JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج مرشح لقاح الفموي ضد داء السكري نوع 1 في مصنع للأكل.

Abstract

الزراعة الجزيئية النباتية هو استخدام النباتات إنتاج جزيئات ذات الاهتمام. من هذا المنظور، النباتات قد تستعمل كالمفاعلات الحيوية لإنتاج وتنقية اللاحقة للمنتج النهائي والتسليم الشفوي المباشر من البروتينات مغايرة عند استخدام الأنواع النباتية الصالحة للأكل. في هذا العمل، نقدم تطوير اللقاح الفموي ضد داء السكري من النوع 1 (T1D) المرشح في النظم النباتية الصالحة للأكل باستخدام تكنولوجيا المستندة إلى فيروس الحمض النووي المؤتلف مصنع فككت تسليمها مع تسلل الفراغ. النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن بنجر أحمر مضيف مناسب للتعبير عابرة من أوتوانتيجين المشتقة البشرية المرتبطة T1D، يعتبر مرشح واعدة كلقاح T1D. اتسمت الأوراق المنتجة أوتوانتيجين دقة لمقاومتهم لهضم المعدة ووجود تهمة البكتيرية المتبقية لصورتهم الأيضية الثانوية، إعطاء لمحة عامة عن عملية الإنتاج للاستخدام المحتمل محطات للتسليم الشفوي المباشر بروتين مغايرة. وأظهر تحليل لدينا تدهور شبه كامل من اللقاح الفموي المرشح المعصوفه بعد هضم المعدة محاكاة، مما يوحي بأن استراتيجية تغليف في تصنيع اللقاح جاد المشتقة من النباتات مطلوب.

Introduction

ومنذ ثورة البيولوجيا الجزيئية النباتية في الثمانينات، يمكن اعتبار الأنظمة المستندة إلى مصنع لإنتاج صيدلية كبديل للنظم التقليدية القائمة على الخلايا الجرثومية والثدييات1. عرض النباتات العديد من المزايا عبر الأنظمة الأساسية التقليدية، مع قابلية التطوير والفعالية من حيث التكلفة والسلامة هي الأكثر صلة بالموضوع2. يمكن تنقيته من الأنسجة النباتية تحول المنتج المؤتلف وثم إدارته، أما الحقن أو شفويا، وعلاوة على ذلك، تحولت النباتية الصالحة للأكل يمكن أن تستخدم مباشرة للتسليم عن طريق الفم. الطريق الفموي في الوقت نفسه يعزز حصانة المخاطية والجهازية، وأنه يلغي الحاجة للابر والموظفين الطبية المتخصصة. وعلاوة على ذلك، يلغي التسليم الشفوي التجهيز النهائي المعقدة، التي عادة ما تمثل 80 في المائة تكلفة التصنيع الكلي من البروتين المؤتلف3. يمكن ترجمة جميع هذه المزايا إلى تحقيق وفورات في الإنتاج والإمدادات والعمل على الحد من التكاليف لكل جرعة، جعل الدواء بأسعار معقولة لمعظم سكان العالم.

ووضعت العديد من الاستراتيجيات، سواء بالنسبة للتحول مستقرة والتعبير عابرة، لإنتاج البروتينات المؤتلف في النباتات. فيما بينها، نظام تعبير المستندة إلى الفيروسات النباتية فككت الغلة (مثلاً، ماجنيكون) يوفر أداء متفوق يؤدي عالية الغلة من البروتينات المؤتلف على مدى فترات زمنية قصيرة نسبيا4. وترد أمثلة كثيرة لتعبير عابر باستخدام نظام التعبير المستندة إلى الفيروسات النباتية في النباتات بينثاميانا نيكوتيانا ، يجري المضيف الإنتاج معيار الذهب. ومع ذلك، لا يعتبر هذا المصنع النموذجي أنواع الصالحة للأكل نتيجة القلويات وغيرها من الأيض السامة التي تتراكم في أوراقها.

في هذا العمل، ويصف لنا المقارنة بين نظامين النباتية الصالحة للأكل، البنجر الأحمر (الشائع بيتا السيرة الذاتية مولان روج) والسبانخ (سبيناسيا حمقاء السيرة الذاتية اندستريا)، للتعبير عن شكلين مرشح من isoform كاتشين 65 من حمض الجلوتاميك ديكاربوكسيلاسي (GAD65)، التي تقوم بها المصنع القائم على الفيروس متجهات5. GAD65 أوتوانتيجين رئيسية المرتبطة بداء السكري من النوع 1 (T1D)، وحاليا قيد التحقيق في التجارب السريرية البشرية منع أو تأخير T1D بحمل التسامح6. ودرست إنتاج GAD65 في النباتات على نطاق واسع في الأنواع النباتية النموذجية نيكوتيانا تاباكوم و بينثاميانا أ4،5،،من67. وهنا يصف لنا استخدام الأنواع النباتية الصالحة للأكل لإنتاج جزيء في الأنسجة التي يمكن أن تعني لتسليم مباشر عن طريق الفم. من وجهة نظر تقنية، بدراسة وتحديد نظام أجروينفيلتريشن النباتية ومنهاج GAD65 إنتاج زيوت الطعام النباتية من خلال تقييم معلمات مختلفة: تعبير البروتين المؤتلف المستويات، تهمة الميكروبية المتبقية في المصنع الأنسجة يعني للتسليم الشفوي، ومقاومة GAD65 لهضم المعدة، والتكافؤ للنباتات تحول مع نوع البرية.

Protocol

1-أحمر زراعة البنجر والسبانخ

  1. زراعة البنجر الأحمر (الشائع باء-السيرة الذاتية مولان روج) والسبانخ (S. حمقاء السيرة الذاتية اندستريا) النباتات في غرفة لنمو، باستخدام µE 150 من شدة الضوء، 65% رطوبة نسبية، ح 12 دورة الضوء/الظلام في 23/21 درجة مئوية، على التوالي.
  2. بعد إنبات البذور، تسميد النباتات مرتين في أسبوع مع حل 1 غرام/لتر من الأسمدة المتاحة تجارياً (جدول المواد). أجروينفيلتراتيون استخدام السبانخ عمره خمسة في الأسبوع ونباتات البنجر الأحمر عمرها ست الأسبوع.

2-عابر التعبير من خلال التكنولوجيا المستندة إلى الفيروسات النباتية فككت

  1. بناء ناقلات التعبير النبات
    1. إدخال الناقلات-3 'الوحدات النمطية (pICH31070.GAD65mut و pICH31070.∆87G65mut و pICH7410.eGFP)، أعدت كما هو موضح سابقا1،2،7، 5' الوحدة النمطية (pICH20111) ووحدة إينتيجراسي (pICH14011)- سلالة GV3101 tumefaciens المتبعة في استخدام التقنيات القياسية. تنمو على رطل المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل والريفامبيسين ومناسبة من المضادات الحيوية الخاصة بمكافحة ناقلات (50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين، pICH20111، pICH14011 و pICH7410.eGFP)، 50 ميكروغرام/مل كاناميسين ل pICH31070 لمدة يومين في 28 درجة مئوية.
    2. شاشة المستعمرات بمستعمرة PCR استخدام الإشعال المحددة التالية لكل ناقل: 5 '-أتكتاجكتاججتاككتكج-3' و 5 '-أكاككجتاجتكتاتكتكتك-3' 3 ' وحدات pICH31070.GAD65mut و pICH31070.∆87G65mut، مع درجة حرارة انلينغ 55 درجة مئوية و وقت استطالة من 110 ق، 5 '-تجاجتكاتكتجكاككاك-3' و 5 '-أكاككجتاجتكتاتكتكتك-3' للثالثة 3 'pICH7410.eGFP الوحدة النمطية، مع درجة حرارة انلينغ 53 درجة مئوية ووقت استطالة من 30 s، 5'-آتجتكجاتاجتكتكجتاكج-3 'و 5'-تككاككتتاكجاجتكتج-3 ' 5 'الوحدة النمطية، مع درجة حرارة انلينغ 53 درجة مئوية ووقت استطالة من 20 s و 5'-جكاككجتاتجكجاتكك-3 'و 5'-جاتجكجتككجكاكجاكت-3 ' لوحدة إينتيجراسي مع درجة حرارة انلينغ 57 درجة مئوية ووقت استطالة من 45 ثانية.
    3. القيام برد فعل PCR في إجمالي حجم 20 ميكروليتر باستخدام دورة رده فعل معينة التالية: تمسخ 5 دقائق الأولى عند 95 درجة مئوية، دورات 35 من 30 s عند 95 درجة مئوية، 30 ثانية في درجة حرارة انلينغ والخطوة استطالة عند 72 درجة مئوية (الصلب درجة الحرارة واستطالة وقت إعادة محددة لكل زوجين التمهيدي) وخطوة استطالة نهائية من 7 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  2. أجروينفيلتراتيون حقنه
    1. تطعيم ترانسفورمانتس A. tumefaciens الثلاثة في 50 مل رطل متوسطة الحجم تحتوي على 50 الريفامبيسين ميكروغرام/مل والمضادات الحيوية الخاصة بناقلات المناسبة التالية: 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين A. tumefaciens تحول مع pICH20111، pICH14011 أو pICH7410.eGFP، أو 50 ميكروغرام/مل كاناميسين A. tumefaciens تحول مع pICH31070. ينمو بالمصافحة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية.
    2. بيليه الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها بالطرد المركزي في س 4,500 ز لمدة 20 دقيقة وريسوسبيند لهم في 100 مل (أو مجلدين من ثقافة البكتيرية الأولية) من تسلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على حمض مورفولينيثانيسولفونيك 4 10 مم (مس؛ الرقم الهيدروجيني 5.5) و 10 مم MgSO4، دون النظر OD600- احتضان المعلقات في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 3.
    3. مزيج من كميات متساوية من المعلقات البكتيرية التي تحتوي على واحدة من الوحدات الثلاث، GAD65mut، ∆87GAD65mut أو اجفب 3 'وحدة، مع 5' وحدة ووحدة إينتيجراسي. استخدام هذا المزيج تعليق لتسلل حقنه من يترك أحمر البنجر والسبانخ.
    4. ضع 5 مل التعليق في حقنه دون الإبرة. اضغط غيض المحاقن ضد الجانب السفلي النبات السبانخ والنباتات البنجر الأحمر، وفي الوقت نفسه تطبيق كونتيربريسوري لطيف على الجانب الآخر من الورقة.
    5. التسلل يترك الموسع تماما الثلاثة الأولى ابتداء من القمة لكل مصنع. قم بتسمية أوراق أجروينفيلتراتيد مع علامة ورقة على ساق نبات. إرجاع المعامل في دائرة نمو تحت الظروف القياسية.
      ملاحظة: لأسباب تتعلق بالصحة والسلامة، ارتداء العين حماية وقفازات أثناء عملية تسلل.
    6. أجروينفيلتراتيد جمع يترك من 4 14 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة) وتجميدها في نيتروجين سائل. مخزن مصنع النسيج في-80 درجة مئوية.
  3. أجروينفيلتريشن فراغ
    1. تنمو بشكل منفصل ترانسفورمانتس A. tumefaciens الثلاثة في 50 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل والريفامبيسين والمناسبة الخاصة بمكافحة ناقلات المضادات الحيوية عن طريق المصافحة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية.
    2. ريسوسبيند بيليه في 1 لتر من المخزن المؤقت للتسلل إلى OD600 من 0.35 بيليه الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها بالطرد المركزي في س 4,500 ز عن 20 دقيقة واحتضان المعلقات في RT ح 3.
    3. إضافة 0.01% v/v للمنظفات (بوليسوربيت 20) لكل تعليق. مزيج من كميات متساوية من المعلقات البكتيرية التي تحتوي على واحدة من الوحدات الثلاث، GAD65mut، ∆87GAD65mut أو اجفب 3 'وحدة، مع 5' وحدة ووحدة إينتيجراسي.
    4. إدراج مصنع واحد (عمره ست الأسبوع البنجر الأحمر النباتية، انظر القسم 1) في الحامل. عكس صاحب ثم ضعه أعلى كوب يحتوي على حمام تسلل (L 2) إلى غمر الأوراق في وقف عمليات التسلل.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع الأوراق هي انخفضت تماما في تعليق البكتيرية. رفع مستوى بالإضافة إلى وقف تسلل إضافية إذا لزم الأمر.
    5. نقل حمام التسلل مع النباتات المغمورة إلى غرفة عمليات التسلل وإغلاقه. قم بتشغيل المضخة الفراغ وفتح صمام السحب فراغ في قاعة عمليات التسلل.
    6. بمجرد الضغط في الدائرة تسلل انخفض إلى 90 [مبر]، إبقاء الفراغ للحد الأدنى 3 الإفراج عن الفراغ ل 45 ثانية. مرة واحدة قد عاد الدائرة تسلل إلى الضغط الجوي، فتح الدائرة وإزالة النبات تسلل من الحمام البكتيرية.
    7. إرجاع المعامل في دائرة نمو تحت الظروف القياسية.
    8. جمع أوراق أجروينفيلتراتيد في نقطة في البوصة التعبير الأقصى، اعتماداً على البروتين المؤتلف، وتجميدها في نيتروجين سائل. مخزن مصنع النسيج في-80 درجة مئوية.

3. تحليل التعبير البروتين المؤتلف

  1. استخراج البروتين للذوبان الكلي (ملعقة صغيرة)
    1. طحن المحاقن أو فراغ تسلل الأحمر أوراق البنجر والسبانخ، التي جمعت في الخطوات 2.2.6 و 2.3.8، إلى مسحوق ناعم في النتروجين السائل باستخدام مدافع الهاون والمدقة. نقل المسحوق في أنابيب بلاستيكية 15 مل وتخزين المواد في-80 درجة مئوية.
    2. إضافة 900 ميليلتر لاستخراج المخزن المؤقت (pH فوسفات الصوديوم 50 ملم 8.0، ميتابيسولفيتي الصوديوم 20 مم) إلى 300 ملغ مسحوق أوراق.
      ملاحظة: النسبة المحددة بين الوزن الأنسجة النباتية (ملغ) إلى حجم المخزن المؤقت (ميليلتر) هو 1:3.
    3. مجانسة الخليط من فورتيكسينج لمدة 1 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 30,000 س ز لمدة 40 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    4. جمع المادة طافية في أنبوب نظيف وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. نبات اجفب التصور والتقدير الكمي
    1. تحميل 100 ميليلتر لاستخراج ملعقة صغيرة كل التي تم الحصول عليها من اجفب الإعراب عن يترك، في replicates التقنية الثلاث، على لوحة 96-جيدا.
    2. وضع لوحة 96-جيدا في قارئ الأسفار وبدء القياس. استخدام عامل تصفية 485/535 نانومتر مجموعة مطلوبة من أجل الكشف عن الأسفار اجفب.
    3. للتحديد الكمي المطلق، في لوحة نفس إعداد منحنى معايرة تحميل كميات مختلفة (62.5، 125، 500، 750 و 1000 نانوغرام) من اجفب المنقي.
  3. بيسينتشونينيك مقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) لتحديد مقدار ملعقة صغيرة
    1. مزيج من أجزاء 50 من الكاشف A (جدول المواد) مع الجزء 1 من "كاشف ب" (جدول المواد). إعداد حجم كاف لاتفاق التعاون الأساسي الطازجة العامل الحل للعينات لتكون جزيئي ومعايير المعايرة.
      ملاحظة: حجم الحل العامل اتفاق التعاون الأساسي المطلوب لكل عينة من 1.9 مل. للإجراءات المعتادة مع المعايير 9 (بما في ذلك فارغة)، مطلوب 17.1 مل من محلول العامل اتفاق التعاون الأساسي.
    2. "الماصة؛" 0.1 مل من كل مستوى (بما في ذلك فارغة)، ومقتطفات ملعقة صغيرة في أنبوب المسمى.
      ملاحظة: إعداد مجموعة جديدة من ألبومين المصل البقري حسب معايير المعايرة، والمعايير (BSA) في نطاق ميكروغرام/مل 10-1,000، يفضل استخدام نفس مادة كعينات، مثل المياه. يتكون الفارغة من 0.1 مل مخفف المستخدمة للمعايرة القياسية، وإعداد نموذج.
    3. إضافة 1.9 مل من محلول العامل اتفاق التعاون الأساسي ومزيج دقيق. تغطي هذه الأنابيب واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. تبريد الأنابيب لتدبير الرايت امتصاص في 562 شمال البحر الأبيض المتوسط لجميع العينات غضون 10 دقيقة.
      ملاحظة: حتى في الرايت، يستمر وضع اللون. سيتم إدخال أي خطأ كبيرا إذا فعلت قياسات امتصاص جميع الأنابيب خلال 10 دقائق.
    5. طرح 562 نانومتر امتصاص قيمة الفارغة من القراءات المعايير والمقتطفات ملعقة صغيرة.
    6. شمال البحر الأبيض المتوسط مؤامرة 562 فارغة لتصحيح القراءة لكل معيار على تركيزه. تحديد تركيز البروتين لاستخراج كل ملعقة صغيرة.
  4. أداء جل أخذ تلطيخ كما هو موضح سابقا في جيكتشيلي et al.8.
  5. تحليل لطخة غربية
    1. أداء تحليل لطخة غربية كما سبق ذكره في جيكتشيلي et al.8.
    2. بعد فصل البروتينات الغرواني الكهربي، نقلها على غشاء النيتروسليلوز استخدام التقنيات القياسية. تحضير حل حظر بخلط اللبن 4% في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) الأس الهيدروجيني 7.4. كتلة الغشاء مع 10 مل من عرقلة الحل في RT ح 1.
    3. إعداد جسم الأرنب الأولية إزاء المضيفين لمكافحة--GAD65/67 ومكافحة LHCB2، و 1:20,000 لمكافحة--اجفب في 5 مل من محلول حظر مع المنظفات 0.1%. احتضان الغشاء مع حلول استعداد جسم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 4 ح في الرايت مع التحريض المستمر.
    4. تجاهل جسم الأولية ويغسل الغشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مع حظر الحل التي تحتوي على المنظفات 0.1%.
    5. إعداد الفجل البيروكسيديز (HRP)-جسم الأرنب المضادة المتقارنة في المضيفين في عرقلة الحل مع المنظفات 0.1%. احتضان الغشاء عن 1.5 ح في الرايت مع التحريض المستمر.
    6. تجاهل جسم الثانوية ويغسل الغشاء 5 مرات لمدة كل 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني-T (برنامج تلفزيوني وتستكمل مع المنظفات 0.1%).
    7. احتضان الغشاء بمحلول لومينول متاحة تجارياً اتباع إرشادات الشركة المصنعة. الكشف عن إشارة استخدام نظام تصوير تشيميلومينيسسينسي.

4-محطة معالجة المواد

  1. حصاد البنجر الأحمر الإعراب عن ∆87GAD65mut أجروينفيلتراتيد فراغ يترك في ذروة التعبير (11 نقطة في البوصة) وتجميدها في نيتروجين سائل.
  2. ليوفيليزي يترك المجمدة ح 72-50 درجة مئوية و 0.04 [مبر]. تخزينها في-80 درجة مئوية.
  3. تطحن الأوراق إلى مسحوق ناعم وتخزينها في RT في حاوية مغلقة مع هلام السليكا استبعاد الرطوبة.

5-المعدة الهضم المحاكاة وخلية تحليل سلامة

  1. محاكاة عملية الهضم المعدة
    1. تزن 100 مغ أوراق البنجر الأحمر المعصوفه مطحون وريسوسبيند أنه في 6 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).
    2. قم بضبط درجة الحموضة عينة إلى 2 مع 6 M HCl.
    3. إضافة بيبسن 4 مغ/مل من الغشاء المخاطي المعدة الخنزير في 10 ملم HCl للحصول على تركيز 1 ملغ/مل بيبسن نهائي أو بنسبة 01:20 إلى مجموع البروتينات القابلة للذوبان. هزة العينة في 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.
    4. ضبط العينات لدرجة الحموضة 8 مع هيدروكسيد الصوديوم م 1 لإلغاء تنشيط في محيط.
    5. الطرد المركزي 750 مختبرين ميليلتر لكل عينة في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية بشكل منفصل وريسوسبيند بيليه في مجلد واحد طافية تحميل المخزن المؤقت (1.5 م تريس HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 3% الحزب الديمقراطي الصربي ووالغليسيرول 15% 4% 2-ميركابتوثانول).
      ملاحظة: لأسباب تتعلق بالصحة والسلامة، ارتداء القفازات وتعمل تحت غطاء الدخان لإعداد نموذج.
    6. تحليل المادة طافية وبيليه ريسوسبينديد ب تحليل لطخة غربية8.
  2. تحليل سلامة الخلية
    1. إعداد نموذجين من 100 مغ أوراق البنجر الأحمر المعصوفه مطحون وريسوسبيند في 6 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) على حد سواء.
    2. ضبط درجة الحموضة من فقط واحدة عينة إلى 2 مع 6 M HCl. يهز كل العينات في 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.
    3. الطرد المركزي 750 مختبرين ميليلتر لكل عينة في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية بشكل منفصل وريسوسبيند بيليه في مجلد واحد طافية تحميل المخزن المؤقت.
    4. تحليل المادة طافية وبيليه ريسوسبينديد بتحليل لطخة غربية.

6-بيوبوردين بالانزيم

  1. تزن 100 مغ أوراق البنجر الأحمر المعصوفه. ريسوسبيند المسحوق في 8 مل PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4) ودوامه لمدة 1 دقيقة.
  2. إعداد متوسطة رطل دون المضادات الحيوية أو التي تحتوي على (ط) 50 ميكروغرام/مل الريفامبيسين (ثانيا (50 ميكروغرام/مل كل الريفامبيسين وكاربينيسيلين، (ثالثا) 50 ميكروغرام/مل كل الريفامبيسين وكاناميسين أو (رابعا) 50 ميكروغرام/مل كل من الريفامبيسين وكاربينيسيلين وكاناميسين.
  3. بلايت 1 مل من كل هوموجيناتي ليف المعصوفه في واحدة من وسائل الإعلام الانتقائي 5 رطل.
  4. احتضان جميع لوحات لمدة 3 أيام في 28 درجة مئوية.
  5. عد المستعمرات المتبعة التي نمت في كل لوحة.
  6. حساب وتحديد المسؤول عن البكتيريا المتبقية كعدد وحدات تشكيل مستعمرة (زيمبابوي) الواحد مل من نبات المعصوفه هوموجيناتي (زيمبابوي/mL).

7-المستقلب الاستخراج

  1. استخراج المستقلب الرئيسي
    1. تزن 30 ملغ-80 درجة مئوية المخزنة، وفراغ أجروينفيلتراتيد ∆87GAD65mut-الإعراب عن مسحوق نبات البنجر الأحمر في أنبوب بلاستيكي 2 مل.
    2. إضافة ميليلتر 750 الباردة 70/30 (v/v) الميثانول/كلوروفورم ودوامه لإينكوباتي س. 30 في-20 درجة مئوية ح 2.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع المذيبات والمواد المضافة إلى الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
    3. إضافة 600 ميليلتر من الماء البارد وأجهزة الطرد المركزي في 17,900 س ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10 جمع ونقل في مرحلة hydroalcoholic العلوي في أنبوب 2 مل جديدة. تجاهل مرحلة تشلوروفورميك السفلي وفي الطور البيني.
    4. وضع العينات في مركز فراغ ح 3 إلى تتبخر المذيبات.
    5. حل بيليه التي تم الحصول عليها من الخطوة 7.1.4 في 300 ميليلتر من 50/50 (v/v) الاسيتو الانيتريل والماء و sonicate عينات لمدة 3 دقائق.
    6. تمرير الحلول من خلال 0.2 ميكرومتر غشاء فلاتر ووضعها موضع شفافية ثابت 300 ميليلتر إدراج أنابيب زجاجية.
  2. استخراج المستقلب الثانوية
    1. تزن 300 ملغ-80 درجة مئوية المخزنة، وفراغ أجروينفيلتراتيد ∆87GAD65mut-الإعراب عن مسحوق نبات البنجر الأحمر في أنبوب بلاستيك 15 مل.
    2. أضف 3 مل ميثانول، دوامة لمدة 30 ثانية، و sonicate في 40 كيلو هرتز لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع المذيبات والمواد المضافة إلى الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
    3. الطرد المركزي هذه العينات في س 4,500 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونقل سوبيرناتانتس في أنابيب 15 مل جديدة.
    4. ميليلتر 100 مخفف لاستخراج 1:3 (v/v) مع الماء وتمرير الحل من خلال مرشح غشاء 0.2 ميكرومتر.
    5. وضع الحل في أنبوب زجاج إدراج 300 ميليلتر ثابتة شفافة.
  3. استخراج الدهن القطبي
    1. تزن 200 ملغ-80 درجة مئوية المخزنة، وفراغ أجروينفيلتراتيد ∆87GAD65mut-الإعراب عن مسحوق نبات البنجر الأحمر في أنبوب بلاستيك 15 مل.
    2. إضافة 200 ميليلتر من الماء ومن ثم 2 مل من الميثانول، ومن ثم الحفاظ على الجليد ح 1.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع المذيبات والمواد المضافة إلى الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
    3. دوامة لمدة 30 ثانية و sonicate في 40 كيلو هرتز لمدة 15 دقيقة.
    4. الطرد المركزي على عينات في س 4,500 ز في 4 درجات مئوية عن 25 دقيقة جمع ونقل في مرحلة كلوروفورم في أنابيب 2 مل. تجاهل مرحلة hydroalcoholic العلوي وفي الطور البيني.
    5. وضع العينات في مركز فراغ ح 3 إلى تتبخر المذيبات.
    6. حل بيليه التي تم الحصول عليها من الخطوة 7.3.5 مع 600 ميليلتر من الميثانول.
    7. ميليلتر 100 مخفف لاستخراج 1:5 (v/v) مع الميثانول وتمرير الحل من خلال عامل تصفية غشاء 0.2 ميكرومتر.
    8. وضع الحل في أنبوب زجاج إدراج 300 ميليلتر ثابتة شفافة.

8-السائل اللوني الكتلي تحليل ومعالجة البيانات

  1. إعداد نظام LC-مرض التصلب العصبي المتعدد حسبما أوصت به المورد.
    ملاحظة: المقطع LC يتكون من أوتوسامبلير يقترن [هبلك] مزودة بعمود حرس C18 (75 × 2.1 ملم، والجسيمات حجم 5 ميكرون) أمام عمود C18 (150 × 2.1 ملم، والجسيمات حجم 3 ميكرومتر) لتحليل نواتج الأيض الثانوية والدهون القطبية ، بينما مع عمود حرس هيليك (7.5 × 2.1 ملم، 3 ميكرومتر) أمام عمود هيليك (150 × 2.1 ملم، والجسيمات الحجم 2.7 ميكرومتر). مرض التصلب العصبي المتعدد مطياف شامل فخ أيون تزويدها تاين اليكتروسبراي (ESI) أو مصادر التأين الكيميائي (المبادرة) في ضغط الجوي.
  2. إعداد المذيبات المناسبة للتدرجات [هبلك]. لتحليل المستقلب الرئيسي، استخدم فورمات الأمونيوم عيار 20 ملم كمذيب ألف؛ الاسيتو الانيتريل 95%، 5% من المياه بالإضافة إلى فورمات الأمونيوم 10 ملم كباء المذيبات لتحليل المستقلب الثانوية، استخدام المياه بالإضافة إلى 0.05% حمض الفورميك (A) والاسيتو الانيتريل زائد حمض الفورميك 0.05% (ب). لتحليل الدهن القطبي، واستخدام المياه بالإضافة إلى 0.05% حمض الفورميك (A) و 100 ٪ الاسيتو الانيتريل (ب).
    ملاحظة: المذيبات والمواد المضافة يجب أن يكون الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
  3. استخدام التدرجات عنها في الجدول 1 شطف المستقلب. مجموعة التدفق معدل 0.2 مل/دقيقة حقن 10 ميليلتر لكل عينة لنواتج الأيض الثانوية والدهون القطبية، بينما تضخ 5 ميليلتر لنواتج الأيض الأساسي.
  4. إعداد عينة مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) بخلط أجزاء متساوية من عينات مختلفة خليط ممثل لكل حالة تجريبية. تحليل عينة مراقبة الجودة أثناء التجربة لرصد فعالية الصك. على وجه التحديد، إدراج إجراء تحليل عينة مراقبة الجودة بعد كل 10 عينة--دفعة.
  5. العينات لتجنب آثار أداة يحركها بطريقة عشوائية.
  6. بعد تحليل 9، قم بإدراج عمود التنظيف الأسلوب وتحليل فارغة مباشرة بعد.
    ملاحظة: إجراء تدرج بطيء بين المذيبات اثنين مع شطف isocratic نسبة مئوية عالية من المذيب أقوى. الفراغ يتكون من حقن الميثانول النقي: المياه (50/50، v/v) لتحسين الاحتفاظ الوقت إمكانية تكرار نتائج في التحليل التالي.
  7. إعداد الأداة للحصول على الأطياف الشامل في وسائط بديلة التأين الإيجابية والسلبية باستخدام المعلمات المسرودة في الجدول 2.
    ملاحظة: معلمات أخرى تعتمد على منصة محددة.
  8. القيام بتجهيز البيانات التالية كما هو موضح في Dal سانتو et al.9.

النتائج

ويرد في هذا العمل، وسير العمل لتطوير لقاح الشفوي في الأنسجة النباتية الصالحة للأكل. أن التركيز في هذا العمل هو التعبير عن البروتين المستهدف في أنواع النباتية مضيف الصالحة للأكل، وتوصيف اللقاح الفموي المحتملة.

وشملت الخطوة الأولى في تقيي...

Discussion

واظهرنا في هذه الدراسة تحليل أولى لتصميم لقاح المرشح عن طريق الفم لمرض السكري المناعة الذاتية. البروتين المستهدف لهذه التجربة هو أحد أشكال كاتشين 65 البشرية Decarboxylase غلوتامات، هي الإنتاج والوظائف التي لا يمكن اكتشافها بسهولة وقابلة للقياس12المتحولة. في التعبير في الأنسجة النب?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها المشروع المشترك "استخدام النباتات لإنتاج لقاح للأكل لمرض السكري المناعة الذاتية (أديفا)" (معرف المشروع: 891854) ممولة من جامعة فيرونا في إطار نداء عام 2014.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filtersSartorius-Stedim17764
2–mercaptoethanolSigmaM3148Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)SigmaM8250pH 5.5
96-well plateSarstedt833924
Acetic acidSigma27221Corrosive
Acetonitrile LC-MS gradeSigma34967
AcetosyringoneSigmaD134406Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological GradeApplichemA094915 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formateSigma70221
Anti-eGFP antibodyABCamab290
Anti-GAD 65/67 antibodySigmaG5163
Anti-LHCB2 antibodyAgriseraAS01 003
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
C18 ColumnGrace   -Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard ColumnGrace   -Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15Fertilizer
Carbenicillin disodiumDuchefa BiochemieC0109Toxic
Chemiluminescence imaging systemBioRad1708370ChemiDoc Touch Imaging System
ChloroformSigmaC2432
DetergentSigmaP5927Polysorbate 20
Fluorescence readerPerkin-Elmer 1420-011VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS gradeSigma94318
GlycerolSigmaG551615 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerasePromegaM7841
HClSigmaH1758Corrosive
HILIC ColumnGrace   -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard ColumnGrace   -Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibodySigmaA6154Do not freeze/thaw too many times
HPLC AutosamplerBeckman Coulter   -System Gold 508 Autosampler
HPLC SystemBeckman Coulter   -System Gold 128 Solvent Module HPLC
IsopropanolSigma24137Flamable
Kanamycin sulfateSigmaK4000Toxic
KClSigmaP95412 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4SigmaP97912.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solutionGe HealthcareRPN2232Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator5PascalLIO5P0000DGT
Mass SpectometerBruker Daltonics  -Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
MethanolSigma32213
MgSO4SigmaM7506
Milk-blocking solutionRistora   -3 % in PBS
Na2HPO4SigmaS7907Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaClSigmaS301480 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4SigmaS8282 Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOHSigmaS8045
Nitrocellulase membraneGe Healthcare10600002
Pepsin from porcine gastric mucosaSigmaP7000
Peroxidase substrate ECLGE HealthcareRPN2235Light sensitive material
Pump Vacuum PressVWR111400000098
Reagent ASigmaB9643Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent BSigmaB9643Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
RifampicinDuchefa BiochemieR0146Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)SigmaL3771Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphiteSigma7681-57-4
Sonicator systemSoltec090.003.0003Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
SyringeTerumo   -
Transparent fixed 300-µL insert glass tubesThermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
TryptoneFormediumTRP0310 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentratorHeto3878 F1-3Speed-vac System
Water LC-MS gradeSigma39253
Yeast extractSigmaY13335 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

References

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?. Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. . Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015)
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145 T1D GAD65

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved