In vivo tridimensional microscopia de dois fótons para estudo conduzido respostas vasculares por ejeção ATP local usando uma micro-pipeta de vidro

Resumo

Nós apresentamos um procedimento local aperfeiçoado da ejeção usando uma micro-pipeta de vidro e um método rápido da imagem latente do hyperstack do dois-fotão, que permita a medida precisa de mudanças capilares do diâmetro e a investigação de sua regulação em três dimensões.

Resumo

A manutenção da função cerebral normal requer um suprimento suficiente e eficiente de oxigênio e nutrição por uma complexa rede de vasos. No entanto, a regulação do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) é incompletamente compreendida, especialmente no nível capilar. A microscopia do dois-fotão é uma ferramenta poderosa amplamente utilizada para estudar CBF e sua regulação. Atualmente, este campo é limitado pela falta de estudos in vivo de microscopia de dois fótons examinando (1) respostas de CBF em três dimensões, (2) realizaram respostas vasculares e (3) intervenções localizadas dentro da rede vascular. Aqui, nós descrevemos um método de in vivo 3D usando a microscopia do dois-fotão para estudar as respostas vasculares conduzidas eliciadas pela ejeção local do ATP com uma micro-pipeta de vidro. Nosso método usa a imagem latente rápida e repetitiva do dois-fotão do hyperstack que fornece medidas precisas do diâmetro pela projeção da intensidade máxima das imagens obtidas. Além disso, nós mostramos que este método pode igualmente ser usado para estudar respostas astrocytic do cálcio 3D. Nós igualmente discutimos as vantagens e as limitações da inserção de vidro da micro-pipeta e da imagem latente do hyperstack do dois-fóton.

Introdução

O cérebro tem uma alta taxa de consumo de energia. Cerca de 20% do oxigênio e 25% da glicose consumida pelo corpo humano são dedicados à função cerebral, enquanto o cérebro só ocupa 2% da massa corporal total. A manutenção da função cerebral normal requer um suprimento suficiente e eficiente de oxigênio e nutrição pelo fluxo sanguíneo em uma complexa rede de vasos. A atividade cerebral local e o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) são acoplados de forma robusta, dependendo das propriedades funcionais dos neurônios, astrócitos, pericytes, células musculares lisas (SMCs) e células endoteliais (ECs)¹. Recentemente, as primeiras poucas ordens dos capilares que ramificaram-se das arteríolas penetrantes emergiram como um ' hotspot '², mostrando a regulação ativa do fluxo sanguíneo capilar. Uma resposta vascular conduzida lenta (CVR) foi descoberta neste ' hotspot ' no córtice somatosensory do rato durante a estimulação do whisker e a ejeção local (sopro) do ATP com uma micro-pipeta de vidro³.

Embora a imagem latente in vivo pela microscopia fluorescente da exploração do laser do dois-fóton seja usada extensamente estudando respostas neurovascular no córtice cerebral, a maioria dos estudos mediram diâmetros do vaso sanguíneo e investigaram seu regulamento em um plano de x-y bidimensional (2D). Os desafios são: em primeiro lugar, os vasos sanguíneos cerebrais e seus astrócitos abraçando, pericitos e SMCs constroem ramos em três dimensões (3D). Portanto, é crucial estudar suas interações em 3D. Em segundo lugar, mesmo uma pequena quantidade de deriva em foco afetará a medição precisa de ambos os diâmetros dos vasos e sinais fluorescentes celulares. Finalmente, os CVRs são rápidos e de longo alcance em três dimensões. a digitalização em volume 3D é ideal para detectar CVRs e revelar seus mecanismos. Nós implementamos um objetivo motor piezo em um microscópio do dois-fóton para estudar o córtice somatosensory do rato in vivo, permitindo medidas precisas do diâmetro por projeções da intensidade máxima das imagens obtidas.

As micro-pipetas de vidro têm sido freqüentemente usadas para estudos cerebrais in vivo, por exemplo, para corantes orgânicos de carga a granel⁴, registro EEGs⁵ e para fixação de remendo⁶. No entanto, as limitações permanecem. Comumente, a ponta da micropipeta de vidro é colocada imprecisamente, ou a micropipeta não é usada para intervenções locais. Aqui, otimizamos o procedimento de inserção de micropipeta e ejeção local.

Além disso, a combinação da microscopia do dois-fotão 3D e de indicadores fluorescentes genetically-codificados oferece uma oportunidade sem precedentes de investigar o acoplamento neurovascular em um espaço 3D. Neste estudo, nós aproveitamos este e injetou vetores virais que carreg indicadores genetically-codificados específicos do cálcio do astrocyte no córtice somatosensory do rato. Os astrocytes assim como os diâmetros da embarcação foram imaged simultaneamente combinando marcadores fluorescentes diferentes.

No geral, apresentamos um método otimizado de ejeção local (soprando) por micropipeta de vidro e imagem de hiperpilha de dois fótons rápido, que permite a medição precisa das alterações do diâmetro capilar. Além disso, nosso método fornece uma nova ferramenta para estudar simultaneamente os perfis 3D de CA^{2 +} respostas em astrócitos e respostas de diâmetro vascular.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Nacional de ética dinamarquês de acordo com as diretrizes estabelecidas na Convenção do Conselho Europeu para a proteção de animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros propósitos científicos e conformidade com as orientações de chegada. Este é um procedimento terminal com os ratos que estão sendo eutanasiados antes da recuperação anestésica.

1. preparação pré-cirúrgica

1. Limpe a mesa cirúrgica e toda a área circundante com 70% de etanol. Limpe e seque cuidadosamente as ferramentas cirúrgicas antes da cirurgia.
2. Anestesiar um mouse NG2DsRed (TG (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; ambos os sexos; 4-8 meses de idade) por uma injeção peritoneal de cetamina + xilazina (60 mg/kg + 10 mg/kg) dissolvido em água esterilizada, pH 7,4. Administrar doses suplementares de cetamina (30 mg/kg) a cada 25 min até a conclusão do procedimento cirúrgico. Verifique os reflexos da cauda e do dedo pitada regularmente para verificar a profundidade da anestesia.
3. Injete a solução salina subcutaneamente em quatro locais diferentes na parte de trás do mouse para um volume total de 1 mL para evitar a desidratação durante o experimento. Para proteger os olhos de secar, aplique o lubrificante do olho. Mantenha a temperatura corporal a 37 ° c usando uma sonda de temperatura retal e cobertor de aquecimento.

2. procedimento cirúrgico

1. Traqueotomia
   1. Coloque o rato nas costas. Injete 0, 4 mL de lidocaína a 0,5% por via subcutânea a incisão planejada e aguarde 2 min. faça uma incisão de 10 mm de comprimento acima do osso do tórax (manúbrio). Separe as glândulas submandibulares e os músculos esternotireoidianos e, em seguida, exponha a traquéia.
   2. Faça o traqueostomia entre dois anéis tracheal com tesouras. Insira um tubo metálico pequeno com um comprimento de 16,2 mm e um diâmetro de 1 mm na traquéia. Conecte o tubo a um ventilador mecânico e a um capnógrafo para monitorar o CO₂ expiratório final (Figura 1a).
2. Inserção do cateter
   1. Injetar 0,5% de lidocaína (0, 4 mL) por via subcutânea a incisão planejada e aguardar 2 min.
   2. Usando o fórceps fino da ponta separe delicadamente a artéria da veia. Pare o fluxo sanguíneo a montante com um grampo microvascular. Constrict o fluxo sanguíneo a jusante com uma sutura de nylon 10-0 ligando ambos os vasos sanguíneos.
   3. Use tesouras de microdissecação para fazer uma pequena incisão na artéria e na veia. Insira cateteres plásticos em ambos os vasos sanguíneos. Fixe os cateteres apertando as suturas (8-0 ou 10-0 suturas de náilon dependentes do tamanho do vaso) sem comprometer os lúmens do cateter. Retire a braçadeira microvascular e feche a pele.
   4. Monitore a pressão sanguínea através do cateter arterial. Medir os níveis de gases sanguíneos em amostras de sangue arterial (50 μL) antes e depois de cada experimento (valores normais: pO₂, 90-120 mmHg; PCO₂, 35-40 mmHg; pH, 7.45) usando um analisador de gás sanguíneo. Utilize o cateter venoso para perfusão de fluoresceina e anestesia.
3. Craniotomia
   1. Raspar a pele da cabeça do mouse entre as orelhas. Injete 0, 4 mL de lidocaína a 0,5% por via subcutânea a incisão planejada e aguarde 2 min.
   2. Limpe o crânio usando uma solução de cloreto de ferro a 10% para remover o periósteo. Enxague cuidadosamente o crânio com soro fisiológico. Cole uma barra de metal na cabeça do crânio com cola de cianoacrilato e ativador (Figura 1a).
      Nota: a barra da cabeça de metal tem 75 mm de comprimento e 13,5 mm de largura, com um furo redondo de 5 mm de diâmetro no centro.
   3. Perfure uma craniotomia de 4 mm de diâmetro, centrada em 0,5 mm atrás e 3 mm à direita da Bregma sobre o córtex do tambor sensorial direito. Retire a dura-máter com um dilatador de vasos de ponta fina.
   4. Cubra o córtex exposto com gel de agarose 0,75%, dissolvido em líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF; pH = 7,4) e resfriado a 35 ° c. Cubra 80-90% da craniotomia com um lamínula de vidro em um ângulo de 10-15 ° à barra principal do metal (Figura 1B) que permite a inserção e a colocação da micro-pipeta de vidro.
   5. Para minimizar a pulsação do cérebro, Cole os dois cantos do lamela de vidro na barra principal do metal com colagem e activador do cianoacrilato. Aplique o ativador com cuidado para evitar entrar no cérebro exposto. Enxague cuidadosamente a lamínula de vidro colada com soro fisiológico.
4. Realize a inserção da sonda de estimulação da almofada do Whisker. Insira um conjunto de eletrodos bipolares feitos medida (8 mm de comprimento e 0,25 mm de espessura) percutaneamente no lado esquerdo da face para estimular o ramus infraorbitalis do nervo trigeminal contralateral à craniotomia. Posicione o cátodos perto do hiato infraorbitalis e insira o ânodo nos músculos mastigatórios⁷. Realize a estimulação com um estimulador elétrico a uma intensidade de 1,5 mA para 1 ms em trens de 20 s a 2 Hz.
5. Após a conclusão da cirurgia, administrar um bolus de 0, 5 ml fluoresceína isothiocyanate-Dextran (FITC-Dextran, 4% w/v, peso molecular [MW] 50.000) na veia femoral para rotular o plasma sanguíneo. Interrompa a cetamina e mude a anestesia para infusão intravenosa contínua de α-cloralose (17% p/v, concentração final) misturada com FITC-Dextran (2% p/v, concentração final) em 0, 2 mL/10 g/h. Aguarde cerca de meia hora para a estabilização do novo Estado anestésico.
   Nota: o FITC-Dextran e o α-chloralose são dissolvidos em 0,9% de soro fisiológico.

3. primeira sessão de imagens de dois fótons

1. Transfira o mouse para o estágio de um microscópio comercial de dois fótons (tabela de materiais). a proteína fluorescente vermelha (RFP, Figura 1c) e a proteína fluorescente verde (GFP, Figura 1c) modalidades da iluminação EPI-fluorescente, tomam um retrato do córtice exposto com um objetivo 5x. Use a imagem RFP como um ' mapa ' para a inserção da micropipeta de vidro na próxima sessão.
   Nota: o GFP ' map ' é usado para distinguir veias/venules de artérias/arteríolas.
2. Execute a imagem latente do dois-fotão usando o microscópio do dois-fóton e um objetivo da água-imersão da abertura numérica de 25x 1,0 (NA) com motor piezo. Ajuste o comprimento de onda da excitação a 900 nanômetro. Procure o córtex e siga cada arteriol penetrante e encontre seus ramos horizontais (1^St capillaries ordem).
3. As arteríolas penetrantes da imagem e seus 1^St capilares da ordem no descanso e durante a estimulação da almofada do Whisker. Consulte os parâmetros detalhados de imagem na seção 5.
4. Marcar locais de 1^St de capilares de ordem com > 5% de vasodilatação durante a estimulação da almofada do Whisker no ' mapa ' da RFP (Figura 1C). Locais com < 5% de vasodilatação são considerados como estando fora da região do córtex do barril de Whisker.
   Nota: se utilizar ratos de tipo selvagem em vez de ratos NG2DsRed no experimento, a imagem GFP é utilizada como ' mapa ' em vez disso.

4. inserção da micropipeta de vidro

1. Prepare Micropipetas de vidro para soprar usando um extrator de pipeta (tabela de materiais). As micro-pipetas de vidro têm uma resistência de 3-3,5 MΩ e um comprimento do atarraxamento de 4.5-5 milímetros. Carregue uma pipeta com uma mistura de 1 mM ATP e 10 μM Alexa 594 para visualizar a ponta da pipeta a lâmpada EPI-fluorescente e o microscópio de dois fótons.
2. Monte a micro pipeta de vidro em um suporte da braçadeira de remendo e conecte-a a uma bomba de ar. Ajuste a pressão de retenção da bomba para 0 psi.
3. Usando a iluminação EPI-fluorescente vermelha, focalize na ponta da pipeta com o objetivo 5x. Coloque a micropipeta de vidro no aCSF acima do agarose. Ajuste a pressão de retenção da bomba de ar para 0,2 psi. Uma nuvem vermelha pequena pode ser observada ejting fora da ponta da pipeta no aCSF. Isto é para evitar entupimento durante a inserção da pipeta.
4. Escolha um dos locais marcados no RFP ' map ' como destino. Mova a ponta da pipeta para o plano horizontal da borda de vidro da tampa com uma distância de 30 μm, apontando aproximadamente para o destino no plano x-y.
5. Abaixe com cuidado a ponta da pipeta no eixo z o deslizamento de vidro da tampa. Em seguida, começar a avançar a pipeta de vidro em direção ao destino até ~ 500 μm acima da superfície do cérebro. Mude o foco freqüentemente entre a borda de vidro da tampa, a ponta da pipeta e a superfície do cérebro, certificando-se que há bastante espaço livre para mover a pipeta.
6. Mude o objetivo para 25x. Recentro a ponta da pipeta e avance a ponta da pipeta mais para o destino no ' mapa ' do RFP. Mantenha a ponta da pipeta na camada de agarose.
7. Quando a ponta da pipeta é ~ 100 μm acima da superfície do cérebro, mude o modo de imagem para microscopia de dois fótons. Concentre-se em um local de destino no qual soprar. Anote suas coordenadas x, y (x₀, y₀) e sua profundidade abaixo da superfície (z₀). Calcule as coordenadas do ponto de inserção na superfície do cérebro (x_i, y_i) da seguinte forma:
   x_i = x₀ + z₀ /Tan θ
   y_i = y₀
   onde θ é o ângulo entre o suporte da pipeta e o plano horizontal.
8. Posicione a ponta da pipeta nas coordenadas (x_i, y_i) na superfície do cérebro. Introduza suavemente e lentamente a pipeta até atingir (x₀, y₀, z₀). Se um navio está no caminho de um caminho de inserção, retire a pipeta e recalcule outras coordenadas de inserção e caminho; ou gire ligeiramente a placa de estágio (conforme indicado na Figura 1a).
9. Ajuste a pressão de retenção da bomba a 0 psi e a pressão de ejeção em 10-15 psi. Puff ATP para 200-400 MS no local de destino durante a imagem de dois fótons. Ajuste a pressão e a duração do sopro para cada pipeta e ao longo do tempo conforme explicado na seção de discussão.

5. hyperstack imagem de dois fótons

1. Realize experimentos usando o microscópio de dois fótons e um objetivo de imersão em água de 25 x 1,0 NA com motor piezo. Ajuste o comprimento de onda da excitação a 900 nanômetro. Filtre a luz emitida para coletar a luz vermelha de DsRed (pericytes)/tetrametilrodamina isotiocianato-Dextran (TRITC-Dextran) manchando o plasma sanguíneo e a luz verde de FITC-Dextran (plasma sanguíneo)/GCaMP6 (GFP, cálcio astrocítico).
2. Produza uma pilha z de alta resolução no local de interesse que contenha uma arteriol penetrante, um capilar de ordem 1^St , um capilar de ordem de 2^ND e possivelmente células fluorescentes vizinhas (por exemplo, pericytes, astrócitos). Determine o volume de x * y * z da imagem latente do hyperstack incluindo a estrutura 3D dos vasos sanguíneos tanto quanto possível. A altura total de cada pilha pode variar de 30-50 μm, enquanto o plano x-y cobre aproximadamente uma área de 60 μm x 40 μm.
3. Defina a pilha de imagens no software de imagem a ser composta por 8-10 aviões com uma distância interplane de 4-5 μm. O objetivo piezo-motor pára em cada nível do eixo z para adquirir a imagem de cada plano. A taxa de amostragem é 1 s por pilha e a definição do pixel no plano x-y é 0.2-0.3 μm (Figura 2A). Uma gravação normalmente inclui 10 pilhas de imagens pré-sopro e 150 pilhas de imagens pós-sopro.

6. processamento de dados

1. Processe dados usando software analítico feito medida. Aplainar cada pilha de imagens em uma imagem por projeção de intensidade máxima (Figura 2B). Desenhe uma região retangular de interesse (ROI) com uma largura de 3 μm perpendicularmente em toda a embarcação de interesse (Figura 2C).
2. Para minimizar a interferência de sombras de glóbulos vermelhos e de pequenas vibrações do córtex, a média do ROI retangular, projetando-o em uma linha, que então representa o perfil médio do segmento da embarcação. Faça isso para cada imagem de intensidade máxima.
3. Plotar as linhas de perfil como uma imagem 2D com o eixo x representando imagens de intensidade máxima em ordem cronológica (Figura 2D, painel superior). Use um algoritmo de contorno ativo (segmentação Chan-VESE) para encontrar as bordas da embarcação^8,9 (indicada por curvas vermelhas; Figura 2 D, painel superior).
4. Calcule o curso do tempo das mudanças de diâmetro como a diferença entre as bordas do vaso sanguíneo (distância vertical entre as curvas vermelhas superiores e inferiores na Figura 2D, painel inferior). Normalize as alterações de diâmetro para pré-soprar o diâmetro basal e traçar curvas de diâmetro mudam ao longo do tempo. Faça isso para cada ROI (Figura 2E).
5. A amplitude de resposta do vaso é definida como a maior/menor amplitude de pico após o sopro. A latência de resposta é definida como a latência da amplitude Half-Max (Figura 2G). Trace manualmente a estrutura vascular esqueletizado colocando nós ao longo dos vasos (Figura 2F) e medindo a distância geográfica entre cada ROI e a arteriol penetrante. Calcule a velocidade de CVR dividindo as distâncias por diferenças de latência.

7. injeção viral do vetor

1. A fim de estudar simultaneamente as respostas astrocíticas de cálcio, injetar um volume de 0,6 μL de vetor viral (pZac 2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) no córtex somatossensorial de camundongos NG2DsRed, seguindo o procedimento padrão de injeção de vetor viral estereotáxica a ¹⁰.
2. Após três semanas, os astrócitos no córtex somatosensorial do camundongo expressam o indicador de cálcio geneticamente codificado, GCaMP6f. Siga o procedimento cirúrgico acima mencionado e a imagem latente do dois-fotão para ratos. Para distinguir entre astrócitos e vasos Lumina, TRITC-Dextran em vez de FITC-Dextran é usado para manchar o vaso vermelho Lumina.

Resultados

Uma vez concluída a cirurgia, os camundongos foram transportados para microscópio de dois fótons (Figura 1a). Uma micropipeta de vidro contendo 1 mM de ATP foi inserida na proximidade do vaso sanguíneo de destino no local alvo (Figura 1B).

Nós executamos a imagem latente do hyperstack ao dar um sopro do ATP de 1 milímetro (Figura 2a, vídeo ...

Discussão

Um dos desafios para os estudos vasculares é a mensuração precisa dos diâmetros dos vasos. O método que nós descrevemos aqui usou um objetivo piezo motorizado para fazer a imagem latente rápida e repetitiva do hyperstack pela microscopia do dois-fotão. Firstly, este método permite examinações repetidas da arteriole penetrante, da ordem 1 do^St e dos capilares da ordem 2^ND sem perda de foco e conduziu à descoberta de respostas vasculares lentamente conduzidas nos capilares in vivo. Em segu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828