ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査

要約

ガラスマイクロピペットと高速2光子ハイパースタックイメージング法を用いて最適化された局所突出手順を提示し、毛細血管の直径変化の精密な測定と3次元での調節の調査を可能にします。

要約

正常な脳機能の維持は、血管の複雑なネットワークによる酸素と栄養の十分かつ効率的な供給を必要とします。しかし、脳血流(CBF)の調節は、特に毛細血管レベルで、不完全に理解されていない。2光子顕微鏡は、CBFとその規制を研究するために広く使用される強力なツールです。現在、この分野は、(1)CBF応答を3次元で調べる生体内2光子顕微鏡検査の欠如、(2)血管応答の実施、および(3)血管ネットワーク内の局所的介入の欠如によって制限される。ここでは、2光子顕微鏡を用いて3Dインビボ法を用いて、ガラスマイクロピペットを用いてATPの局所的な駆出によって引き起こされた血管応答を調べた。我々の方法は、得られた画像の最大強度投影による正確な直径測定を提供する高速かつ反復的なハイパースタック2光子イメージングを使用しています。さらに、この方法は、3D星状カルシウム応答の研究にも用いることができることを示す。また、ガラスマイクロピペット挿入と2光子ハイパースタックイメージングの利点と限界についても説明します。

概要

脳はエネルギー消費率が高い。酸素の約20%と人体が消費するブドウ糖の25%は脳機能に専念し、脳は全体重の2%しか占めかねない。正常な脳機能の維持は、血管の複雑なネットワーク内の血流による酸素と栄養の十分かつ効率的な供給を必要とします。局所的な脳活動および脳血流(CBF)は、ニューロン、星状細胞、周辺細胞、平滑筋細胞(SMC)および内皮細胞(IC)1の機能特性に応じて、強く結合される。最近、動脈を貫通して分岐する毛細血管の最初のいくつかの注文は、毛細血管血流の活発な調節を示す「ホットスポット」2として出現している。遅い伝導血管応答(CVR)は、ガラスマイクロピ^ペット3を用いてATPのウィスカー刺激と局所的な吐出(パフ)の両方の間にマウスの身体感覚皮質のこの「ホットスポット」で発見された。

2光子レーザー走査蛍光顕微鏡による生体内イメージングでは、大脳皮質における神経血管応答の研究に広く用いられてきたが、ほとんどの研究は血管の直径を測定し、2 次元 (2D) x-y 平面。課題は、まず、脳血管とその受け入れ星細胞、ペリサイト、SMCが3次元(3D)で枝を構築します。したがって、3Dで相互作用を研究することが重要です。第二に、焦点のドリフトの少量であっても、容器の直径と細胞蛍光信号の両方の正確な測定に影響を与えます。最後に、CCVは3次元で高速かつ広範囲に及びます。3D ボリューム スキャンは、CCV を検出し、そのメカニズムを発表するのに最適です。2光子顕微鏡でピエゾモーターの目的を実装し、マウスの体感覚皮質を生体内で研究し、得られた画像の最大強度投影による正確な直径測定を可能にした。

ガラスマイクロピペットは、例えば、有機染^料4をバルクロードするために、例えば、GMG⁵を記録し、パッチクランプ6のために、生体内脳研究で頻繁に使用されている。それにもかかわらず、制限は残っています。一般に、ガラスマイクロピペットの先端が不正確に配置されるか、マイクロピペットが局所的介入に使用されない。ここでは、マイクロピペット挿入と局所的な排出の手順を最適化した。

さらに、3D 2光子顕微鏡と遺伝的にコード化された蛍光指標の組み合わせは、3Dスコープで神経血管結合を調べる前例のない機会を提供します。本研究では、これを利用して、アストロサイト特有の遺伝的にコードされたカルシウム指標をマウスの身体感覚皮質に注入した。アストロサイトと血管径は、異なる蛍光マーカーを組み合わせることにより同時に画像化した。

全体として、ガラスマイクロピペットによる局所的な排出(パフ)と高速2光子ハイパースタックイメージングにより、毛細血管径変化の正確な測定が可能な方法を提示します。さらに、我々の方法は、星状細胞および血管直径応答におけるCa2+応答の3Dプロファイルを同時に研究するための新しいツールを提供する。

プロトコル

動物に関するすべての手続きは、欧州理事会の脊椎動物保護条約に定められたガイドラインに従って、デンマーク国家倫理委員会によって承認された。は ARRIVE ガイドラインに準拠していました。これは、マウスが麻酔回復の前に安楽死させられる末期処置である。

1. 手術前の準備

1. 70%のエタノールで外科テーブルおよびすべての周囲の区域をきれいにする。手術前に手術道具を徹底的に清掃し、乾かしてください。
2. NG2DsRedマウス(Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J;両性別;4-8ヶ月齢)ケタミン+キシラジン(60mg/kg+10mg/kg)を殺菌水に溶解して麻酔する。.ケタミンの補足用量(30 mg/kg)を25分ごとに投与し、手術を完了する。尾とつま先のピンチ反射を定期的にチェックして、麻酔の深さを確認します。
3. 実験中の脱水を防ぐために、マウスの背面の4つの異なる場所に皮下に生理食水を注入し、総体積を1mLにします。目を乾燥から守るために、目の潤滑剤を塗布してください。直腸温度プローブと加熱毛布を使用して、体温を37°Cに維持します。

2. 外科的処置

1. 気管 切開 術
   1. マウスを背面に置きます。0.5%リドカインの0.04 mLを計画切開下に皮下に注入し、胸骨(マヌブリウム)の上に10mmの長さの切開を行い、2分間待ちます。顎下腺と性突然性腺を分離し、気管を露出させる。
   2. はさみで2つの気管リングの間に気管切開を行います。長さ16.2mm、直径1mmの小さな金属管を気管に挿入します。チューブを機械式人工呼吸器とカプノグラフに接続して、終末の心電図CO2を監視します(図1A)。
2. カテーテル挿入
   1. 0.5%リドカイン(0.04 mL)を計画切開下に皮下注射し、2分間待つ。
   2. 細かい先端の鉗子を使用して穏やかに静脈から動脈を分離する。微小血管クランプで上流の血流を停止します。両方の血管を結び付ける10-0ナイロン縫合糸で下流の血流を収縮させる。
   3. 動脈と静脈の両方に小さな切開を行うには、微小解剖はさみを使用してください。両方の血管にプラスチック製のカテーテルを挿入します。縫合糸を締め付けることによってカテーテルをしっかりさせる(8-0または10-0ナイロン縫合糸は、カテーテルの内膜を損なうことなく、容器のサイズに依存する)。微小血管クランプを取り外し、皮膚を閉じます。
   4. 動脈カテーテルを介して血圧を監視します。各実験の前後に動脈血中サンプル(50 μL)の血液ガスのレベルを測定します(通常値:pO 2、90-120 mmHg;pCO_2、35-40mmHg;pH、7.25-7.45)。フルオレクセインと麻酔の注入には静脈カテーテルを使用してください。
3. 開頭術
   1. 耳の間にマウスの頭から毛皮を剃ります。0.5%リドカインの0.04 mLを計画切開下に皮下に注入し、2分間待つ。
   2. 10%の塩化鉄溶液を使用して頭蓋骨を拭き取り、骨膜を取り除きます。生理生理で頭蓋骨を十分にすすいでください。シアノクリレート接着剤と活性化剤で頭蓋骨に金属ヘッドバーを接着する(図1A)。
      注:金属製のヘッドバーは長さ75mm、幅13.5mmで、中央に直径5mmの丸い穴があります。
   3. 直径4mmの開頭術を、右感覚バレル皮質の上に、0.5 mmの後ろと3mmのブレグマの右側に集中させる。細かい先端容器ディレータで硬膜を取り外します。
   4. 露出した皮質を0.75%のアガロースゲルで覆い、人工脳脊髄液(aCSF;pH=7.4)に溶解し、35°Cまで冷却した。ガラスマイクロピペットの挿入と配置を可能にする金属ヘッドバー(図1B)に10〜15°の角度でガラスカバースリップで開頭術の80-90%をカバーします。
   5. 脳の脈動を最小限に抑えるために、ガラスカバーの2つのコーナーをシアノクリレート接着剤と活性化剤で金属ヘッドバーに接着します。露出した脳に乗るのを防ぐために、アクティベーターを慎重に適用します。その後、接着ガラスカバーを生理食生で十分にすすいでください。
4. ウィスカーパッド刺激プローブの挿入を行います。カスタムメイドの双極電極(長さ8mm、厚さ0.25mm)を顔の左側に経皮的に挿入し、三叉神経の横側の眼窩を刺激する。陰極をヒアトゥスの眼窩に近づけ、乳骨格^筋7に陽極を挿入する。2Hzで20秒の列車で1ミリ秒の強度1.5mAの電気刺激器で刺激を行います。
5. 手術完了後、0.05mLフルオレセインイソチオシアネートデキストラン(FITC-dextran,4%w/v,分子量[MW]50,000)のボーラスを大腿静脈に投与し、血漿に標識する。ケタミンを中止し、αクロラロースの連続静脈注入(17%w/v、最終濃度)に麻酔を切り替え、FITC-デキストラン(2%w/v、最終濃度)を0.02 mL/10 g/hで混合し、新しい安定化のために約半時間待ちます。麻酔状態。
   注:FITC-デキストランとαクロラロースの両方が0.9%の生理生理に溶解されます。

3. 最初の2フォトンイメージングセッション

1. 市販の2光子顕微鏡(材料表)の段階にマウスを移します。赤色蛍光タンパク質(RFP、図1C)および緑色蛍光タンパク質(GFP、図1C)のエピ蛍光照度モードの両方下で、5倍の目的で露出した皮質の写真を撮る。RFP 画像は、次のセッションでガラスマイクロピペットを挿入するための「マップ」として使用します。
   注:GFPの「マップ」は、静脈/静脈を動脈/動脈から区別するために使用されます。
2. 2光子顕微鏡と25x 1.0の数値開口(NA)水浸し目的をピエゾモーターで使用して2光子イメージングを行います。励起波長を 900 nm に設定します。皮質を検索し、各貫通動脈に従い、その水平枝(第1次毛細血管)を見つけます。
3. 画像は、静止時およびウィスカーパッド刺激中に動脈およびその第1次毛細血管を貫通する。セクション5の詳細なイメージングパラメータを参照してください。
4. RFP 'map' 上のウィスカーパッド刺激中に>5%の血管拡張を持つ第1次毛細血管の位置をマークします(図1 C)。<5% 血管拡張を持つ場所は、ウィスカーバレル皮質領域の外側であると考えられています。
   注:実験でNG2DsRedマウスの代わりに野生型マウスを使用する場合、GFP画像は代わりに「マップ」として使用されます。

4. ガラスマイクロピペットの挿入

1. ピペットプーラー(材料の表)を使用してパフのためのガラスマイクロピペットを準備します。ガラスマイクロピペットは3-3.5 MΩの抵抗と4.5-5ミリメートルのテーパ長を有し、エピ蛍光ランプと2フォトン顕微鏡の下でピペットの先端を視覚化するために1 mM ATPと10 μM Alexa 594の混合物でピペットをロードします。
2. ガラスマイクロピペットをパッチクランプホルダーに取り付け、エアポンプに接続します。ポンプ保持圧力を 0 psi に設定します。
3. 赤いエピ蛍光照明を使用して、5倍の目的でピペットの先端に焦点を当てます。ガラスマイクロピペットをアガロースの上のACSFに入れます。エアポンプの保持圧力を0.2 psiに調整します。小さな赤い雲がaCSFのピペット先端から排出されるのを観察することができる。これは、ピペット挿入時の目詰まりを防ぐようにする。
4. RFP 'map' でマークされている場所のいずれかを宛先として選択します。ピペット先端を 30 μm の距離でカバー ガラスエッジの水平面に移動し、X-y 平面の目的地に向かって大まかに向けます。
5. カバーガラスのスリップの下のZ軸のピペット先端を慎重に下げます。その後、脳表面の上に〜500 μmまで目的地に向かってガラスピペットを進め始めます。カバーガラスエッジ、ピペット先端、脳表面の間で頻繁にフォーカスを切り替え、ピペットを動かすのに十分な空き領域があることを確認します。
6. 目標を 25 倍に切り替えます。ピペット先端を再センターし、RFP'マップ'上の目的地に向かってピペット先端をさらに進めます。アガロース層にピペットの先端を保持します。
7. ピペット先端が脳表面より~100μm上の場合は、イメージングモードを2光子顕微鏡に切り替えます。パフするターゲットの場所に焦点を当てます。x、y 座標 (x₀、y 0) とサーフェスの下の深さ (z₀₎を書き留めます。脳表面上の挿入点の座標を次のように計算します。
   x_i = x₀ + z₀ / 日焼け
   y_i = y₀
   θは、ピペット ホルダと水平面の間の角度です。
8. ピペット先端を脳表面の座標(x_i,y i)に配置します。ピペットが届くまでゆっくりとゆっくりとピペットを挿入します(x 0、y_0、z0)。容器が挿入経路の邪魔である場合は、ピペットを撤回し、他の挿入座標とパスを再計算します。またはステージプレートを少し回します(図1Aに示すように)。
9. ポンプ保持圧力を0 psi、吐出圧力を10~15psiに設定します。2光子イメージング中のターゲット位置で200〜400ミリ秒のパフATP。ディスカッションセクションで説明されているように、各ピペットと時間の経過とともにパフの圧力と持続時間を調整します。

5. ハイパースタック 2 フォトン イメージング

1. ピエゾモーターを用いて2光子顕微鏡と25 x 1.0 NA水浸漬目的を用いて実験を行う。励起波長を 900 nm に設定します。DsRed(ペリサイト)/テトラメチルロダミンイソチオダミンデキストラン(TRITC-dextran)染色血漿およびFITC-デキストラン(血漿)/GCaMP6(GFP、星状カルシウム)から赤色光を収集するために放出された光をフィルタリングします。
2. 貫通動脈、第1次毛細血管、2^次毛細血管およびおそらく隣接する蛍光細胞(例えば、ペリサイト、アストロサイト)を含む目的の位置で高解像度Zスタックを生成する。血管の3D構造を可能な限り含めて、ハイパースタックイメージングのx*y*z体積を決定します。各スタックの全高は30~50μmで、x-y平面は60 μm x 40 μmの面積をほぼカバーします。
3. イメージング ソフトウェアのイメージ スタックを、4 ~ 5 μm の平面間距離を持つ 8 ~ 10 平面で構成するように設定します。ピエゾモーターの目的は、各平面の画像を取得するためにZ軸上の各レベルで停止します。サンプリングレートはスタックあたり 1 s で、x-y 平面のピクセル解像度は 0.2~ 0.3 μm です (図 2A)。1 つの記録には、通常、10 のプレパフ 画像スタックと 150 ポスト パフ イメージ スタックが含まれます。

6. データ処理

1. カスタムメイドの分析ソフトウェアを使用してデータを処理します。最大強度投影(図2B)により、各画像スタックを1つの画像に平坦化します。対象の血管を垂直に 3 μm の幅で示す長方形領域 (ROI) を描画します (図 2C)。
2. 赤血球の影や皮質の小さな振動からの干渉を最小限に抑えるために、長方形のROIを1本の線に投影して平均化し、血管セグメントの平均プロファイルを表します。最大強度のイメージごとにこれを行います。
3. 縦線を 2D イメージとしてプロットし、最大強度のイメージを時系列順に表す X 軸を使用します(図 2D、上のパネル)。アクティブな輪郭アルゴリズム(Chan-Veseセグメンテーション)を使用して、容器8、9(赤い曲線で示される)のエッジを見つけます。図 2D、上部パネル)。
4. 血管の縁の差(図2Dの上下赤い曲線の垂直距離、下パネル)に合って直径の変化の時間経過を計算します。時間の経過に応じるために、パフ前直径ベースラインとプロットカーブに直径の変化を正規化します。これを ROI ごとに行います (図 2E)。
5. 容器応答振幅は、パフ後の最高/最低ピーク振幅として定義されます。応答待ち時間は、半最大振幅 (図 2G) の待機時間として定義されます。血管に沿ってノードを配置し(図2F)、各ROIと貫通動脈との間の地理的距離を測定することにより、骨格化血管構造を手動でトレースします。距離を遅延差で除算して CVR 速度を計算します。

7. ウイルスベクター注入

1. 天体カルシウム応答を同時に研究するために、NG2DsRedマウスの体感覚皮質に0.6 μLウイルスベクター(pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f、Addgene)の体積を注入し、標準的な立体化ウイルスベクター注入手順に従って¹⁰.
2. 3週間後、マウス体感覚皮質のアストロサイトは、遺伝的にコードされたカルシウム指標GCaMP6fを発現する。マウスの前述の外科的処置および2光子のイメージ投射に従う。アストロサイトと血管ルミナを区別するために、FITC-dextranの代わりにTRITC-dextranが容器ルミナを赤く染色するために使用されます。

結果

手術が完了すると、マウスを2光子顕微鏡に搬送した(図1A)。1mM ATPを含むガラスマイクロピペットを、標的位置に宛先血管の近くに挿入した(図1B)。

1 mM ATP のパフを与えながらハイパースタックイメージングを行いました (図 2A,補足ビデオ1)各画像スタック...

ディスカッション

血管研究の1つの課題は、血管直径の正確な測定です。ここで説明する方法は、2光子顕微鏡による高速かつ反復的なハイパースタックイメージングを行うために、電動ピエゾの目的を使用した。第一に、この方法は、焦点を失うことなく、貫通動脈、第1次および第2次毛細血管の繰り返し検査を可能にし、生体内の毛細血管におけるゆっくりと行われた血管応答の発見につな?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828