유리 마이크로 파이펫을 사용하여 국소 ATP 배출에 의한 혈관 반응을 연구하기 위한 Vivo 3차원 2차원 광자 현미경 검사법

요약

우리는 유리 마이크로 파이펫과 빠른 2 광자 하이퍼 스택 이미징 방법을 사용하여 최적화 된 국소 배출 절차를 제시하여 모세관 직경 변화를 정밀하게 측정하고 3 차원으로 조절을 조사 할 수 있습니다.

초록

정상적인 뇌 기능의 유지 보수혈관의 복잡한 네트워크에 의해 산소와 영양의 충분하고 효율적인 공급이 필요합니다. 그러나, 대뇌 혈류량의 규칙 (CBF)는 불완전하게 이해됩니다, 특히 모세관 수준에서. 2 광자 현미경 검사법은 CBF와 그것의 규정을 공부하기 위하여 널리 이용된 강력한 공구입니다. 현재, 이 분야는 (1) CBF 반응을 3차원으로 검사하는 생체내 2광자 현미경 연구의 부족, (2) 혈관 반응 및 (3) 혈관 네트워크 내의 국소적 개입에 의해 제한된다. 여기서, 우리는 유리 마이크로 파이펫으로 ATP의 국소 배출에 의해 유도된 실시된 혈관 반응을 연구하기 위해 2광자 현미경을 사용하여 생체 내 3D 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 얻어진 심물의 최대 강도 투영에 의하여 정확한 직경 측정을 제공하는 빠르고 반복적인 하이퍼스택 2 광자 화상 진찰을 이용합니다. 또한, 우리는이 방법은 또한 3D 성상 성상 칼슘 응답을 연구하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 또한 유리 마이크로 파이펫 삽입 및 2광자 하이퍼스택 이미징의 장점과 한계에 대해서도 논의합니다.

서문

뇌는 높은 에너지 소비율을 가지고 있습니다. 산소의 약 20%와 인체가 소비하는 포도당의 25%는 뇌 기능에 전념하고 있으며, 뇌는 전체 체질량의 2%만 차지합니다. 정상적인 뇌 기능의 유지 보수 혈관의 복잡 한 네트워크에서 혈액 흐름에 의해 산소와 영양의 충분 하 고 효율적인 공급을 필요 합니다. 국소 뇌 활동 및 대뇌 혈류(CBF)는 뉴런, 성상세포, 회수세포, 평활근 세포(SMC) 및 내피 세포(ECs)의 기능적 특성에 따라 강력하게 결합된다^1. 최근에는 관통하는 동맥에서 분지하는 모세혈관의 처음 몇 가지 주문이'핫스팟'2로 등장하여 모세 혈관 의 혈류에 대한 적극적인 조절을 보여주고 있습니다. 느린 전도 혈관 반응 (CVR)은 유리 마이크로 파이펫^3와ATP의 수염 자극 및 국소 배출 (퍼핑) 동안 마우스 체감각 피질에서이 '핫스팟'에서 발견되었다.

2 광자 레이저 스캐닝 형광 현미경 검사법에 의한 생체 내 이미징은 대뇌 피질의 신경 혈관 반응을 연구하는 데 널리 사용되어 왔지만, 대부분의 연구는 혈관 직경을 측정하고 그들의 규정을 조사했습니다. 2차원(2D) x-y 평면. 과제는 첫째, 대뇌 혈관과 성상 세포, pericytes 및 SMC를 포용하는 것이 3 차원 (3D)로 분기를 구성합니다. 따라서 3D로 상호 작용을 연구하는 것이 중요합니다. 둘째, 소량의 초점도 혈관 직경과 세포 형광 신호의 정확한 측정에 영향을 미칩니다. 마지막으로, C버는 3차원으로 빠르고 광범위합니다. 3D 볼륨 스캐닝은 CR을 감지하고 메커니즘을 공개하는 데 최적입니다. 우리는 생체 내에서 마우스 체감각 피질을 연구하기 위해 2 광자 현미경으로 압전 모터 목표를 구현하여 얻은 이미지의 최대 강도 투영으로 정확한 직경측정을 가능하게 했습니다.

유리 마이크로 파이펫은 생체 내 뇌 연구에 자주 사용되어 왔다, 예를 들어,대량 로드 유기 염료 4, 기록 EEGs⁵ 및 패치 클램핑^6. 그럼에도 불구하고 제한은 남아 있습니다. 일반적으로 유리 마이크로 파이펫의 팁이 부정확하게 배치되거나 마이크로 파이펫이 국소 개입에 사용되지 않습니다. 여기서는 마이크로 파이펫 삽입 및 국소 배출 절차를 최적화했습니다.

또한 3D 2광자 현미경 검사법과 유전자 부호인형 형광 지표의 조합은 3D 범위에서 신경 혈관 커플링을 조사할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 이 연구에서, 우리는 이것을 이용하고 마우스 체감각 피질로 성상 세포 특정 유전자 부호화 한 칼슘 지표를 운반하는 바이러스 벡터를 주입했습니다. 성상 세포뿐만 아니라 혈관 직경은 다른 형광 마커를 결합하여 동시에 이미지화되었다.

전반적으로, 우리는 유리 마이크로 파이펫과 모세관 직경 변화를 정밀하게 측정 할 수있는 빠른 2 광자 하이퍼 스택 이미징에 의한 국소 배출 (퍼핑)의 최적화 된 방법을 제시합니다. 또한, 우리의 방법은 성상 세포 및 혈관 직경 응답에서 Ca²⁺ 응답의 3D 프로파일을 동시에 연구할 수 있는 새로운 도구를 제공합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를 위한 유럽 이사회 협약에 명시된 지침에 따라 덴마크 국가 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 도착 지침을 준수하고 있었습니다. 이것은 마취 회복 전에 마우스가 안락사되는 말단 절차입니다.

1. 수술 전 준비

1. 수술 테이블과 주변 의 모든 부위를 70 % 에탄올로 청소하십시오. 수술 전에 수술 도구를 철저히 청소하고 건조시십시오.
2. NG2DsRed 마우스를 마취 (Tg (Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; 두 성별; 4-8 개월) 케타민 + 자일라진의 복막 주입에 의해 (60 mg / kg + 10 mg /kg) 멸균 된 물에 용해, pH 7.4. 케타민의 추가 복용량을 관리 (30 mg/kg) 매 25 수술의 완료까지 분. 꼬리와 발가락 핀치 반사를 정기적으로 확인하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
3. 실험 중 탈수를 방지하기 위해 총 부피 1 mL에 대해 마우스 뒷면의 4개의 다른 위치에서 식염수를 피하적으로 주입합니다. 눈이 건조해지지 않도록 눈윤활유를 바르십시오. 직장 온도 프로브와 난방 담요를 사용하여 체온을 37 °C에서 유지하십시오.

2. 외과 적 수술

1. 기관 절제술
   1. 마우스를 뒷면에 놓습니다. 계획된 절개 하에 0.5 % 리도카인0.5 %의 리도카인을 피하주사하고 2 분 동안 기다립니다. 가슴 뼈 (manubrium) 위에 10mm 길이의 절개를하십시오. 하악선과 갑상선 근육을 분리한 다음 기관을 노출시다.
   2. 가위로 두 개의 기관 고리 사이에 기관 절제술을 합니다. 길이 가 16.2mm, 직경 1mm의 작은 금속 튜브를 기관에 삽입합니다. 튜브를 기계식 인공호흡기 및 캡노그래프에 연결하여 최종 유통망_CO2(그림 1A)를 모니터링합니다.
2. 카테터 삽입
   1. 계획된 절개 하에 0.5% 리도카인 (0.04 mL)을 피하로 주입하고 2 분 동안 기다립니다.
   2. 미세 한 팁 집게를 사용하여 동맥을 정맥에서 부드럽게 분리합니다. 미세 혈관 클램프로 상류로 흐르는 혈류를 중지하십시오. 두 혈관을 결찰10-0 나일론 봉합사와 함께 하류로 혈류를 수축.
   3. 미세 해부 가위를 사용하여 동맥과 정맥 모두에서 작은 절개를하십시오. 두 혈관에 플라스틱 카테터를 삽입합니다. 봉합사를 조여 카테터를 고정 (8-0 또는 10-0 나일론 봉합사 용기 크기에 따라 달라지며 카테터 루멘을 손상시키지 않습니다. 미세 혈관 클램프를 제거하고 피부를 닫습니다.
   4. 동맥 카테터를 통해 혈압을 모니터링합니다. 각 실험 전후의 동맥 혈액 샘플(50 μL)에서 혈액 가스 의 수준을 측정합니다(정상 값: pO_2,90-120 mmHg; pCO_2,35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45)를 사용하여 혈액 가스 분석기를 사용한다. 정맥 카테터를 사용하여 플루오레세인과 마취를 주입하십시오.
3. 개두술
   1. 귀 사이에 마우스의 머리에서 모피를 면도합니다. 계획된 절개 하에 0.5% 리도카인0.04 mL를 주입하고 2 분 동안 기다립니다.
   2. 10% 염화물 용액을 사용하여 두개골을 닦아 골막을 제거합니다. 식염수로 두개골을 철저히 헹급하십시오. 샤노아크릴레이트 접착제와 활성제 (그림1A)로 두개골에 금속 헤드 바를 붙입니다.
      참고: 금속 헤드 바는 길이 75mm, 너비 13.5mm이며, 중앙에는 직경 5mm의 원형 구멍이 있습니다.
   3. 4mm 직경의 개두엽을 드릴, 오른쪽 감각 배럴 피질 위에 bregma의 오른쪽에 0.5 mm 뒤에 와 3mm중심. 미세 팁 용기 확장기로 듀라를 제거합니다.
   4. 노출된 피질을 0.75% 아가로즈 겔로 덮고, 인공 뇌척수액(aCSF; pH = 7.4)에 용해시키고 35°C로 냉각시켰다. 유리 마이크로 파이펫의 삽입 및 배치를 허용하는 금속 헤드 바 (그림1B)에 10-15 °의 각도로 유리 커버 슬립으로 개두량의 80-90 %를 덮습니다.
   5. 뇌 맥동을 최소화하려면 유리 커버슬립의 두 모서리를 시아노아크릴레이트 접착제와 활성제로 금속 헤드 바에 붙입니다. 활성기를 조심스럽게 발라 노출된 뇌에 노출되는 것을 방지하십시오. 접착된 유리 커버슬립을 식염수로 완전히 헹시다.
4. 수염 패드 자극 프로브의 삽입을 수행합니다. 개두엽에 대한 삼차 신경의 라무스 적외선을 자극하기 위해 얼굴의 왼쪽에 맞춤 제작된 양극성 전극 세트(길이 8mm 및 두께 0.25mm)를 삽입합니다. 음극을 틈새 적외선에 가깝게 배치하고 양극을 매스틱 근육^에삽입7. 2Hz에서 20s의 열차에서 1 ms에 대해 1.5 mA의 강도로 전기 자극기로 자극을 수행합니다.
5. 수술이 완료되면 0.05 mL 플루오레세인 이소티오시오네이트-덱센(FITC-dextran, 4% w/v, 분자량 [MW] 50,000)의 볼루스를 대퇴 정맥에 투여하여 혈장 라벨을 붙입니다. 케타민을 중단하고 Α-클로랄로오스의 지속적인 정맥 주입으로 마취를 전환 (17% w / v, 최종 농도) FITC-dextran과 혼합 (2% w / v, 최종 농도) 0.02 mL / 10 g / h에서. 새로운 안정화를 위해 약 반 시간 동안 기다립니다 마취 상태.
   참고: FITC-dextran과 α-클로랄로오스는 모두 0.9% 식염수로 용해됩니다.

3. 첫 번째 2 광자 이미징 세션

1. 마우스를 상업용 2광자 현미경의 단계로 이송한다(재료표). 적색 형광 단백질 (RFP, 도 1C)및 녹색 형광 단백질 (GFP, 도 1C)상피 형광 조명 모드 에서, 5 x 목적으로 노출 된 피질의 사진을 찍습니다. RFP 그림을 다음 세션에서 유리 마이크로 파이펫삽입을 위한 '맵'으로 사용합니다.
   참고 : GFP '지도'는 동맥 / 동맥에서 정맥 / 정맥을 구별하는 데 사용됩니다.
2. 2광자 현미경과 25x 1.0 수치 조리개(NA) 수분 침지 목표를 압폭 모터로 사용하여 2광자 이미징을 수행합니다. 여기 파장을 900 nm로 설정합니다. 피질을 검색하고 각 관통 동맥을 따라 그 수평 가지 (1^st 순서 모세 혈관)를 찾을 수 있습니다.
3. 이미지 관통 동맥 과 그들의 1^st 순서 모세 혈관 휴식 및 수염 패드 자극 동안. 섹션 5의 자세한 이미징 매개 변수를 참조하십시오.
4. RFP '지도'(그림1C)에서 수염 패드 자극 중에 >5% 혈관 확장을 가진 1st 순서 모세혈관의 위치를 표시합니다. <5% 혈관 확장이 있는 위치는 수염 배럴 피질 영역 외부에 있는 것으로 간주됩니다.
   참고: 실험에서 NG2DsRed 마우스 대신 야생 형 마우스를 사용하는 경우 GFP 이미지는 대신 '맵'으로 사용됩니다.

4. 유리 마이크로 파이펫의 삽입

1. 파이펫 풀러(재료표)를 사용하여 퍼핑을위한 유리 마이크로 파이펫을 준비합니다. 유리 마이크로 파이펫은 3-3.5 MΩ의 저항과 4.5-5 mm의 테이퍼 길이를 가지며, 에피형광램프와 2광자 현미경 하에서 파이펫 팁을 시각화하기 위해 1mM ATP와 10 μM Alexa 594를 혼합하여 파이펫을 적재합니다.
2. 유리 마이크로 파이펫을 패치 클램프 홀더에 장착하고 에어 펌프에 연결합니다. 펌프 유지 압력을 0 psi로 설정합니다.
3. 빨간색 에피 형광 조명을 사용하여 5x 목표의 파이펫 팁에 초점을 맞춥니다. 유리 마이크로 파이펫을 아가로즈 위의 aCSF에 넣습니다. 에어 펌프의 유지 압력을 0.2 psi로 조정합니다. aCSF에서 파이펫 팁에서 나오는 작은 빨간색 구름을 관찰할 수 있습니다. 이는 파이펫 삽입 시 막힘을 방지하기 위한 것입니다.
4. RFP '지도'에서 표시된 위치 중 하나를 목적지로 선택합니다. 파이펫 팁을 30μm 거리의 커버 유리 가장자리의 수평 평면으로 이동하여 x-y 평면의 대상을 대략으로 가리킵니다.
5. 커버 글래스 슬립 아래 z축으로 파이펫 팁을 조심스럽게 낮춥습니다. 그런 다음 유리 피펫을 대상쪽으로 이동하여 뇌 표면 에서 ~ 500 μm까지 진행하십시오. 커버 글래스 가장자리, 파이펫 팁 및 뇌 표면 사이에 자주 초점을 전환하여 파이펫을 이동하기에 충분한 여유 공간이 있는지 확인합니다.
6. 목표를 25배로 전환합니다. 파이펫 팁의 중심을 다시 한번 하고 RFP '지도'에서 피펫 팁을 목적지쪽으로 더 멀리 이동합니다. 아가로즈 레이어에 파이펫 팁을 유지합니다.
7. 파이펫 팁이 뇌 표면 에서 ~ 100 μm인 경우 이미징 모드를 2 광자 현미경으로 전환하십시오. 퍼프할 대상 위치에 초점을 맞춥니다. x, y 좌표(x₀,y 0) 및 곡면 아래 깊이(z 0)를 적어 둡니다. 뇌 표면의 삽입 점의 좌표를 다음과 같이계산합니다.
   x_i = x₀ + Z₀ / 황갈색 θ
   y_i = y₀
   여기서 θ는 파이펫 홀더와 수평 평면 사이의 각도입니다.
8. 피펫 팁을 뇌 표면에 좌표(x_i, i)에 배치합니다. 파이펫이 도달할 때까지 부드럽게 천천히삽입합니다(x 0, y_0,z 0). 용기가 삽입 경로의 방해가 되는 경우 파이펫을 철회하고 다른 삽입 좌표와 경로를 다시 계산합니다. 또는 스테이지 플레이트를 약간 돌립니다(그림 1A에 표시된 대로).
9. 펌프 유지 압력을 0 psi 및 배출 압력에서 10-15 psi로 설정합니다. 2 광자 이미징 동안 대상 위치에서 200-400 ms에 대한 퍼프 ATP. 토론 섹션에 설명된 대로 각 파이펫과 시간에 따라 퍼핑의 압력과 기간을 조정합니다.

5. 하이퍼 스택 2 광자 이미징

1. 2광자 현미경과 25 x 1.0 NA 수분 침지 목표를 압전 모터로 사용하여 실험을 수행합니다. 여기 파장을 900 nm로 설정합니다. 방출된 빛을 필터링하여 DsRed(pericytes)/테트라메틸라호다민 이소티오차네이트-덱스트란(TRITC-dextran)에서 혈액 플라즈마와 녹색 빛을 FITC-dextran(혈장)/GCaMP6(GFP, 성상 세포 칼슘)에서 채취합니다.
2. 관통 동맥, 1^st 순서 모세관, 2^차 모세관 및 아마도 인접한 형광 세포 (예를 들어, 회음구, 성상 세포)를 포함하는 관심있는 위치에서 고분해능 z 스택을 생성한다. 가능한 한 혈관의 3D 구조를 포함하여 하이퍼스택 이미징의 x*y*z 부피를 결정합니다. 각 스택의 총 높이는 30-50 μm에서 다를 수 있으며 x-y 평면은 대략 60 μm x 40 μm의 영역을 포함합니다.
3. 이미징 소프트웨어의 이미지 스택을 평면 간 거리가 4-5 μm인 8-10평면으로 구성하도록 설정합니다. 압전 모터 목표는 z축의 각 레벨에서 중지되어 각 평면의 이미지를 획득합니다. 샘플링 속도는 스택당 1초이고 x-y 평면의 픽셀 해상도는 0.2-0.3 μm(도2A)입니다. 하나의 레코딩에는 일반적으로 퍼프 전 이미지 스택 10개, 퍼프 후 이미지 스택 150개를 포함합니다.

6. 데이터 처리

1. 맞춤형 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다. 각 이미지 스택을 최대 강도 투영으로 하나의 이미지로 병합합니다(그림2B). 관심 있는 용기를 가로질러 수직으로 3 μm의 폭을 가진 직사각형 영역(ROI)을 그립니다(그림2C).
2. 적혈구의 그림자와 피질의 사소한 진동으로 인한 간섭을 최소화하려면 한 줄로 투영하여 직사각형 ROI를 평균화한 다음 혈관 세그먼트의 평균 프로필을 나타냅니다. 각 최대 강도 이미지에 대해 이 작업을 수행합니다.
3. 표단선을 x축을 사용하여 2D 이미지로 플롯하여 시간순으로 최대 강도 이미지를 나타냅니다(그림2D,위쪽 패널). 활성 등고선 알고리즘(Chan-Vese segmentation)을 사용하여 용기^8,9의 가장자리를 찾습니다(빨간색 곡선으로 표시; 그림 2 D,위쪽 패널)을 참조하십시오.
4. 혈관의 가장자리 사이의 차이로 직경 변경 시간 과정을 계산합니다(그림 2D, 하부 패널의 상부 및 하부 빨간색 곡선 사이의 수직 거리). 사전 퍼핑 지름 기준선으로 지름 변경 사항을 정규화하고 시간이 지남에 따라 지름 변화커브를 플롯합니다. 각 ROI에 대해 이 작업을 수행합니다(그림2E).
5. 용기 응답 진폭은 퍼핑 후 최고/최저 피크 진폭으로 정의됩니다. 응답 대기 시간은 하프 맥스 진폭의 대기 시간으로 정의됩니다(그림2G). 혈관을 따라 노드를 배치하고 각 ROI와 관통동맥 사이의 지리적 거리를 측정하여 골격화된 혈관 구조를 수동으로 추적합니다. 거리를 대기 시간 차이로 나누어 CVR 속도를 계산합니다.

7. 바이러스 벡터 주입

1. 성상 세포 칼슘 반응을 동시에 연구하기 위해, NG2DsRed 마우스의 체감각 피질에 0.6 μL 바이러스 벡터 (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene)의 부피를 주입, 표준 입체 바이러스 벡터 주입 절차에 따라 ¹⁰.
2. 3 주 후, 마우스 체감각 피질의 성상 세포는 유전자 부화 칼슘 지표, GCaMP6f를 표현한다. 마우스를 위한 전술한 외과 적 및 2 광자 화상 진찰을 따르십시오. 성상 세포와 용기 루미나를 구별하기 위해 FITC-dextran 대신 TRITC-dextran은 용기 루미나 레드를 염색하는 데 사용됩니다.

결과

수술이 완료되면, 마우스를 2광자 현미경으로 이송하였다(도1A). 1 mM ATP를 함유하는 유리 마이크로 파이펫을 대상 위치에서 대상 혈관의 근접에 삽입하였다(도1B).

우리는 1 mM ATP의 퍼프를 제공하면서 하이퍼 스택 이미징을 수행 (그림2A, 보충 비디오1). 각 이미...

토론

혈관 연구의 한 가지 과제는 혈관 직경의 정확한 측정입니다. 여기에서 설명하는 방법은 2 광자 현미경 검사법에 의하여 빠르고 반복적인 hyperstack 화상 진찰을 만들기 위하여 전동된 압전 목표를 이용했습니다. 첫째, 이 방법은 초점의 손실없이 관통 동맥, 1^st 순서 및 2^차 모세 혈관의 반복 검사를 허용하고 생체 내에서 모세 혈관 반응을 천천히 실시의 발견으로 이어졌다. 둘째, 바...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828