Expresión transitoria en remolacha roja de una vacuna candidata biofarmacéutica para la Diabetes tipo 1

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para producir a un candidato de vacuna oral contra la diabetes tipo 1 en una planta comestible.

Resumen

Planta la agricultura molecular es el uso de plantas para producir moléculas de interés. En esta perspectiva, las plantas pueden utilizarse tanto como biorreactores para la producción y purificación posterior del producto final y para la administración oral directa de proteínas heterólogas al utilizar especies de plantas comestibles. En este trabajo presentamos el desarrollo de la vacuna oral contra la Diabetes de tipo 1 (T1D) candidato en sistemas de plantas comestibles utilizando tecnología del ADN recombinante basado en el virus de la planta deconstruido, entregada con infiltración vacío. Nuestros resultados muestran que una remolacha roja es un huésped adecuado para la expresión transitoria de un autoantígeno derivada humana asociada a T1D, considerado como un candidato prometedor como vacuna T1D. Hojas produciendo el autoantígeno bien se caracterizaron por su resistencia a la digestión gástrica, la presencia de carga bacteriana residual y su perfil metabólico secundario, dando una visión general de la producción de proceso para el uso potencial de las plantas para administración oral directa de una proteína heteróloga. Nuestro análisis demostró la degradación casi completa de la vacuna oral liofilizada candidato tras una digestión gástrica simulada, lo que sugiere que una estrategia de encapsulación en la fabricación de la vacuna de GAD de origen vegetal se requiere.

Introducción

Desde la revolución de biología molecular de plantas en la década de 1980, los sistemas basados en plantas para la producción de biofármacos pueden considerarse como una alternativa a los sistemas tradicionales basados en células microbianas y mamíferos¹. Las plantas muestran varias ventajas sobre las plataformas tradicionales, con escalabilidad, eficacia y seguridad, siendo los más relevantes². El producto recombinante puede ser purificado a partir de tejido vegetal transformado y entonces administrado, ya sea por vía parenteral o por vía oral y, además, transformada de plantas comestibles se pueden utilizar directamente para administración oral. La vía oral al mismo tiempo promueve la inmunidad mucosa y sistémica, y elimina la necesidad de agujas y personal médico especializado. Además, la administración oral elimina el complejo proceso aguas abajo, que normalmente representa el 80% del costo total de fabricación de una proteína recombinante³. Todas esas ventajas se pueden traducir en un ahorro en la producción, insumos y mano de obra reduciendo los costos de cada dosis, lo que el fármaco asequibles a la mayoría de la población mundial.

Varias estrategias, tanto para la transformación estable y expresión transitoria, fueron desarrolladas para la producción de proteínas recombinantes en plantas. Entre ellos, un sistema de expresión basados en virus de planta deconstruido de alto rendimiento (por ejemplo, magnICON) proporciona funcionamiento superior conduce a altos rendimientos de proteínas recombinantes sobre escalas de tiempo relativamente corto⁴. Se reportan muchos ejemplos de expresión transitoria mediante el sistema de expresión basados en virus vegetales en plantas de Nicotiana benthamiana , siendo el host de producción estándar de oro. Sin embargo, esta planta de modelo no se considera como una especie comestible debido a los alcaloides y otros metabolitos tóxicos que se acumulan en sus hojas.

En este trabajo, describimos la comparación entre dos sistemas de la planta comestible, remolacha roja (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) y espinacas (Spinacea oleracea cv Industria), para la expresión de dos formas de candidato de la isoforma 65 kDa de ácido glutámico decarboxilasa (GAD65), llevado a cabo por la planta basada en virus vectores⁵. GAD65 es un autoantigen importante asociado a Diabetes de tipo 1 (T1D) y actualmente está bajo investigación en ensayos clínicos en humanos para prevenir o retrasar la T1D induciendo tolerancia⁶. La producción de GAD65 en plantas se ha estudiado extensivamente en especies modelo como Nicotiana tabacum y N. benthamiana^4,5,6,7. Aquí, describimos el uso de especies de plantas comestibles para la producción de la molécula en los tejidos que puede significar para una administración oral directa. Desde un punto de vista técnico, estudia y selecciona el sistema de planta agroinfiltration y la plataforma de plantas comestibles para la producción de GAD65 mediante la evaluación de diferentes parámetros: los niveles de la expresión de proteína recombinante, la carga microbiana residual en la planta tejido para administración oral, la resistencia de GAD65 en la digestión gástrica y la bioequivalencia de las plantas transformadas con el tipo salvaje.

Protocolo

1. rojo cultivo de remolacha y espinacas

1. Cultivar la remolacha roja (B. vulgaris cv Moulin Rouge) y espinacas (S. oleracea cv Industria) plantas en una cámara de crecimiento, con 150 µE de intensidad de luz, humedad relativa de 65%, ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 23/21 ° C, respectivamente.
2. Después de la germinación de la semilla, fertilizar las plantas dos veces a la semana con una solución de 1 g/L de fertilizante disponible en el mercado (Tabla de materiales). Para agroinfiltration use espinaca de cinco semanas de edad y plantas de remolacha roja de seis semanas de edad.

2. transitoria expresión a través de la tecnología basada en virus de planta deconstruido

1. Construcción de vectores de expresión de planta
   1. Introducir los vectores - el módulo de 5' (pICH20111), los 3' módulos (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut y pICH7410.eGFP), preparados como se describió anteriormente^1,2,7y el módulo de la integrasa (pICH14011)- en la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 utilizando técnicas estándar. Crecer en medio LB que contienen 50 μg/mL rifampicina y antibióticos apropiados de vectores específicos (50 carbenicilina μg/mL para pICH20111, pICH14011 y pICH7410.eGFP), 50 kanamicina μg/mL para pICH31070 por 2 días a 28 ° C.
   2. Las colonias Colonia PCR utilizando los cebadores específicos siguientes para cada vector de la pantalla: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' y 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' para el 3' módulos pICH31070.GAD65mut y pICH31070.∆87G65mut, con una temperatura de recocido de 55 ° C y un tiempo de elongación de 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' y 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' para el tercer 3' pICH7410.eGFP del módulo, con una temperatura de recocido de 53 ° C y un tiempo de elongación de 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' y 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' para el módulo de 5', con una temperatura de recocido de 53 ° C y un tiempo de elongación de 20 s y 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' y 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' para el módulo de la integrasa con una temperatura de recocido de 57 ° C y un tiempo de elongación de 45 s.
   3. Llevar a cabo la reacción de PCR en un volumen total de 20 μL con el siguiente ciclo de reacción específica: 5 minutos desnaturalización inicial a 95 ° C, 35 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a la temperatura de recocido y el paso de elongación a 72 ° C (temperatura y alargamiento del tiempo de recocido a re específico para cada pareja de imprimación) y a un paso de elongación final de 7 min a 72 ° C.
2. Jeringa agroinfiltration
   1. Inocular los tres transformantes de a. tumefaciens en 50 mL de-rifampicina de μg/mL LB y 50 medianas que contiene y los siguientes antibióticos apropiados de vectores específicos: 50 carbenicilina μg/mL para a. tumefaciens transformada con pICH20111, pICH14011 o pICH7410.eGFP o 50 kanamicina μg/mL para a. tumefaciens transformada con pICH31070. Crecer por agitación durante la noche a 28 ° C.
   2. Pelotilla de culturas bacterianas durante la noche por centrifugación a 4.500 x g por 20 min y resuspender en 100 mL o dos volúmenes de la cultura bacteriana inicial del búfer de infiltración que contienen ácido 4-morpholineethanesulfonic de 10 mM (MES; pH 5.5) y 10 mM MgSO₄, sin tener en cuenta el OD_600. Incubar las suspensiones a temperatura ambiente (RT) 3 h.
   3. Mezclar volúmenes iguales de suspensiones bacterianas que contienen uno de los tres módulos, GAD65mut, ∆87GAD65mut o eGFP 3' módulo con 5' módulo y módulo de integrasa. Utilizar la mezcla de suspensión para infiltración de jeringa de hojas de espinacas y remolacha rojos.
   4. Colocar 5 mL de la suspensión en una jeringa sin la aguja. Presione la punta de la jeringa contra la parte inferior de la hoja de espinaca y plantas de remolacha roja y mientras tanto se aplica una contrapresión suave al otro lado de la hoja.
   5. Infiltrarse en las primero tres hojas completamente ampliadas desde el ápice de cada planta. Las hojas de agroinfiltrated con una etiqueta de papel en el tallo de la hoja de la etiqueta. Volver las plantas en una cámara de crecimiento bajo condiciones estándar.
      Nota: Por razones de salud y seguridad, use guantes y protección ocular durante el proceso de infiltración.
   6. Agroinfiltrated recoger las hojas de 4 a 14 días post infección (dpi) y congelar en nitrógeno líquido. Tejido de la planta tienda a-80 ° C.
3. Agroinfiltration vacío
   1. Crecer por separado las tres a. tumefaciens transformantes en 50 mL de medio LB que contienen 50 μg/mL rifampicina y vector específico apropiado antibiótico por agitación durante la noche a 28 ° C.
   2. Pellets durante la noche las culturas bacterianas por centrifugación a 4.500 x g durante 20 min Resuspender el precipitado en 1 L de tampón de infiltración a un OD₆₀₀ de 0.35 e incuban las suspensiones a temperatura ambiente durante 3 horas.
   3. Añadir 0.01% v/v del detergente (polisorbato 20) a cada suspensión. Mezclar volúmenes iguales de suspensiones bacterianas que contienen uno de los tres módulos, GAD65mut, ∆87GAD65mut o eGFP 3' módulo con 5' módulo y módulo de integrasa.
   4. Insertar una planta (remolacha roja de seis semanas de edad de la planta, véase la sección 1) en el soporte. Invierta el soporte y coloque encima un vaso de precipitados que contiene el baño de infiltración (2 L) para sumergir las hojas en la suspensión de la infiltración.
      Nota: Asegúrese de que todas las hojas se sumergen completamente en la suspensión bacteriana. Elevar el nivel con la incorporación de la suspensión de infiltración extra si es necesario.
   5. El baño de infiltración con la planta sumergida de transferencia a la cámara de infiltración y ciérrelo. Encienda la bomba de vacío y abrir la válvula de toma de aspiración de la cámara de infiltración.
   6. Una vez que la presión en la cámara de infiltración ha reducido a 90 mbar, mantener el vacío durante 3 minutos lanzamiento el vacío para 45 s. Una vez que la cámara de infiltración ha regresado a la presión atmosférica, abrir la cámara y retirar la planta infiltrada del baño bacteriano.
   7. Volver las plantas en una cámara de crecimiento bajo condiciones estándar.
   8. Recoger hojas de agroinfiltrated en el dpi máxima expresión, dependiendo de la proteína recombinante y congelar en nitrógeno líquido. Tejido de la planta tienda a-80 ° C.

3. Análisis de la expresión de la proteína recombinante

1. Extracción de proteínas solubles totales (TSP)
   1. Moler la jeringa o vacío se infiltraron en hojas de remolacha y espinacas rojas, recogidos en los pasos 2.2.6 y 2.3.8, a polvo fino en nitrógeno líquido mediante mortero. Transferir el polvo en tubos de plástico de 15 mL y almacenar el material a-80 ° C.
   2. Agregar 900 μl de tampón de extracción (50 mM fosfato de sodio pH 8.0, metabisulfito de sodio 20 mM) a 300 mg de polvo de la hoja.
      Nota: La proporción seleccionada entre peso de tejido de planta (mg) al volumen de buffer (μL) es 1:3.
   3. Homogeneizar la mezcla con un vórtex durante 1 minuto, luego centrifugar a 30.000 x g durante 40 min a 4 ° C.
   4. Recoger el sobrenadante en un tubo limpio y almacenar a-80 ° C.
2. Planta eGFP visualización y cuantificación
   1. Carga de 100 μl de cada extracto TSP de eGFP expresar hojas, en tres repeticiones de la técnicas, sobre una placa de 96 pocillos.
   2. Poner la placa de 96 pocillos en un lector de fluorescencia y comenzar la medición. Utilice el filtro de 485/535 nm sistema requerido para la detección de la fluorescencia de eGFP.
   3. Para la cuantificación absoluta, en el mismo plato preparar una curva de calibración diferentes cantidades de carga (62.5, 125, 500, 750 y 1.000 ng) de una purificada eGFP.
3. Ensayo de ácido Bicinchoninic (BCA) para la cuantificación de TSP
   1. Mezcle 50 partes de reactivo A (Tabla de materiales) con 1 parte de reactivo B (Tabla de materiales). Preparar un volumen suficiente de solución de trabajo de BCA fresco para las muestras a ensayar y los estándares de calibración.
      Nota: El volumen de solución de trabajo BCA requerido para cada muestra es de 1,9 mL. El procedimiento estándar con 9 niveles (incluyendo un espacio en blanco), 17,1 mL de solución de trabajo de la BCA se requiere.
   2. Pipetear 0,1 mL de cada estándar (incluyendo un espacio en blanco) y extractos TSP en un tubo etiquetado.
      Nota: Como patrones de calibración, preparar una nueva serie de albúmina de suero bovino (BSA) normas en el rango de 10-1.000 μg/mL, preferentemente con el mismo diluyente como muestras, como el agua. El espacio en blanco consiste en 0.1 mL del diluyente utilizado para la calibración estándar y preparación de la muestra.
   3. Añadir 1,9 mL de solución de trabajo de BCA y mezclar bien. Cubra los tubos e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
   4. Enfriar los tubos a RT. medir la absorbancia a 562 nm de todas las muestras dentro de 10 minutos.
      Nota: Incluso en RT, continúa el desarrollo del color. Se introducirá ningún error significativo si las mediciones de absorbancia de todos los tubos se hacen dentro de 10 minutos.
   5. Restar el valor de absorbancia nm 562 del espacio en blanco de las lecturas de los estándares y los extractos TSP.
   6. Parcela el 562 corregida nm de cada estándar en su concentración. Determinar la concentración de proteína de cada extracto TSP.
4. Realizar el Coomassie gel de coloración según se describió anteriormente en Gecchele et al⁸.
5. Análisis de Western blot
   1. Realizar el análisis de western blot como se describió anteriormente en Gecchele et al⁸.
   2. Después de la separación electroforética de proteínas, transferencia a una membrana de nitrocelulosa, usando las técnicas estándar. Prepare la solución de bloqueo mediante la mezcla de leche de 4% en tampón fosfato salino pH de (PBS) 7.4. Bloquear la membrana con 10 mL de la solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora.
   3. Preparar el conejo de anticuerpo primario 1: 10,000 para la anti-GAD65/67 y anti-LHCB2 y 1: 20.000 para el anti-eGFP en 5 mL de solución de bloqueo con 0,1% detergente. Incubar la membrana con las soluciones de anticuerpo primario preparado durante la noche a 4 ° C o 4 h a temperatura ambiente con agitación constante.
   4. Deseche el anticuerpo primario y lavar la membrana 3 veces por 5 minutos cada uno con solución de bloqueo con 0,1% detergente.
   5. Preparar la peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado anticuerpos anti-a 1: 10,000 en el bloqueo de solución con 0,1% detergente. Incubar la membrana durante 1,5 h a TA con agitación constante.
   6. Deseche el anticuerpo secundario y lavar la membrana 5 veces por 5 minutos cada uno con PBS-T (PBS suplementado con 0,1% detergente).
   7. Incubar la membrana con una solución de luminol comercialmente disponibles siguiendo las instrucciones del fabricante. Detectar la señal utilizando un sistema de proyección de imagen de quimioluminescencia.

4. procesamiento de material de planta

1. Cosecha de la remolacha roja expresando ∆87GAD65mut agroinfiltrated vacío deja en la cima de la expresión (11 dpi) y congelar en nitrógeno líquido.
2. Liofilizar las hojas congeladas durante 72 h a-50 ° C y 0.04 mbar. Almacenar a-80 ° C.
3. Moler las hojas a polvo fino y guárdelo a temperatura ambiente en un recipiente hermético con gel de sílice para excluir la humedad.

5. Análisis de integridad celular y simulación gástrica de la digestión

1. Simulación de la digestión gástrica
   1. Pesar 100 mg de hojas de remolacha roja liofilizada grinded y resuspender en 6 mL de PBS (pH 7.4).
   2. Ajustar el pH de la muestra 2 con 6 M de HCl.
   3. Añadir pepsina 4 mg/mL de mucosa gástrica de cerdo en 10 mM HCl para obtener una concentración de pepsina final de 1 mg/mL o un cociente de 1:20 para proteínas solubles totales. Agitar la muestra a 37 ° C durante 120 minutos.
   4. Ajustar las muestras a pH 8 con 1 M NaOH para hacer inactivo de la pepsina.
   5. Centrifugar 750 alícuotas de μl de cada muestra a 20.000 x g durante 20 min a 4 ° C. Recoger por separado el sobrenadante y resuspender el precipitado en un volumen de sobrenadante de buffer de carga (1,5 M Tris HCl, pH 6.8, SDS 3% y glicerol al 15% 4% 2-Mercaptoetanol).
      Nota: Por razones de salud y seguridad, guantes y trabajar bajo campana extractora para preparación de muestras.
   6. Analizar el sobrenadante y el sedimento resuspendido por la mancha blanca /negra occidental análisis⁸.
2. Análisis de integridad de la célula
   1. Preparar dos muestras de 100 mg de hojas de remolacha roja liofilizada grinded y resuspender en 6 mL de PBS (pH 7.4).
   2. Ajustar el pH de sólo uno de la muestra 2 con 6 M HCl. agitar ambas muestras a 37 ° C durante 120 minutos.
   3. Centrifugar 750 alícuotas de μl de cada muestra a 20.000 x g durante 20 min a 4 ° C. Recoger por separado el sobrenadante y resuspender el precipitado en un volumen de sobrenadante de buffer de carga.
   4. Analizar el sobrenadante y el sedimento resuspendido por análisis de western blot.

6. carga microbiana ensayo

1. Pesar 100 mg de hojas de remolacha roja liofilizada. Suspender el polvo en 8 mL de PBS estéril (pH 7.4) y agitar durante 1 minuto.
2. Preparar el medio LB sin antibióticos o que contienen rifampicina μg/mL (i) 50, (ii) 50 μg/mL de cada una de rifampicina y carbenicilina, (iii) 50 μg/mL de cada de rifampicina y kanamicina o (iv) 50 μg/mL cada de rifampicina, carbenicilina y kanamicina.
3. Placa 1 mL de cada homogenado liofilizado hoja en uno de los 5 medios selectivos de LB.
4. Incubar las placas durante 3 días a 28 ° C.
5. Contar las colonias de Agrobacterium en cada plato.
6. Calcular y definir la carga bacteriana residual como el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por mL del homogeneizado de liofilizado hoja (UFC/mL).

7. extracción de metabolitos

1. Extracción de metabolitos primarios
   1. Pesar 30 mg de-80 ° C almacena, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expresión de vacío polvo de hojas de remolacha roja en un tubo de plástico de 2 mL.
   2. Añadir 750 μl de frío 70/30 (v/v) metanol/cloroformo y agitar por 30 s. incubar a-20 ° C por 2 h.
      Nota: Todos los disolventes y aditivos deben ser grado de LC-MS.
   3. Añadir 600 μl de agua fría y centrifugar a 17.900 x g a 4 ° C durante 10 minutos recoja y transferencia de la fase hidroalcohólica superior en un nuevo tubo de 2 mL. Deseche la fase es menor y la interfase.
   4. Coloque las muestras en un concentrador de vacío durante 3 horas para evaporar los solventes.
   5. Disolver los pellets obtenidos de paso 7.1.4 en 300 μL de acetonitrilo/agua 50/50 (v/v) y someter a ultrasonidos las muestras durante 3 minutos.
   6. Pasar las soluciones a través de filtros de membrana de 0,2 μm y ponerlos en un transparente fijo 300 μL insertar tubos de vidrio.
2. Extracción de metabolitos secundarios
   1. Pesar 300 mg de-80 ° C almacena, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expresión de vacío polvo de hojas de remolacha roja en un tubo de plástico de 15 mL.
   2. Añadir 3 mL de metanol, vortex durante 30 s y someter a ultrasonidos a 40 kHz durante 15 minutos.
      Nota: Todos los disolventes y aditivos deben ser grado de LC-MS.
   3. Centrifugar las muestras a 4.500 x g a 4 ° C por 10 min y transferir el sobrenadante a nuevos tubos de 15 mL.
   4. Diluir 100 μl de extracto de 1:3 (v/v) con agua y pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,2 μm.
   5. Poner la solución en un transparente fijo 300 μL insertar tubo de vidrio.
3. Extracción de lípidos polares
   1. Pesar 200 mg de-80 ° C almacena, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expresión de vacío polvo de hojas de remolacha roja en un tubo de plástico de 15 mL.
   2. Añadir 200 μL de agua y luego 2 mL de metanol y luego mantener en hielo durante 1 hora.
      Nota: Todos los disolventes y aditivos deben ser grado de LC-MS.
   3. Vortex durante 30 s y someter a ultrasonidos a 40 kHz durante 15 minutos.
   4. Centrifugar las muestras a 4.500 x g a 4 ° C durante 25 minutos recoge y transferencia de la fase de cloroformo en los tubos de 2 mL. Descartar la fase superior hidroalcohólico y la interfase.
   5. Coloque las muestras en un concentrador de vacío durante 3 h para evaporar el solvente.
   6. Disolver el precipitado obtenido en el paso 7.3.5 con 600 μl de metanol.
   7. Diluir 100 μl de extracto 1:5 (v/v) con metanol y pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0.2 μm.
   8. Poner la solución en un transparente fijo 300 μL insertar tubo de vidrio.

8. líquido cromatografía espectrometría de masas en análisis y procesamiento de datos

1. Configurar el sistema LC-MS según lo recomendado por el proveedor.
   Nota: La sección de LC consta de un muestreador automático juntada con HPLC equipado con una columna C18 guardia (75 x 2.1 mm, partículas tamaño 5 μm) frente a una columna de C18 (150 x 2.1 mm, partículas tamaño 3 μm) para el análisis de metabolitos secundarios y lípidos polares , mientras que con una columna de guardia HILIC (7.5 x 2.1 mm, 3 μm) frente a una columna de HILIC (150 x 2.1 mm, partículas tamaño 2.7 μm). La MS es un espectrómetro de masas de trampa de iones con una ionización por electrospray (ESI) o una fuentes de ionización química (APCI) de presión atmosférica.
2. Preparar los disolventes adecuados para los gradientes HPLC. Para el análisis del metabolito primario, utilizar formiato de amonio 20 mM como A solvente; acetonitrilo 95%, 5% de agua además de formiato de amonio de 10 mM como solvente B. Para el análisis de metabolitos secundarios, utilice agua más 0.05% ácido fórmico (A) y acetonitrilo más 0.05% ácido fórmico (B). Para el análisis de lípidos polares, usar agua más 0.05% ácido fórmico (A) y 100% acetonitrilo (B).
   Nota: Los solventes y aditivos deben ser grado de LC-MS.
3. Utilizar los gradientes registrados en la tabla 1 para la elución del metabolito. Conjunto el flujo en 0,2 mL/min inyectan 10 μl de cada muestra para metabolitos secundarios y lípidos polares, mientras que inyectar 5 μl de metabolitos primarios.
4. Preparar una muestra de control de calidad (QC) mezclando porciones iguales de diferentes muestras para tener una mezcla representativa de cada condición experimental. Analizar la muestra de control de calidad durante el experimento para controlar la eficiencia del instrumento. En concreto, introduzca un análisis de la muestra de control de calidad después de cada lote de muestra 10.
5. Aleatorizar las muestras para evitar efectos basados en el instrumento.
6. Después de 9 análisis, inserte una columna limpieza método y un análisis en blanco inmediatamente después.
   Nota: Realizar un gradiente lento entre los dos disolventes con una elución isocrática en alto porcentaje de los solventes más fuertes. El espacio en blanco consiste en una inyección de un puro metanol: agua (50/50, v/v) para mejorar la reproducibilidad del tiempo de retención en el siguiente análisis.
7. Configurar el instrumento para la adquisición de espectros de masas en modos alternativos de ionización positivo y negativo utilizando los parámetros enumerados en la tabla 2.
   Nota: Otros parámetros dependen de la plataforma específica.
8. Realizar el proceso siguiente de datos como se explicó en Dal Santo et al.⁹.

Resultados

En este trabajo se presenta el flujo de trabajo para el desarrollo de una vacuna oral en los tejidos vegetales comestibles. El enfoque de este trabajo es la expresión de una proteína de la blanco en una especie vegetal comestible y la caracterización de la potencial vacuna oral.

El primer paso implicó la evaluación de la idoneidad de la tecnología de expresión basada en el virus de la planta para producir proteínas recom...

Discusión

En este estudio mostramos análisis preliminar para el diseño de una vacuna oral de candidato para la diabetes autoinmune. La proteína diana para este experimento era una forma mutada de la humana 65 kDa glutamato descarboxilasa, que producción y funcionalidad son fácilmente detectables y medibles¹². Su expresión en los tejidos de plantas comestibles fue mediada por los vectores⁵, que mediar un alto nivel de producción de proteínas recombinantes en un marco de tiempo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	-	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	-	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	-	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	-	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	-	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	-	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	-	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	-	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	-
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade