في فيفو ثلاثي الأبعاد اثنين فوتون المجهري لدراسة الاستجابات الوعائية التي أجريت من قبل طرد ATP المحلية باستخدام الزجاج الماصة الصغيرة

Summary

نقدم إجراء طرد محلي محسّن باستخدام ماصة زجاجية صغيرة وطريقة تصوير سريعة من اثنين من الفوتونات، والتي تسمح بقياس دقيق للتغيرات في القطر الشعري والتحقيق في تنظيمه في ثلاثة أبعاد.

Abstract

الحفاظ على وظيفة الدماغ العادية يتطلب إمدادات كافية وفعالة من الأكسجين والتغذية من قبل شبكة معقدة من السفن. ومع ذلك، فإن تنظيم تدفق الدم الدماغي (CBF) غير مفهوم بشكل كامل، وخاصة على المستوى الشعري. اثنين من الفوتون المجهري هو أداة قوية تستخدم على نطاق واسع لدراسة CBF وتنظيمها. حاليا، هذا المجال محدود بسبب عدم وجود دراسات في الجسم الحي باثنين من الفوتون المجهري دراسة (1) استجابات CBF في ثلاثة أبعاد، (2) الاستجابات الوعائية، (3) التدخلات المحلية داخل شبكة الأوعية الدموية. هنا، ونحن نصف 3D في طريقة الجسم الحي باستخدام مجهرية اثنين فوتون لدراسة الاستجابات الوعائية التي أجريت الناجمة عن طرد المحلية من ATP مع الزجاج الماصة الدقيقة. تستخدم طريقتنا التصوير السريع والمتكرر باثنين من الفوتونات لتوفير قياسات دقيقة للقطر من خلال الإسقاط الكثافة القصوى للصور التي تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، فإننا نظهر أن هذه الطريقة يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة استجابات الكالسيوم الفلكية 3D. كما نناقش مزايا وقيود إدراج الماصة الصغيرة الزجاجية والتصوير باثنين من الفوتونات هايبرستاك.

Introduction

الدماغ لديه معدل استهلاك الطاقة عالية. حوالي 20٪ من الأكسجين و 25٪ من الجلوكوز المستهلكة من قبل جسم الإنسان مكرسة لوظيفة الدماغ، في حين أن الدماغ لا يحتل سوى 2٪ من كتلة الجسم الإجمالية. الحفاظ على وظيفة الدماغ الطبيعية يتطلب إمدادات كافية وفعالة من الأكسجين والتغذية عن طريق تدفق الدم في شبكة معقدة من الأوعية. يتم الجمع بين نشاط الدماغ المحلي وتدفق الدم الدماغي (CBF) بقوة، اعتمادا على الخصائص الوظيفية للخلايا العصبية، الخلايا النجمية، pericytes، خلايا العضلات الملساء (SMCs) والخلايا البطانية (ECs)¹. في الآونة الأخيرة، ظهرت أول عدد قليل من أوامر الشعيراتالدموية المتفرعة من الأرتيريولس اختراق ك 'نقطة ساخنة' 2، مما يدل على تنظيم نشط لتدفق الدم الشعرية. تم اكتشاف استجابة الأوعية الدموية بطيئة أجريت (CVR) في هذه 'نقطة ساخنة' في القشرة الحسية الجسدية الماوس خلال كل من تحفيز شعيرات وطرد المحلية (النفخ) من ATP مع الزجاج الماصة الدقيقة³.

على الرغم من أن التصوير في الجسم الحي بواسطة اثنين من الفوتون اتّشِر المجهري الفلورسنت على نطاق واسع لدراسة استجابات الأوعية الدموية العصبية في القشرة الدماغية، فإن معظم الدراسات قامت بقياس أقطار الأوعية الدموية وبحثت في تنظيمها في ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) × y مستوى. التحديات هي: أولا، والأوعية الدموية الدماغية واحتضانها الخلايا النجمية، pericytes والشركات الصغيرة والمتوسطة بناء فروع في ثلاثة أبعاد (3D). ولذلك فمن الأهمية بمكان دراسة تفاعلاتها في 3D. ثانيا، حتى كمية صغيرة من الانجراف في التركيز سوف تؤثر على القياس الدقيق لكل من أقطار السفن وإشارات الفلورسنت الخلوية. وأخيراً، فإن تقارير السير الذاتية سريعة وبعيدة المدى في ثلاثة أبعاد. المسح الضوئي للحجم ثلاثي الأبعاد هو الأمثل للكشف عن CVRs والكشف عن آلياتها. نفذنا هدف محرك بيزو في المجهر اثنين من الفوتون لدراسة الماوس القشرة الحسية الجسدية في الجسم الحي، مما يسمح قياسات قطر دقيق من قبل التوقعات كثافة قصوى من الصور التي تم الحصول عليها.

وقد استخدمت في كثير من الأحيان الزجاج الماصات الصغيرة لفي دراسات الدماغ فيالجسم الحي، على سبيل المثال، لتحميل الجزء الأكبر الأصباغ العضوية 4، سجل EEGs⁵ والتصحيح لقط^6. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود. عادة، يتم وضع طرف الماصة الصغيرة الزجاج بشكل غير دقيق، أو لا يتم استخدام الماصة الصغيرة للتدخلات المحلية. هنا، قمنا بتحسين إجراء الإدراج الماصة الدقيقة والإخراج المحلي.

وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين الفحص المجهري ثلاثي الدناضوئي والمؤشرات الفلورية المشفرة وراثياً يوفر فرصة غير مسبوقة للتحقيق في اقتران الأوعية الدموية العصبية في نطاق ثلاثي الدمركبة. في هذه الدراسة، استفدنا من هذا وحقن ناقلات الفيروسية تحمل مؤشرات الكالسيوم محددة وراثيا ترميز وراثيا في القشرة الحسية الماوس. تم تصوير الخلايا النجمية وكذلك أقطار الأوعية في وقت واحد من خلال الجمع بين علامات الفلورسنت المختلفة.

بشكل عام، نقدم طريقة محسنة للطرد المحلي (النفخ) بواسطة الماصة الزجاجية الدقيقة والتصوير السريع ثنائي الفوتون hyperstack، والذي يسمح بقياس دقيق للتغيرات في القطر الشعري. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا طريقة توفر أداة جديدة لدراسة في وقت واحد ملامح 3D من الاستجابات Ca^{2 +} في الخلايا النجمية والاستجابات قطر الأوعية الدموية.

Protocol

وافقت اللجنة الوطنية الدانمركية للأخلاقيات على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقاً للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في اتفاقية المجلس الأوروبي لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة في الأغراض التجريبية وغيرها من الأغراض العلمية. كانت متوافقة مع المبادئ التوجيهية للوصول. هذا هو إجراء المحطة الطرفية مع الفئران يجري القتل الرحيم قبل الانتعاش مخدر.

1. التحضير قبل الجراحة

1. تنظيف الجدول الجراحي وجميع المناطق المحيطة بها مع الإيثانول 70٪. تنظيف وتجفيف الأدوات الجراحية قبل الجراحة.
2. التخدير ماوس NG2DsRed (Tg (Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J؛ كلا الجنسين؛ 4-8 أشهر من العمر) عن طريق حقن الكيتامين الكليوم + xylazine (60 ملغ / كغ + 10 ملغ / كغ) المذابة في الماء المعقم، الرقم الهيدروجيني 7.4. إعطاء جرعات تكميلية من الكيتامين (30 ملغ / كغ) كل 25 دقيقة حتى الانتهاء من العملية الجراحية. تحقق من ردود الفعل التي للمُل وأصابع القدم بانتظام للتحقق من عمق التخدير.
3. حقن ملحي تحت الجلد في أربعة مواقع مختلفة على الجزء الخلفي من الماوس لحجم إجمالي 1 مل لمنع الجفاف أثناء التجربة. لحماية العينين من الجفاف، وتطبيق زيوت التشحيم العين. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية باستخدام مسبار درجة حرارة المستقيم وبطانية التدفئة.

2. العمليات الجراحية

1. فغر الرغامى
   1. ضع الفأر على ظهره. حقن 0.04 مل من 0.5٪ ليدوكائين تحت الجلد تحت الجلد تحت الشق المخطط لها والانتظار لمدة 2 دقيقة. فصل الغدد تحت الفك السفلي وعضلات الغدة الدرقية، ومن ثم فضح القصبة الهوائية.
   2. جعل القصبة الهوائية بين اثنين من حلقات القصبة الهوائية مع مقص. أدخل أنبوبمعدني صغير بطول 16.2 مم وقطره 1 مم في القصبة الهوائية. ربط الأنبوب إلى جهاز التنفس الصناعي الميكانيكية وcapnograph لمراقبة CO₂ نهاية منتهية الصلاحية (الشكل1A).
2. إدخال القسطرة
   1. حقن 0.5٪ ليدوكائين (0.04 مل) تحت الجلد تحت الجلد تحت الشق المخطط لها والانتظار لمدة 2 دقيقة.
   2. باستخدام ملقط طرف غرامة بلطف فصل الشريان من الوريد. وقف تدفق الدم في المنبع مع المشبك الأوعية الدموية الدقيقة. تضيق تدفق الدم في المصب مع خياطة النايلون 10-0 ربط كلتا الأوعية الدموية.
   3. استخدم مقص تشريح دقيق لإجراء شق صغير في كل من الشريان والوريد. أدخل القسطرة البلاستيكية في كلتا الأوعية الدموية. تأمين القسطرة عن طريق تشديد الغرز (8-0 أو 10-0 الغرز النايلون تعتمد على حجم السفينة) دون المساس التجويف القسطرة. إزالة المشبك الأوعية الدموية الدقيقة وإغلاق الجلد.
   4. مراقبة ضغط الدم عن طريق القسطرة الشريانية. قياس مستويات غازات الدم في عينات الدم الشريانية (50 ميكرولتر) قبلوبعد كل تجربة (القيم العادية: pO 2، 90-120 مم زئبق؛ pCO_2،35-40 mmHg؛ درجة الحموضة، 7.25-7.45) باستخدام محلل غاز الدم. استخدم قسطرة الوريد لضخ الفلورسين والتخدير.
3. استئصال الجمجمة
   1. انزعي الفراء من رأس الفأر بين الأذنين. حقن 0.04 مل من 0.5٪ ليدوكائين تحت الجلد تحت الجلد تحت الشق المخطط لها والانتظار لمدة 2 دقيقة.
   2. مسح الجمجمة باستخدام محلول كلوريد الحديد 10٪ لإزالة periosteum. شطف الجمجمة جيدا مع المالحة. الغراء شريط الرأس المعدنية إلى الجمجمة مع الغراء cyanoacrylate والمنشط (الشكل1A).
      ملاحظة: يبلغ طول شريط الرأس المعدني 75 مم وعرضه 13.5 مم، مع ثقب دائري قطره 5 مم في المركز.
   3. حفر استئصال الجمجمة 4 مم قطرها، وتتركز في 0.5 ملم وراء و 3 ملم إلى يمين بريغما على القشرة برميل الحسية الحق. إزالة دورا مع متوسع السفينة غرامة غيض.
   4. تغطية القشرة المكشوفة مع هلام أغاروز 0.75٪، المذاب في السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (aCSF؛ درجة الحموضة = 7.4) وتبريدها إلى 35 درجة مئوية. تغطية 80-90٪ من استئصال الجمجمة مع غطاء زجاجي بزاوية 10-15 درجة إلى شريط الرأس المعدني (الشكل1ب)الذي يسمح بإدراج ووضع الزجاج الماصة الصغيرة.
   5. لتقليل نبض الدماغ، الغراء زوايا الزجاج coverslip على شريط الرأس المعدني مع الغراء cyanoacrylate والمنشط. تطبيق المنشط بعناية لمنع الحصول على الدماغ المعرضة. شطف غطاء الزجاج لصقها تماما مع المالحة بعد ذلك.
4. قم بإجراء إدخال مسبار تحفيز لوحة الشعيرات. إدراج مجموعة من الأقطاب القطبية ثنائية القطب حسب الطلب (طول 8 ملم وسمك 0.25 ملم) بشكل كتابي في الجانب الأيسر من الوجه لتحفيز الأشعة تحت المدارية راموس العصب ثلاثي التوائم المضادة لاستئصال الجمجمة. وضع الكاثود على مقربة من توقف الأشعة تحت المدارية، وإدراج الأنود في العضلات الماستورية⁷. أداء التحفيز مع محفز كهربائي في كثافة 1.5 مللي ثانية ل1 مللي ثانية في القطارات من 20 ثانية في 2 هرتز.
5. عند الانتهاء من الجراحة، وإدارة بولوس من 0.05 مل الفلوريسين إيزوثيوسيانات-dextran (FITC-dextran، 4٪ ث / الخامس، الوزن الجزيئي [MW] 50،000) في الوريد الفخذي لتسمية بلازما الدم. وقف الكيتامين وتبديل التخدير إلى التسريب الوريدي المستمر من α-كلورالوز (17٪ ث / الخامس، التركيز النهائي) مختلطة مع FITC-dextran (2٪ ث / الخامس، التركيز النهائي) في 0.02 مل / 10 غرام / ساعة. حالة التخدير.
   ملاحظة: يتم حل كل من فيتك-دإكستران وα-كلورالوز في 0.9٪ محلول ملحي.

3. أول جلسة تصوير بفوتونين

1. نقل الماوس إلى مرحلة مجهر تجاري اثنينفوتون (جدول المواد). تحت كل من البروتين الفلورسنت الأحمر (RFP، الشكل 1C) والبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP، الشكل 1C)وسائط الإضاءة epi-الفلورسنت، واتخاذ صورة للقشرة المكشوفة مع هدف 5X. استخدم صورة RFP كـ "خريطة" لإدخال الماصة الزجاجية الدقيقة في الجلسة التالية.
   ملاحظة: يتم استخدام "خريطة" GFP للتمييز بين الأوردة / الوريد من الشرايين / arterioles.
2. قم بإجراء تصوير بفوتونين باستخدام المجهر ذي الفوتونات وهدف غمر المياه بالفتحة العددية 25x 1.0 مع محرك بيزو. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 900 نانومتر. البحث في القشرة واتبع كل الشريان اختراق والعثور على فروعها الأفقية (1^st ترتيب الشعيرات الدموية).
3. صورة اختراق arterioles و1^st ترتيب الشعيرات الدموية في بقية وخلال تحفيز لوحة شعيرات. راجع معلمات التصوير التفصيلية في القسم 5.
4. وضع علامة على مواقع الشعيرات الدموية من الدرجة^الأولى مع > 5٪ توسع الأوعية أثناء تحفيز وسادة الشعيرات على 'خريطة' RFP (الشكل1C). تعتبر المواقع مع <5% توسع الأوعية خارج منطقة قشرة برميل الشعيرات.
   ملاحظة: في حالة استخدام الفئران من النوع البري بدلاً من الفئران NG2DsRed في التجربة، يتم استخدام صورة GFP كـ 'خريطة' بدلاً من ذلك.

4. إدراج الزجاج الماصة الصغيرة

1. إعداد الزجاج الماصات الصغيرة للنفخ باستخدام سحبماصة (جدول المواد). الزجاج الماصات الصغيرة لديها مقاومة من 3-3.5 MΩ وطول تفتق من 4.5-5 ملم.
2. جبل الزجاج مايكرو ماصة على حامل المشبك التصحيح وتوصيله إلى مضخة الهواء. تعيين ضغط المضخة عقد إلى 0 رطل لكل بوصة مربعة.
3. باستخدام الإضاءة الحمراء epi-الفلورسنت، والتركيز على طرف ماصة مع الهدف 5X. ضع الماصة الزجاجية الدقيقة في الـ aCSF فوق الأجاروز. ضبط ضغط عقد مضخة الهواء إلى 0.2 رطل لكل بوصة مربعة. يمكن ملاحظة سحابة حمراء صغيرة تخرج من طرف الماصة في aCSF. هذا هو لمنع انسداد أثناء الإدراج ماصة.
4. اختر أحد المواقع التي تم وضع علامة عليها في "خريطة" RFP كوجهة. نقل طرف ماصة إلى المستوى الأفقي من حافة الزجاج غطاء مع مسافة 30 درجة مئوية، مشيرا تقريبا نحو الوجهة في مستوى س ص.
5. خفض بعناية غيض ماصة في z-محور تحت غطاء الزجاج زلة. ثم البدء في التقدم في ماصة الزجاج نحو الوجهة حتى ~ 500 ميكرومتر فوق سطح الدماغ. تبديل التركيز في كثير من الأحيان بين حافة الزجاج الغطاء، وطرف ماصة وسطح الدماغ، والتأكد من أن هناك مساحة حرة كافية لنقل ماصة.
6. تبديل الهدف إلى 25x. إعادة توسيط طرف الماصات وتقدمت طرف ماصة أبعد نحو الوجهة على "خريطة" RFP. احتفظ بطرف الماصة في طبقة الأجاروز.
7. عندما يكون طرف الماصات حوالي 100 ميكرومتر فوق سطح الدماغ، قم بتبديل وضع التصوير إلى مجهرية بفوتونين. التركيز على الموقع المستهدف الذي لنفخة. اكتب إحداثيات x و y (x₀، y₀) وعمقها أسفل السطح (z₀). حساب إحداثيات نقطة الإدراج على سطح الدماغ (x_i, y_i)على النحو التالي:
   x_i = x ₀ + z₀ / تان θ
   y_i = y₀
   حيث θ هو الزاوية بين حامل الماصة والمستوى الأفقي.
8. ضع طرف الماصة على الإحداثيات (x_i, y_i)على سطح الدماغ. بلطف وببطء إدراج ماصة حتىتصل (x 0، y_0،z_0). إذا كانت السفينة في طريق مسار الإدراج، سحب ماصة وإعادة حساب إحداثيات الإدراج الأخرى والمسار؛ أو تحويل لوحة المرحلة قليلا (كما هو مبين في الشكل 1A).
9. تعيين ضغط المضخة عقد في 0 رطل لكل بوصة مربعة والضغط طرد في 10-15 رطل لكل بوصة مربعة. نفخة ATP ل200-400 مللي ثانية في الموقع المستهدف خلال التصوير باثنين من الفوتون. ضبط الضغط ومدة النفخ لكل ماصة ومع مرور الوقت كما هو موضح في قسم المناقشة.

5. هايبرستاك اثنين من الفوتون التصوير

1. إجراء التجارب باستخدام المجهر اثنين فوتون و25 × 1.0 NA المياه الغمر الهدف مع محرك بيزو. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 900 نانومتر. تصفية الضوء المنبعث لجمع الضوء الأحمر من DsRed (pericytes)/tetramethylrhodamine إيزوثيوسيانات-ديإكسترون (TRITC-dextran) تلطيخ بلازما الدم والضوء الأخضر من FITC-dextran (بلازما الدم)/GCaMP6 (GFP، الكالسيوم الفلكي).
2. إنتاج عالية الدقة z-المكدس في موقع الفائدة التي تحتوي على الشريان اختراق، 1^st ترتيب الشعرية، و2^nd ترتيب الخلايا الشعرية وربما المجاورة (على سبيل المثال، pericytes، الخلايا النجمية). حدد حجم x*y*z من التصوير الفائق المكدس من خلال تضمين الهيكل ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية قدر الإمكان. قد يختلف الارتفاع الإجمالي لكل كومة من 30-50 ميكرومتر، في حين أن الطائرة x-y تغطي تقريبا مساحة 60 ميكرومتر × 40 ميكرومتر.
3. تعيين كومة الصورة في برنامج التصوير لتكون تتألف من 8-10 طائرات مع مسافة بين الطائرات من 4-5 ميكرومتر. يتوقف الهدف بيزو موتور في كل مستوى على محور z للحصول على صورة كل طائرة. معدل أخذ العينات هو 1 ثانية لكل كومة ودقة بكسل في مستوى x-y هو 0.2-0.3 ميكرومتر (الشكل2A). يتضمن تسجيل واحد عادة 10 مكدسات صور ما قبل النفخة و 150 مكدسات صور ما بعد النفخة.

6 - تجهيز البيانات

1. معالجة البيانات باستخدام برامج تحليلية مخصصة. تسطيح كل كومة صورة في صورة واحدة عن طريق الإسقاط كثافة قصوى (الشكل2ب). رسم منطقة مستطيلة ذات أهمية (ROI) بعرض 3 ميكرومتر عمودياً عبر وعاء الفائدة (الشكل2C).
2. لتقليل التداخل من ظلال خلايا الدم الحمراء ومن الاهتزازات الطفيفة للقشرة، متوسط عائد الاستثمار المستطيل عن طريق إسقاطه في سطر واحد، والذي يمثل بعد ذلك متوسط ملف تعريف الجزء من السفينة. القيام بذلك لكل صورة كثافة قصوى.
3. رسم خطوط الملف الشخصي كصورة 2D مع محور س يمثل الصور كثافة قصوى في الترتيب الزمني (الشكل2D،اللوحة العليا). استخدام خوارزمية كفاف نشطة (تشان فيسي التقسيم) للعثور على حواف السفينة^8،9 (المشار إليها من قبل منحنيات حمراء؛ الشكل 2 D،اللوحة العلوية).
4. حساب مسار الوقت من قطر يتغير كما الفرق بين حواف الأوعية الدموية (المسافة الرأسية بين المنحنيات الحمراء العليا والسفلى في الشكل 2D،لوحة أقل). تطبيع التغيرات القطر إلى خط الأساس قبل النفخ قطر ومنحنى مؤامرة من قطر تغيير مع مرور الوقت. القيام بذلك لكل عائد الاستثمار (الشكل2E).
5. يتم تعريف سعة استجابة السفينة على أنها أعلى / أدنى السعة الذروة بعد النفخ. يتم تعريف زمن الوصول استجابة كما الكمون من السعة نصف ماكس (الشكل2G). تتبع يدويا هيكل الأوعية الدموية الهيكل العظمي عن طريق وضع العقد على طول السفن (الشكل2F)وقياس المسافة الجغرافية بين كل عائد الاستثمار والشريان اختراق. حساب سرعة CVR عن طريق تقسيم المسافات حسب فروق زمن الوصول.

7. حقن ناقلات الفيروسية

1. من أجل دراسة استجابات الكالسيوم الفلكية في وقت واحد، حقن حجم من متجه الفيروسية 0.6 ميكرولتر (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f، Addgene) في القشرة الحسية الجسدية للفئران NG2DsRed، بعد إجراء حقن ناقلات مجسمة مجسمة القياسية ¹⁰.
2. بعد ثلاثة أسابيع، عبّرت الخلايا النجمية في قشرة السماتوالحسية الماوسة عن مؤشر الكالسيوم المرمز وراثياً، GCaMP6f. اتبع العملية الجراحية المذكورة أعلاه والتصوير بالفوتونللفئران. للتمييز بين الخلايا النجمية وlumina السفينة، يستخدم TRITC-dextran بدلا من FITC-dextran لوصمة عار السفينة لومينا الحمراء.

النتائج

وبمجرد الانتهاء من الجراحة، تم نقل الفئران إلى المجهر اثنين من الفوتون (الشكل1A). وأدخلت ماصة زجاجية صغيرة تحتوي على 1 mM ATP على مقربة من الأوعية الدموية الوجهة في الموقع المستهدف (الشكل1باء).

قمنا بإجراء التصوير hyperstack في حين إ?...

Discussion

أحد التحديات التي يواجهها دراسات الأوعية الدموية هو القياس الدقيق لأقطار الأوعية الدموية. الطريقة التي نصفها هنا تستخدم هدف بيزو الآلية لجعل التصوير hyperstack سريعة ومتكررة عن طريق التصوير المجهري اثنين فوتون. أولا، يسمح هذا الأسلوب الفحوصات المتكررة للأرتيريول اختراق، 1^st النظام و2 ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828