de vidrio teniendo cuidado de no aspirar la suspensión de la célula y deseche la aguja en un recipiente de eliminación adecuado.
   15. Antes de la recuperación del cachorro de la anestesia, inyecte 150 ml de solución de doxiciclina por vía intraperitoneal para mantener la expresión del transgén todavía desactivada después del trasplante.
   16. Después de la inyección, coloque el cachorro inmediatamente debajo de la lámpara para su recuperación.
   17. Dejar los cachorros debajo de la lámpara durante 5-10 minutos y, una vez completamente despierto, colocarlos en la jaula con la madre.
   18. Observe los cachorros operados durante 2-3 h, para asegurarse de que la madre los acepta.
   19. Suministrar a la jaula agua potable que contenga 0,5 mg/ml de doxiciclina y sacarosa de 50 g/L para mantener la expresión transgénica desactivada.
   20. Sustituya el agua que contiene doxiciclina por agua sin doxi4 días después del trasplante, activando así el transgén en las neuronas postmitóticas. Mantener a los ratones en un régimen libre de durante 6 días y eutanasiarlos en P10 por inhalación de dióxido de carbono seguida de decapitación.

4. Análisis de cerebros trasplantados

1. Histología e inmunofluorescencia
   1. Eutanasia los cachorros trasplantados 10 días después del trasplante de células por inhalación de dióxido de carbono seguido de decapitación. Arreglar cerebros de cachorros eutanasiados en 4% paraformaldehído (PFA) a 4 oC durante la noche.
      ADVERTENCIA: La PFA es altamente tóxica; manejarlo con cuidado, cumpliendo estrictamente con las prescripciones del fabricante, bajo una campana de humo químico; desechar el residuo de solución de PFA en un contenedor de residuos etiquetado.
   2. Retire la solución de PFA y reemplácela por una solución de sacarosa al 30%.
   3. Dejar los cerebros a 4 oC o hasta que se hundan hasta el fondo del vial.
   4. Transfiera los cerebros a un molde de incrustación desechable aproximadamente medio lleno de medio crio-incluido.
   5. Congela los cerebros incluidos a -80 oC.
   6. Corta secciones coronales de 60 m de espesor usando un criostato.
      NOTA: Evite emplear secciones más delgadas, ya que esto puede resultar en una pérdida inaceptable de información con respecto a toda la arquitectura de las neuronas individuales.
   7. Secciones de proceso para inmunofluorescencia^18,19, utilizando anticuerpos anti-GFP [1:400] y anti-RFP (mCherry) [1:500]. Núcleos de contrastaína con solución DAPI de 1 mg/ml [1:200].
2. Morfometría
   1. Establezca los parámetros de trabajo del microscopio confocal de la siguiente manera: altura de la pila z a 40 m; paso 2 m.
   2. Recoger imágenes de rebanadas inmunoensayos seleccionando campos fotográficos ricos en neuronas positivas de GFP, ciegos de distribución de señal RFP.
   3. Exporte las imágenes como archivos .nd2.
   4. Generar proyecciones Z máximas de ellos como archivos .tiff (Figura5A).
   5. Para permitir la esquelización neuronal subsecuencial ciega al genotipo de las células, oculte la señal roja. Para ello, abra cada archivo .tiff con un software adecuado y agregue una capa de ajuste. Seleccione "levels", "red", luego establezca "output" en cero. Guarde el archivo como tal.
      NOTA: La esqueletización se realiza posteriormente por un operador nuevo que no tenía acceso previo a los archivos rojos sin formato originales.
   6. Para cada archivo rojo oculto, añada una capa de dibujo a la imagen principal y seleccione la herramienta lápiz (color blanco). Rastrear el soma sobre la base de la señal GFP, luego rastrear los neurites.
      NOTA: la herramienta de lápiz se puede ajustar en 40 píxeles para el soma y en tres píxeles para los neuróitas.
   7. Guarde el archivo multicapa, incluidas las siluetas neuronales (Figura5B).
      NOTA: Cualquier operador puede realizar un análisis posterior del esqueleto neuronal.
   8. Crea un nuevo archivo de escala de grises de 1024 x 1024 de 16 bits con fondo negro, uno por neurona.
   9. Copie y pegue siluetas neuronales individuales de la imagen principal al nuevo archivo en escala de grises. Vuelva al archivo multicapa y desactive la capa de ajuste para desvelar los genotipos neuronales. Guarde el archivo en escala de grises de 16 bits que anota el genotipo neuronal correspondiente.
   10. Importe imágenes en escala de grises en ImageJ una por una y analice esqueletos mediante el plugin NeurphologyJ del software ImageJ²⁰ (Figura 5C).
   11. Copiar datos primarios de NeurphologyJ (neurite_length, attachment_points y endpoints; para cada uno, tomar valores de "área total", pegarlos en una hoja de cálculo y emplearlos para calcular parámetros morfométricos secundarios ( longitud mediade la neurita, índice de ramificación) (Figura5D).

Resultados

Existen cinco conjuntos de datos principales que proporcionan información útil sobre aspectos clave del procedimiento, siendo el primero (1) la eficiencia de la transducción de precursores neuronales y la co-transducción por vectores lentivirales. (2) Un ejemplo de las características clave de los promotores empleados para impulsar el "gen de prueba". (3) Un ejemplo de células de ingeniería listas para el trasplante. (4) Una caricatura que incluye los detalles procesales clave de l...

Discusión

Los aspectos/pasos específicos de este procedimiento son críticos y requieren una atención especial. En primer lugar, (a) los operadores deben estar adecuadamente preparados para manipular de forma segura los lentivirus en un entorno de laboratorio compatible con BSL-2. En segundo lugar, b) antes de mezclar las preparaciones neuronales de "prueba" y "control", es obligatorio lavar cuidadosamente las dos suspensiones de neuroesfera correspondientes como se describe, con el fin de prevenir cualquier infección cruzada r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL syringe	BD	320840	store at RT
0.45 μm sterile filter	Millex-HV	SLHU033RS	store at RT
12 multiwell plate	Falcon	353043	store at RT
1X PBS	Gibco	14190-094	store at RT
24 multiwell plate	Falcon	351147	store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416	Tebubio	GTX13970	store at -20 °C
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839	Antibodies Online	ABIN334653	store at -20 °C
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773	Covance	MMS-435P	store at -20 °C
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA	store at RT
Blue light lamp	Nightsea	BLS2	store at RT
Borosilicate capillaries	Kwik-Fil	TW150-4	store at RT
BSA	Sigma	A9647	store at -20 °C
Bürker chamber	Sigma	BR719520	0.0025 mm2, 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik)	Bio-Optica	05-9801	store at RT
DAPI	Sigma	D9542	store at -20 °C
Disposable embedding mold	Bio-Optica	07MP7070	store at RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	store at +4 °C
Dnase I	Roche	10104159001	store at -20 °C
Doxycicline	Sigma	D1822	store at -20 °C
Dumont forceps #3c	Fine Science Tools	11231-20	store at RT
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-20	store at RT
EGF	Gibco	PHG0311	store at -20 °C
EGTA	Sigma	E3889	store at RT
FGF	Gibco	PHG0261	store at -20 °C
Fine scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	store at RT
Fungizone (Amphotericin B)	Gibco	15290018	store at -20 °C
Glucose	Sigma	G8270	store at RT
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488	Invitrogen	A11039	store at -20 °C
Goat anti-rat Alexa 594	Invitrogen	A11007	store at -20 °C
Heparin Solution	Stem Cell Technologies	07980	store at -20 °C
N2 Supplement	Gibco	17502048	store at -20 °C
Optical fibers	Leica	CLS150X
P1000 puller	Sutter Instruments	P-1000 model
Parafilm	Bemis	PM-996	store at RT
Pen Strep	Sigma	P0781	store at -20 °C
Petri dish	Falcon	353003	store at RT
PFA	Sigma	158127	store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	store at -20 °C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	built in house		store at -20 °C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	built in house		store at -20 °C
Scalpel	Braun	BB515	store at RT
Steromicroscope	Leica	MZ6	store at RT
Trypan blue	Gibco	15250-061	store at RT
Trypsin	Gibco	15400-054	store at -20 °C
Trypsin inhibitor	Sigma	T6522	store at -20 °C