In vivo üç boyutlu Iki-foton mikroskobu çalışma bir cam mikro-pipet kullanarak yerel ATP ejeksiyon tarafından vasküler tepkiler yürütülen eğitim

Özet

Cam mikro-pipet ve hızlı iki foton hyperstack görüntüleme yöntemi kullanarak optimize edilmiş bir yerel fırlatma prosedürü sunacağız, bu da kapiller çapı değişikliklerinin hassas ölçümünü ve yönetmeliğinin üç boyutta araştırmasını sağlar.

Özet

Normal beyin fonksiyonunun bakımı, karmaşık bir damar ağı ile yeterli ve verimli oksijen ve beslenme kaynağı gerektirir. Ancak, serebral kan akışının düzenlenmesi (CBF), özellikle kapiller düzeyinde tamamen anlaşılır. İki foton mikroskopisi, CBF ve yönetmeliğinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan güçlü bir araçtır. Şu anda bu alan, üç boyuttaki (2) CBF yanıtlarının incelenmesi (1) in vivo iki foton mikroskopi çalışmaları eksikliği ile sınırlıdır ve (3) vasküler ağ içinde lokalize müdahalelerdir. Burada, bir cam mikro-pipet ile ATP yerel ejeksiyon tarafından yapılmıştır vasküler tepkiler yürütülen incelemek için iki foton mikroskopisi kullanarak bir 3D in vivo yöntemi tarif. Yöntemimiz, elde edilen görüntülerin maksimal yoğunluk projeksiyonu ile hassas çap ölçümleri sağlayan hızlı ve tekrarlayan hiperyığın iki foton görüntüleme kullanır. Ayrıca, bu yöntem de 3D astrositik kalsiyum tepkiler okumak için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca cam mikro-pipet ekleme ve iki foton hyperstack görüntüleme avantajları ve sınırlamaları tartışıyoruz.

Giriş

Beynin yüksek enerji tüketimi oranı vardır. Yaklaşık 20% oksijen ve 25% insan vücudu tarafından tüketilen glikoz beyin işlevine adamıştır, beyin sadece kaplar ise toplam vücut kütlesi% 2. Normal beyin fonksiyonunun bakımı, karmaşık bir damar ağında kan akışı ile yeterli ve verimli oksijen ve beslenme kaynağı gerektirir. Yerel beyin aktivitesi ve serebral kan akımı (CBF) nöronlar, astrositler, perikayt, pürüzsüz Kas hücreleri (smcs) ve endotel hücreler (ECS)¹fonksiyonel özelliklerine bağlı olarak, sağlam birleştiğinde. Son zamanlarda, penetran arterioller dallanma kapiller ilk birkaç sipariş bir ' hotspot '²olarak ortaya çıktı, kılcal kan akışının aktif düzenleme gösteren. Yavaş yürütülen damar tepkisi (CVR) bu ' hotspot ', fare somatoduyusal korteks hem bıyık stimülasyon ve yerel ejeksiyon (PU,) ATP bir cam mikro-pipet³sırasında keşfedilen.

İki foton lazer tarama floresan mikroskopisi tarafından In vivo görüntüleme yaygın serebral korteks nörovasküler tepkiler okuyan için kullanılan olmasına rağmen, çalışmaların çoğu kan damar çapları ölçülen ve bir içinde düzenlemeleri incelenmiştir iki boyutlu (2D) x-y düzlem. Zorluklar şunlardır: Öncelikle, serebral kan damarlarında ve onların kucaklayan astrositler, perikayt ve SMCs üç boyutlu (3D) dalları inşa. Bu nedenle 3D etkileşimlerini incelemek çok önemlidir. İkincisi, odak kayması bile küçük bir miktar hem gemi çapları ve hücresel floresan sinyalleri kesin ölçümü etkiler. Son olarak, CVR 'Ler üç boyutta hızlı ve uzak bir şekilde ulaşmaktadır. 3B ses taraması, CVR 'Ler tespit etmek ve mekanizmalarını açıklama için idealdir. Fare somatoduyusal korteks in vivo çalışması için iki foton mikroskop içinde bir piezo motor amacı uyguladık, elde edilen görüntülerin maksimal yoğunluk projeksiyonlarına göre hassas çap ölçümleri sağlar.

Cam mikro-pipetler sık olarak in vivo beyin çalışmaları için kullanılan, örneğin, toplu yük organik boyalar⁴, kayıt EEGs⁵ ve yama sıkma⁶. Yine de, sınırlamalar kalır. Yaygın olarak, cam mikro-pipet ucu hassas bir şekilde yerleştirilir, ya da mikro-pipet yerel girişimler için kullanılmaz. Burada, mikro-pipet ekleme ve yerel fırlatma prosedürünü optimize ettik.

Ayrıca, 3D iki foton mikroskobu ve genetik olarak kodlanmış floresan göstergeleri kombinasyonu bir 3D kapsamda nörovasküler kavrama araştırmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. Bu çalışmada, bu ve enjekte viral vektörler astrosit spesifik genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri fare somatoduyusal korteks içine taşıyan yararlandı. Astrositler yanı sıra damar çapları farklı floresan işaretçileri birleştirerek aynı anda görüntülenmiş.

Genel olarak, cam mikro-pipet ve hızlı iki foton hyperstack görüntüleme ile yerel ejeksiyon (şişirme) için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz, bu da kılcal çap değişikliklerinin kesin ölçümünü sağlar. Buna ek olarak, bizim yöntemi aynı anda astrositler ve vasküler çap Tepkiler CA^{2 +} tepkiler 3D profilleri incelemek için yeni bir araç sağlar.

Protokol

Hayvanlar ile ilgili tüm prosedürler, Avrupa Konseyi 'nin deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan omurgadan hayvanların korunması sözleşmesi 'nde belirtilen yönergelere göre Danimarka Ulusal Etik Komitesi tarafından onaylandı ve GELMESI yönergelerine uygun idi. Bu farelerin anestezik iyileşmeden önce ötenize edilen bir Terminal prosedürü.

1. cerrahi öncesi hazırlık

1. % 70 etanol ile cerrahi masayı ve çevredeki tüm bölgeyi temizleyin. Ameliyattan önce cerrahi aletleri iyice temizleyin ve kurutun.
2. Anestezize bir NG2DsRed fare (TG (Cspg4-DSRed. T1) 1akik/J; her iki cinsiyette; 4-8 ay) bir periton enjeksiyonu ile ketamin + xylazine (60 mg/kg + 10 mg/kg) sterilize suda çözünmüş, pH 7,4. Cerrahi prosedürün tamamlanması kadar her 25 dakika ketamin (30 mg/kg) ek dozlarda yönetin. Anestezi derinliğini doğrulamak için düzenli olarak Kuyruk ve ayak tutam refleksleri kontrol edin.
3. Deneme sırasında dehidrasyon önlemek için 1 mL toplam hacmi için fare arkasındaki dört farklı yerlerde subkutan tuz enjekte. Gözleri kurutmadan korumak için göz yağlayıcıyı uygulayın. 37 °C ' de beden sıcaklığının Rektal sıcaklık sondası ve Isıtma battaniyesi kullanılarak sürdürülmesi.

2. cerrahi prosedür

1. Trakeotomi
   1. Fareyi arkasına yerleştirin. Planlanan kesi altında subkutan altında 0,04 ml 0,5% lidokain enjekte ve 2 dakika bekleyin göğüs kemiği (manubrium) üzerinde 10 mm uzunluğunda kesi yapın. Submandibular bezleri ve sternotiroid kasları ayırın ve sonra trakea açığa.
   2. Makas ile iki trakeal yüzük arasında trakeostomi yapın. 16,2 mm uzunluğunda küçük bir metal tüp ve trakeaya 1 mm çap yerleştirin. End-expiratory CO₂ (Şekil 1a) izlemek için tüp mekanik bir ventilatör ve capnograph bağlayın.
2. Kateter ekleme
   1. Planlanan kesi altında% 0,5 lidokain (0,04 mL) subkutan enjekte ve 2 dakika bekleyin.
   2. İnce uçlu forseps kullanarak arter damardan hafifçe ayırın. Bir mikrovasküler kelepçe ile kan akışını upstream durdurun. İki kan damarına bağlanarak 10-0 naylon sütür ile kan akışını aşağı yukarı sıkışın.
   3. Hem arter hem de ven küçük bir kesi yapmak için mikro-Diseksiyon makas kullanın. Her iki kan damarına plastik kateter takın. Sütürler sıkılarak kateterleri koruyun (8-0 veya 10-0 naylon sütürler damar boyutuna bağlı olarak) kateter lümen ödün vermeden. Mikrovasküler kelepçeyi çıkarın ve cildi kapatın.
   4. Arter kateter yoluyla kan basıncını izleyin. Kan gazı analizörü kullanılarak, her denemede (normal değerler: pO₂, 90-120 mmHg; PCO₂, 35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45), arter kan örneklerinde (50 μL) kan gazlarının seviyesini ölçmek. Floresan ve anestezi infüzyon için ven kateteri kullanın.
3. Kraniotomi
   1. Kulakların arasında fare kafasının dışında kürk tıraş. Planlanan kesi altında subkutan altında 0,5% lidokain 0,04 ml enjekte ve 2 dakika bekleyin.
   2. Periosteum kaldırmak için% 10 Demir klorür çözeltisi kullanarak kafatası silin. Kafatasını tuz ile iyice durulayın. Yapışkan bir metal baş çubuğu siyoakrilat tutkal ve aktivatör ile kafatasına (Şekil 1a).
      Not: metal baş çubuğu 75 mm uzunluğunda ve 13,5 mm genişliğindedir ve merkezde 5 mm 'lik yuvarlak delik vardır.
   3. 0,5 mm arkasında ve sağ duyusal varil korteks üzerinde kemiğinin sağında 3 mm merkezli 4 mm çap kraniyotomi matkap. İnce uçlu damar dilatör ile dura çıkarın.
   4. % 0,75 agaroz jel ile maruz korteks kapak, yapay beyin omurilik sıvısı (acsf; pH = 7,4) çözünür ve 35 °c soğutulur. Kapak 80-90 bir cam lamel magazini ile kraniyotominin% 10-15 ° ' lik bir açı ile metal baş çubuğuna (Şekil 1B) cam mikro-pipet ekleme ve yerleştirme izin verir.
   5. Beyin titreşimi en aza indirmek için, cam lamel magazini iki köşesini siyanoakrilat tutkal ve aktivatör ile metal baş çubuğuna yapıştırın. Maruz beyin üzerine almak önlemek için dikkatle aktivatör uygulayın. Sonra yapıştırılmış cam lamel magazini iyice tuzlu ile durulayın.
4. Bıyık yastık stimülasyon prob ekleme gerçekleştirin. Kraniyotomi için Trigeminal sinir kontralateral ramus infraorbitalis uyarmak için yüz sol tarafına özel yapılmış Bipolar elektrotlar (8 mm uzunluk ve 0,25 mm kalınlık) bir dizi ekleyin. Katot yakın aradan infraorbitalis konumlandırın ve çiğneme kaslar içine anot yerleştirin⁷. 2 Hz 'de 20 s trenlerinde 1 MS için 1,5 mA yoğunluğunda bir elektrik Stimülatörü ile stimülasyon gerçekleştirin.
5. Cerrahi tamamlandıktan sonra, 0,05 mL florürin isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, moleküler ağırlık [MW] 50.000) bir bolus yönetmek kan plazmasını etiketlemek için femoral ven içine. Ketamin kesilmeye devam edin ve anestezinin sürekli intravenöz infüzyon-chloralose (17% w/v, son konsantrasyon) ile karışık FITC-dextran (2% w/v, son konsantrasyon) at 0,02 mL/10 g/h. stabilize etmek için yaklaşık yarım saat bekleyin yeni anestezik devlet.
   Not: her Iki FITC-dextran ve α-chloralose% 0,9 tuz içinde çözülür.

3. ilk iki foton görüntüleme oturumu

1. Fareyi ticari iki foton mikroskop (malzeme tablosu) aşamasına aktarın. Hem kırmızı floresan protein (RFP, Şekil 1c) ve yeşil floresan protein (Gfp, Şekil 1c) epi-floresan aydınlatma modları altında, bir 5x objektif ile maruz korteks bir resim çekmek. Sonraki oturumda cam mikro pipet eklemek için bir ' harita ' olarak RFP resmi kullanın.
   Not: GFP ' map ' damarlardan/venüller arter/arteriollerden ayırt etmek için kullanılır.
2. İki foton mikroskop ve 25x 1,0 sayısal diyafram (NA) su daldırma amacı ile piezo motor kullanarak iki foton görüntüleme gerçekleştirin. 900 nm için uyarma dalga boyu ayarlayın. Korteks arama ve her penetran arteriyol takip ve yatay dalları bulmak (1^St sipariş kapillaries).
3. Görüntü penetran arterioller ve 1^St sipariş kapillaries REST ve bıyık Pad stimülasyon sırasında. Bölüm 5 ' te ayrıntılı görüntüleme parametrelerine bakın.
4. RFP ' map ' (Şekil 1C) üzerinde bıyık yastık stimülasyon sırasında >% 5 vazodilasyon ile 1^St sipariş kılcal yerleri işaretle. < 5% vazodilatasyon ile konumlar bıyık varil korteks bölgenin dışında olarak kabul edilir.
   Not: denemede NG2DsRed fareler yerine vahşi tip fareler kullanıyorsanız, GFP görüntüsü yerine ' harita ' olarak kullanılır.

4. cam mikro-pipet ekleme

1. Pipet çekici (malzeme tablosu) kullanılarak şişirme için cam Mikro-pipetleri hazırlayın. Cam mikro-pipetlerin 3-3,5 MΩ direnci ve 4.5-5 mm Konik uzunluğu vardır. epi-floresan lamba ve iki foton mikroskop altında Pipet ucunu görselleştirmek için 1 mM ATP ve 10 μM Alexa 594 karışımı olan bir pipet yükleyin.
2. Cam mikro pipet 'i bir yama kelepçe tutucusuna monte edin ve bir hava pompasına bağlayın. Pompa tutma basıncını 0 psi olarak ayarlayın.
3. Kırmızı epi-floresan aydınlatma kullanarak, 5x objektif ile Pipet ucunu odaklanın. Cam mikro pipeti agarose üzerindeki aCSF 'ye yerleştirin. Hava pompasının tutma basıncını 0,2 psi 'ye ayarlayın. Küçük kırmızı bir bulut, aCSF 'de Pipet ucunu dışarı çıkartılabilir. Bu pipet ekleme sırasında tıkanma önlemek için.
4. Hedef olarak RFP ' map ' işaretli konumlardan birini seçin. Pipet ucunu, yaklaşık olarak x-y düzleminde hedefe doğru dönük olarak 30 μm mesafeye sahip kapak camı kenarının yatay düzlemine taşıyın.
5. Kapak cam fişi altında z eksenindeki Pipet ucunu dikkatle indirin. Sonra Cam Pipet hedefe doğru ilerlemeye başlayın ~ kadar ~ 500 μm beyin yüzeyinin üzerinde. Kapak cam kenarı, pipet ucu ve beyin yüzeyi arasında sıklıkla odağı değiştirin, pipeti taşımak için yeterli boş alan olduğundan emin olun.
6. Hedefi 25x 'e geçin. Pipet ucunu yeniden merkezleyin ve Pipet ucunu RFP ' haritasındaki hedefe doğru ilerletin. Pipet ucunu agaroz katmanında tutun.
7. Pipet Ucu beyin yüzeyinin ~ 100 μm üzerinde olduğunda, görüntüleme modunu iki foton mikroskobu olarak değiştirin. Odak bir hedef konuma hangi puf. X, y koordinatlarını (x₀, y₀) ve derinliği yüzeyinin altında (z₀) yazın. Beyin yüzeyinde ekleme noktasının koordinatlarını hesaplayın (x_ı, y_ı) aşağıdaki gibi:
   x_ı = x₀ + z₀ /tan θ
   y_i = y₀
   Burada θ pipet tutucu ve yatay düzlem arasındaki açıdır.
8. Pipet ucunu beyin yüzeyinin koordinatlarına (x_ı, y_ı) yerleştirin. Pipeti hafifçe ve yavaşça (x₀, y₀, z₀) ulaşıncaya kadar takın. Bir gemi bir ekleme yolunun yolunda ise, pipet geri çekin ve diğer ekleme koordinatları ve yol yeniden hesaplayın; veya Sahne plakasını hafifçe çevirin ( Şekil 1A'da belirtildiği gibi).
9. 10-15 psi 'de 0 psi ve ejeksiyon basıncında pompa tutma basıncını ayarlayın. Puff ATP için 200-400 MS hedef konumda iki foton görüntüleme sırasında. Tartışma bölümünde açıklandığı gibi, her pipet için ve zamanla şişirme basıncını ve süresini ayarlayın.

5. hyperstack iki foton görüntüleme

1. İki foton mikroskobu ve piezo motor ile 25 x 1,0 NA su daldırma hedefi kullanarak deneyler gerçekleştirin. 900 nm için uyarma dalga boyu ayarlayın. DsRed (perikaytlardan)/tetramethylrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) FITC-dextran (kan plazma)/gcamp6 (GFP, astrositik kalsiyum) gelen yeşil ışık kan plazma boyama ve kırmızı ışık toplamak için yayılan ışık filtre.
2. Penetran arteriole, 1^St sipariş kılcal, 2^ND sipariş kılcal ve muhtemelen komşu floresan hücreler (örneğin, perikayt, astrosit) içeren ilgi yerinde yüksek çözünürlüklü z-yığını üretin. Mümkün olduğunca kan damarlarının 3D yapısını dahil ederek hyperstack görüntüleme x * y * z hacmi belirleyin. Her yığını toplam yüksekliği 30-50 μm değişebilir, x-y düzlem kabaca 60 μm x 40 μm bir alanı kapsar iken.
3. Görüntüleme yazılımındaki görüntü yığınını, 4-5 μm düzlemsel mesafeye sahip 8-10 düzlemlerden oluşmak üzere ayarlayın. Piezo-motor amacı her düzlemin görüntüsünü elde etmek için z eksenindeki her seviyede durur. Örnekleme hızı Stack başına 1 s ve x-y düzleminde piksel çözünürlüğü 0.2-0.3 μm ' dir (Şekil 2A). Bir kayıt normalde 10 pre-Puff görüntü yığınları ve 150 sonrası puf görüntü yığınları içerir.

6. veri işleme

1. Özel yapılan analitik yazılımı kullanarak verileri işleme. Her görüntü yığınını maksimal yoğunluk projeksiyonuna göre tek bir görüntüye Düzleştir (Şekil 2B). Faiz (Şekil 2C) gemi boyunca dik 3 μm genişliğinde bir ılgı dikdörtgen bölge (YG) çizin.
2. Kırmızı kan hücrelerinin gölgeler ve korteks küçük titreşimlerden parazitleri en aza indirmek için, o zaman gemi segmentinin ortalama profilini temsil eden tek bir satıra yansıtarak dikdörtgen YG ortalama. Her maksimal yoğunluk görüntüsü için bunu yapın.
3. Profil satırlarını, kronolojik düzende maksimal yoğunluk görüntülerini temsil eden x ekseni ile 2B görüntü olarak çizin (Şekil 2D, üst panel). Gemi^8,9 (kırmızı eğrileri ile gösterilir) kenarlarını bulmak için etkin bir kontur algoritması (Chan-vese segmentasyon) kullanın; Şekil 2 D, üst panel).
4. Kan damarının kenarları arasındaki fark olarak çap değişikliklerinin zaman seyrini hesaplayın ( Şekil 2D'de üst ve alt kırmızı eğrileri arasındaki dikey mesafe, alt panel). Çap değişimlerinin ön şişme çapı temel ve zaman içinde çap değişimi Arsa eğrileri normalleştirmek. Her YG için bunu yapın (Şekil 2E).
5. Damar tepkisi genliği, şişirme işleminden sonra en yüksek/en düşük tepe genliği olarak tanımlanır. Yanıt gecikmesi, yarım maksimum genlik gecikme süresi olarak tanımlanır (Şekil 2G). Tanklar (Şekil 2F) boyunca DÜĞÜMLERI koyarak ve her YG ve penetran arteriole arasındaki coğrafi mesafeyi ölçmek ile iskeletize damar yapısını el ile izleyin. Gecikme farklılıkları ile mesafeleri bölerek CVR hızını hesaplayın.

7. Viral vektör enjeksiyon

1. Aynı anda astrositik kalsiyum yanıtlarını incelemek için, standart stereotaktik Viral vektör enjeksiyon prosedürü takiben, NG2DsRed fareler somatoduyusal korteks içine 0,6 μL Viral vektör (pZac 2.1 gfaABC1D-LCK-GCaMP6f, Addgene) bir hacim enjekte ¹⁰' a kadar.
2. Üç hafta sonra, fare somatoduyusal korteks astrositler genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi ifade, GCaMP6f. Yukarıda belirtilen cerrahi prosedür ve fareler için iki foton görüntüleme izleyin. Astrositler ve damar Lumina ayırt etmek için, TRITC-dextran yerine FITC-dextran damar Lumina kırmızı leke için kullanılır.

Sonuçlar

Ameliyat tamamlandıktan sonra fareler iki foton mikroskobu (Şekil 1A) nakledildi. Hedef yerde (Şekil 1B) hedef kan damarının YAKıNLıĞı ile 1 mm ATP içeren cam bir mikro pipet yerleştirildi.

1 mM ATP (Şekil 2a, tamamlayıcı video 1) bir puf verirken hiperyığın görüntüleme gerçekleştirdik. Her görüntü yığını maks...

Tartışmalar

Damar çalışmaları için bir zorluk damar çapları kesin ölçümdür. Burada tarif ettiğimiz Yöntem, iki foton mikroskobu ile hızlı ve tekrarlayan hiperyığın görüntüleme yapmak için motorlu bir piezo amaç kullandı. İlk olarak, bu yöntem penetran arteriol, 1^St sipariş ve 2^ND sipariş kılcal odak kaybı olmadan tekrarlı sınavlar sağlar ve yavaşça kapillaries in vivo içinde vasküler tepkiler yürütülen keşif yol açtı. İkincisi, bir viral vektör enjeksiyon tekniği il...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828