En Vivo Microscopía bicolor tridimensional para estudiar las respuestas vasculares realizadas por la eyección ATP local utilizando una micro-pipette de vidrio

Resumen

Presentamos un procedimiento de eyección local optimizado utilizando una micropipeta de vidrio y un método rápido de imagen hiperpila de dos fotones, que permite la medición precisa de los cambios de diámetro capilar y la investigación de su regulación en tres dimensiones.

Resumen

El mantenimiento de la función cerebral normal requiere un suministro suficiente y eficiente de oxígeno y nutrición por una compleja red de vasos. Sin embargo, la regulación del flujo sanguíneo cerebral (CBF) se entiende incompletamente, especialmente a nivel capilar. La microscopía de dos fotones es una poderosa herramienta ampliamente utilizada para estudiar CBF y su regulación. Actualmente, este campo está limitado por la falta de estudios in vivo sin microscopía de dos fotones que examinen (1) las respuestas de la CBF en tres dimensiones, (2) las respuestas vasculares realizadas y (3) las intervenciones localizadas dentro de la red vascular. Aquí, describimos un método 3D in vivo usando microscopía de dos fotones para estudiar las respuestas vasculares realizadas provocadas por la eyección local de ATP con una micro-pipeta de vidrio. Nuestro método utiliza imágenes rápidas y repetitivas de dos fotones hiperpila que proporcionan mediciones precisas de diámetro mediante la proyección de intensidad máxima de las imágenes obtenidas. Además, demostramos que este método también se puede utilizar para estudiar las respuestas astrocíticas de calcio 3D. También discutimos las ventajas y limitaciones de la inserción de micropipetas de vidrio y la imagen de hiperpila de dos fotones.

Introducción

El cerebro tiene una alta tasa de consumo de energía. Alrededor del 20% del oxígeno y el 25% de la glucosa consumida por el cuerpo humano se dedican a la función cerebral, mientras que el cerebro sólo ocupa el 2% de la masa corporal total. El mantenimiento de la función cerebral normal requiere un suministro suficiente y eficiente de oxígeno y nutrición por flujo sanguíneo en una compleja red de vasos. La actividad cerebral local y el flujo sanguíneo cerebral (CBF) están estrechamente acoplados, dependiendo de las propiedades funcionales de las neuronas, astrocitos, pericitos, células musculares lisas (SCD) y células endoteliales (ECs)¹. Recientemente, las primeras órdenes de ramificación capilar de arteriolas penetrantes han surgido como un 'hotspot'^2,mostrando una regulación activa del flujo sanguíneo capilar. Se descubrió una respuesta vascular de conducta lenta (CVR) en este "punto caliente" en la corteza somatosensorial del ratón durante la estimulación del bigote y la eyección local (puffing) de ATP con una micropipeta de vidrio³.

Aunque la microscopía fluorescente de escaneo láser in vivo por dos fotones ha sido ampliamente utilizada para estudiar las respuestas neurovasculares en la corteza cerebral, la mayoría de los estudios midieron los diámetros de los vasos sanguíneos e investigaron su regulación en un plano x-y bidimensional (2D). Los desafíos son: En primer lugar, los vasos sanguíneos cerebrales y sus astrocitos abrazados, pericitas y SCM construyen ramas en tres dimensiones (3D). Por lo tanto, es crucial estudiar sus interacciones en 3D. En segundo lugar, incluso una pequeña cantidad de deriva en el foco afectará la medición precisa de los diámetros de los vasos y las señales fluorescentes celulares. Por último, los CCV son rápidos y de gran alcance en tres dimensiones. El escaneo de volumen 3D es óptimo para detectar VOR y revelar sus mecanismos. Implementamos un objetivo motor piezoeléctrico en un microscopio de dos fotones para estudiar la corteza somatosensorial de ratón in vivo, permitiendo mediciones precisas de diámetro mediante proyecciones de intensidad máxima de las imágenes obtenidas.

Las micropipetas de vidrio se han utilizado con frecuencia para estudios cerebrales in vivo, por ejemplo, para dardos orgánicos de carga masiva⁴, registro de EEGs⁵ y para la sujeción de parches⁶. No obstante, persisten limitaciones. Comúnmente, la punta de la micro-pipeta de vidrio se coloca de forma imprecisa, o la micro-pipeta no se utiliza para las intervenciones locales. Aquí, hemos optimizado el procedimiento de inserción de micro-pipetas y eyección local.

Además, la combinación de microscopía 3D de dos fotones e indicadores fluorescentes codificados genéticamente ofrece una oportunidad sin precedentes para investigar el acoplamiento neurovascular en un ámbito 3D. En este estudio, aprovechamos esto e inyectamos vectores virales que llevaban indicadores específicos de calcio codificados genéticamente en la corteza somatosensorial del ratón. Los astrocitos, así como los diámetros de los recipientes, se crearon simultáneamente combinando diferentes marcadores fluorescentes.

En general, presentamos un método optimizado de eyección local (puffing) por micropipeta de vidrio e imagen rápida de hiperpila de dos fotones, que permite la medición precisa de los cambios de diámetro capilar. Además, nuestro método proporciona una herramienta novedosa para estudiar simultáneamente perfiles 3D de respuestas Ca²⁺ en astrocitos y respuestas de diámetro vascular.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales fueron aprobados por el Comité Nacional de Ética de Danés de acuerdo con las directrices establecidas en el Convenio del Consejo Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados Utilizados con Fines Experimentales y Otros Fines Científicos y cumplieron con las directrices de ARRIVE. Este es un procedimiento terminal con los ratones eutanasiados antes de la recuperación anestésica.

1. Preparación prequirúrgica

1. Limpie la mesa quirúrgica y todo el área circundante con 70% de etanol. Limpie y seque completamente las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía.
2. Anestesiar un ratón NG2DsRed (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; ambos sexos; 4-8 meses de edad) por una inyección peritoneal de ketamina + xilazina (60 mg/kg + 10 mg/kg) disuelta en agua esterilizada, pH 7.4. Administrar dosis suplementarias de ketamina (30 mg/kg) cada 25 minutos hasta la finalización del procedimiento quirúrgico. Compruebe los reflejos de pellizcar la cola y los dedos de los dedos de los dedos con regularidad para verificar la profundidad de la anestesia.
3. Inyecte salina por vía subcutánea en cuatro ubicaciones diferentes en la parte posterior del ratón para un volumen total de 1 ml para evitar la deshidratación durante el experimento. Para proteger los ojos del secado, aplique lubricante para los ojos. Mantener la temperatura corporal a 37 oC utilizando una sonda de temperatura rectal y una manta calefactora.

2. Procedimiento quirúrgico

1. Traqueotomía
   1. Coloque el ratón sobre su espalda. Inyectar 0,04 ml de lidocaína al 0,5% por vía subcutánea bajo la incisión planificada y esperar 2 min. Hacer una incisión de 10 mm de largo por encima del hueso torácico (manubrium). Separe las glándulas submandibulares y los músculos esternotiroideos, y luego exponga la tráquea.
   2. Haga traqueotomía entre dos anillos traqueales con tijeras. Inserte un tubo metálico pequeño con una longitud de 16,2 mm y un diámetro de 1 mm en la tráquea. Conecte el tubo a un respirador mecánico y al capnógrafo para controlar el CO₂ de la espiratoria final (Figura1A).
2. Inserción del catéter
   1. Inyectar 0,5% de lidocaína (0,04 ml) por vía subcutánea bajo la incisión planificada y esperar 2 min.
   2. Usando fórceps de punta fina separa suavemente la arteria de la vena. Detenga el flujo sanguíneo aguas arriba con una abrazadera microvascular. Constriñe el flujo sanguíneo aguas abajo con una sutura de nylon 10-0 que liga los dos vasos sanguíneos.
   3. Use tijeras micro-diselantantes para hacer una pequeña incisión tanto en la arteria como en la vena. Inserte catéteres de plástico en ambos vasos sanguíneos. Fije los catéteres apretando las suturas (8-0 o 10-0 suturas de nylon dependientes del tamaño del recipiente) sin comprometer los lúmenes del catéter. Retire la abrazadera microvascular y cierre la piel.
   4. Controle la presión arterial a través del catéter arterial. Mida los niveles de gases sanguíneos en muestras de sangre arterial (50 l) antes y después de cada experimento (valores normales: pO₂, 90-120 mmHg; pCO₂, 35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45) utilizando un analizador de gas sanguíneo. Utilice el catéter venoso para la perfusión de fluoresceína y anestesia.
3. Craneotomía
   1. Asiente el pelaje de la cabeza del ratón entre las orejas. Inyectar 0,04 ml de lidocaína al 0,5% por vía subcutánea bajo la incisión planificada y esperar 2 min.
   2. Limpie el cráneo con una solución de cloruro de hierro al 10% para eliminar el periosteum. Enjuague bien el cráneo con salina. Pegue una barra de cabeza metálica al cráneo con pegamento y activador de cianoacrilato (Figura1A).
      NOTA: La barra de cabeza metálica es de 75 mm de largo y 13,5 mm de ancho, con un orificio redondo de 5 mm de diámetro en el centro.
   3. Taladre una craneotomía de 4 mm de diámetro, centrada en 0,5 mm detrás y 3 mm a la derecha del bregma sobre la corteza de barril sensorial derecha. Retire la dura con un dilatador de recipiente de punta fina.
   4. Cubrir la corteza expuesta con un 0,75% de gel de agarosa, disuelto en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF; pH a 7,4) y enfriado a 35 oC. Cubrir el 80-90% de la craneotomía con un cubreobjetos de vidrio en un ángulo de 10-15o a la barra de cabeza de metal (Figura1B) que permite la inserción y colocación de la micropipeta de vidrio.
   5. Para minimizar la pulsación cerebral, pegue las dos esquinas del cubreobjetos de vidrio en la barra de la cabeza de metal con pegamento y activador de cianoacrilato. Aplique el activador cuidadosamente para evitar entrar en el cerebro expuesto. Enjuague el cubreobjetos de vidrio pegado a fondo con salina después.
4. Realice la inserción de la sonda de estimulación de la almohadilla del bigote. Inserte un conjunto de electrodos bipolares hechos a medida (8 mm de longitud y 0,25 mm de espesor) percutáneamente en el lado izquierdo de la cara para estimular el ramus infraorbitalis del nervio trigémino contralateral a la craneotomía. Coloque el cátodo cerca del hiatus infraorbitalis, e inserte el ánodo en los músculos masticatorios⁷. Realizar la estimulación con un estimulador eléctrico a una intensidad de 1,5 mA durante 1 ms en trenes de 20 s a 2 Hz.
5. Al finalizar la cirugía, administrar un bolo de 0,05 ml de fluoresceína isotiocianato-dextran (FITC-dextran, 4% p/v, peso molecular [MW] 50.000) en la vena femoral para etiquetar el plasma sanguíneo. Interrumpir la ketamina y cambiar la anestesia a perfusión intravenosa continua de cloralosa (17% p/v, concentración final) mezclada con FITC-dextran (2% p/v, concentración final) a 0,02 ml/10 g/h. Espere aproximadamente media hora para la estabilización de la nueva estado anestésico.
   NOTA: Tanto la FITC-dextran como la cloralosa se disuelven en 0.9% de solución salina.

3. Primera sesión de imágenes de dos fotones

1. Transfiera el ratón a la etapa de un microscopio comercial de dos fotones (Tablade materiales). Bajo los modos de proteína fluorescente roja (RFP, Figura 1C) y proteína fluorescente verde (GFP, Figura 1C)de iluminación epifluorescente, tomar una foto de la corteza expuesta con un objetivo 5x. Utilice la imagen RFP como un "mapa" para insertar la micropipeta de vidrio en la siguiente sesión.
   NOTA: El "mapa" de la GFP se utiliza para distinguir las venas/venules de las arterias/arterioles.
2. Realice imágenes de dos fotones utilizando el microscopio de dos fotones y un objetivo de inmersión en agua de apertura numérica (NA) de 25x 1.0 con motor piezoeléctrico. Ajuste la longitud de onda de excitación a 900 nm. Busque en la corteza y siga cada arteriola penetrante y encuentre sus ramas horizontales (1o orden capilar).
3. Imagen de arteriolas penetrantes y sus capilares de^1o orden en reposo y durante la estimulación de la almohadilla del bigote. Consulte los parámetros detallados de la imagen en la sección 5.
4. Marque las ubicaciones de los capilares de 1o orden con >5% vasodilatación durante la estimulación de la almohadilla del bigote en el 'mapa' de RFP (Figura 1C). Las ubicaciones con <5% vasodilatación se consideran fuera de la región de la corteza del barril de bigote.
   NOTA: Si se utilizan ratones de tipo salvaje en lugar de ratones NG2DsRed en el experimento, la imagen GFP se utiliza como 'mapa' en su lugar.

4. Inserción del micro-pipeta de vidrio

1. Preparar micropipetas de vidrio para soplar usando un tirador de pipeta (Tablade Materiales). Las micropipetas de vidrio tienen una resistencia de 3-3,5 M y una longitud cóxeca de 4,5-5 mm. Cargue una pipeta con una mezcla de 1 mM de ATP y Alexa 594 de 10 m para visualizar la punta de la pipeta bajo la lámpara epifluorescente y el microscopio de dos fotones.
2. Monte la micropipeta de vidrio en un soporte de abrazadera de parche y conéctela a una bomba de aire. Ajuste la presión de retención de la bomba a 0 psi.
3. Usando la iluminación epifluorescente roja, concéntrese en la punta de la pipeta con el objetivo 5x. Coloque la micropipeta de vidrio en el aCSF por encima de la agarosa. Ajuste la presión de retención de la bomba de aire a 0,2 psi. Se puede observar una pequeña nube roja expulsando de la punta de la pipeta en el aCSF. Esto es para evitar obstrucciones durante la inserción de la pipeta.
4. Elija una de las ubicaciones marcadas en el 'mapa' de RFP como destino. Mueva la punta de la pipeta al plano horizontal del borde de vidrio de la cubierta con una distancia de 30 m, apuntando aproximadamente hacia el destino en el plano x-y.
5. Baje con cuidado la punta de la pipeta en el eje z debajo del deslizamiento del cristal de la cubierta. A continuación, comience a avanzar la pipeta de vidrio hacia el destino hasta 500 m por encima de la superficie del cerebro. Cambie el enfoque con frecuencia entre el borde del vidrio de la cubierta, la punta de la pipeta y la superficie del cerebro, asegurándose de que haya suficiente espacio libre para mover la pipeta.
6. Cambie el objetivo a 25x. Vuelva a centrar la punta de la pipeta y avance la punta de la pipeta más hacia el destino en el 'mapa' de RFP. Mantenga la punta de la pipeta en la capa de agarosa.
7. Cuando la punta de la pipeta esté a 100 m por encima de la superficie del cerebro, cambie el modo de imagen a microscopía de dos fotones. Concéntrese en una ubicación objetivo en la que soplar. Anote sus coordenadas x, y (x₀, y₀) y su profundidad por debajo de la superficie (z₀). Calcule las coordenadas del punto de inserción en la superficie del cerebro (x_i, y_i) de la siguiente manera:
   x_i x x₀ + z₀ / bronceado
   y_i y₀
   donde el ángulo entre el soporte de la pipeta y el plano horizontal.
8. Coloque la punta de la pipeta en las coordenadas (x_i, y_i) en la superficie del cerebro. Inserte suavemente y lentamente la pipeta hasta que alcance (x₀, y₀, z₀). Si un recipiente está en el camino de una ruta de inserción, retire la pipeta y vuelva a calcular otras coordenadas de inserción y trayectoria; o gire ligeramente la placa del escenario (como se indica en la Figura 1A).
9. Ajuste la presión de retención de la bomba a 0 psi y la presión de eyección a 10-15 psi. Puff ATP para 200-400 ms en la ubicación objetivo durante la toma de imágenes de dos fotones. Ajuste la presión y la duración de la hinchazón para cada pipeta y con el tiempo como se explica en la sección de discusión.

5. Imágenes de dos fotones de Hyperstack

1. Realice experimentos utilizando el microscopio de dos fotones y un objetivo de inmersión en agua de 25 x 1.0 NA con motor piezoeléctrico. Ajuste la longitud de onda de excitación a 900 nm. Filtre la luz emitida para recoger la luz roja de DsRed (pericitas)/tetrametilrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) manchando el plasma sanguíneo y la luz verde de FITC-dextran (plasma sanguíneo)/GCaMP6 (GFP, calcio astrocítico).
2. Producir una pila z de alta resolución en el lugar de interés que contiene una arteriola penetrante, un capilar de 1o orden, un capilar de 2o orden y posiblemente células fluorescentes vecinas (por ejemplo, pericitas, astrocitos). Determine el volumen x*y*z de la toma de imágenes de hiperpila incluyendo la estructura 3D de los vasos sanguíneos tanto como sea posible. La altura total de cada pila puede variar de 30-50 m, mientras que el plano x-y cubre aproximadamente un área de 60 ám x 40 m.
3. Establezca la pila de imágenes en el software de imágenes que se compone de 8-10 planos con una distancia entre planos de 4-5 m. El objetivo piezomotor se detiene en cada nivel en el eje z para adquirir la imagen de cada plano. La frecuencia de muestreo es de 1 s por pila y la resolución de píxeles en el plano x-y es de 0,2-0,3 m (Figura2A). Una grabación normalmente incluye 10 pilas de imágenes previas a la hojaada y 150 pilas de imágenes posteriores al soplado.

6. Procesamiento de datos

1. Procesar datos utilizando software analítico personalizado. Aplanar cada pila de imágenes en una imagen mediante la proyección de intensidad máxima (Figura2B). Dibuje una región rectangular de interés (ROI) con una anchura de 3 m perpendicularmente a través del buque de interés (Figura2C).
2. Para minimizar la interferencia de las sombras de los glóbulos rojos y de las vibraciones menores de la corteza, promediar el ROI rectangular proyectándolo en una línea, que luego representa el perfil promedio del segmento del vaso. Haga esto para cada imagen de intensidad máxima.
3. Trazar las líneas de perfil como una imagen 2D con el eje X que representa las imágenes de intensidad máxima en orden cronológico (Figura2D, panel superior). Utilice un algoritmo de contorno activo (segmentación Chan-Vese) para encontrar los bordes del recipiente^8,9 (indicado por curvas rojas; Figura 2 D, panel superior).
4. Calcular el curso de tiempo del diámetro cambia a medida que la diferencia entre los bordes del vaso sanguíneo (distancia vertical entre las curvas rojas superior e inferior en la Figura 2D, panel inferior). Normalice los cambios de diámetro a la línea base del diámetro de pre-puffing y a las curvas de trazado de los cambios de diámetro con el tiempo. Haga esto para cada ROI (Figura2E).
5. La amplitud de respuesta del recipiente se define como la amplitud máxima más alta/más baja después de soplar. La latencia de respuesta se define como la latencia de la amplitud semimáxima (Figura2G). Rastrear manualmente la estructura vascular esqueletizada colocando nodos a lo largo de los vasos (Figura2F)y midiendo la distancia geográfica entre cada ROI y la arteriola penetrante. Calcule la velocidad de CVR dividiendo las distancias por diferencias de latencia.

7. Inyección vectorial viral

1. Con el fin de estudiar simultáneamente las respuestas astrocíticas de calcio, inyectar un volumen de vector viral de 0,6 l (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) en la corteza somatosensorial de los ratones NG2DSRed, siguiendo el procedimiento de inyección de vector viral estereotáctico estándar, siguiendo el procedimiento de inyección de vector viral estereotáctico estándar ¹⁰.
2. Después de tres semanas, los astrocitos en la corteza somatosensorial del ratón expresan el indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP6f. Siga el procedimiento quirúrgico antes mencionado y la toma de imágenes de dos fotones para ratones. Para distinguir entre los astrocitos y la lumina del recipiente, TRITC-dextran en lugar de FITC-dextran se utiliza para manchar el rojo lumina del recipiente.

Resultados

Una vez completada la cirugía, los ratones fueron transportados al microscopio de dos fotones (Figura1A). Se insertó una micropipe de vidrio que contenía 1 mM de ATP cerca del vaso sanguíneo de destino en la ubicación objetivo (Figura1B).

Realizamos imágenes de hiperpila mientras dabamos una bocanada de 1 mM ATP (Figura2A,Video Suplementario

Discusión

Un desafío para los estudios vasculares es la medición precisa de los diámetros de los vasos. El método que describimos aquí utilizó un objetivo piezoeléctrico motorizado para crear imágenes hiperapiladas rápidas y repetitivas mediante microscopía de dos fotones. En primer lugar, este método permite exámenes repetidos de la arteriola penetrante, 1o orden y 2o orden capilares sin pérdida de enfoque y condujo al descubrimiento de respuestas vasculares lentamente realizadas en capilares in vivo.^...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828