JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол производить кандидат оральная вакцина против диабета типа 1 в съедобных растений.

Аннотация

Завод молекулярных земледелие является использование растений для производства молекулы интерес. В этой перспективе растения могут использоваться как биореакторов для последующей очистки конечного продукта и производства и прямых перорального гетерологичных белков при использовании видов съедобных растений. В этой работе мы представляем развития кандидата оральная вакцина против диабета 1 типа (T1D) в системах съедобных растений с использованием деконструкции растений на основе вирус рекомбинатной технологии дна, поставляется с вакуумной инфильтрации. Наши результаты показывают, что красная свекла является подходящей принимающей для переходных выражение человека производные аутоантиген, связанные с T1D, считается перспективным кандидатом как T1D вакцина. Листья, производства аутоантиген были тщательно характерны для их сопротивление желудочного пищеварения, наличие остаточного заряда бактерий и их вторичного метаболизма профиля, давая обзор процесса производства для потенциального использования растений для прямого перорального гетерологичных белка. Наш анализ показал почти полной деградации лиофилизированной кандидат пероральной вакциной после имитации желудочного пищеварения, предполагая, что стратегию инкапсуляции в производстве вакцины растительного ГАД не требуется.

Введение

После революции молекулярной биологии растений в 1980-х систем на базе завода для производства биофармацевтических препаратов может рассматриваться как альтернатива традиционным системам на основе клеток микробов и млекопитающих1. Растения отображать несколько преимуществ перед традиционными платформами, с масштабируемости, эффективности и безопасности, будучи наиболее релевантные2. Рекомбинантных продукта может быть очищенной от преобразованного растительной ткани и затем управлением, либо парентерально или устно и, Кроме того, преобразованные съедобных растений может использоваться непосредственно для перорального. Пероральном одновременно содействует слизистых оболочек и системного иммунитета, и это устраняет необходимость иглы и специализированного медицинского персонала. Кроме того перорального устраняет сложной обработке, который обычно приходится 80% от стоимости всего производство рекомбинантных белков3. Все эти преимущества могут быть переведены в экономии средств производства, поставок и труда, снижения расходов по каждой дозы, что делает препарат доступным для большинства мирового населения.

Несколько стратегий, как стабильная трансформации и переходных выражение, были разработаны для производства рекомбинантных белков в растениях. Среди них высокодоходные деконструкции завод на базе вирус выражение системы (например, magnICON) обеспечивает превосходную производительность ведущих высокие урожаи рекомбинантных белков в относительно короткие сроки4. Многие примеры переходных выражения с использованием системы на основе вирус выражение завод в растения Nicotiana benthamiana сообщается, будучи принимающей золотой стандарт производства. Однако эта модель завод не рассматривается как съедобных видов алкалоидов и других токсичных метаболитов, которые накапливаются в его листьях.

В этой работе, мы описываем сравнение между двумя системами съедобных растений, красная свекла (бета vulgaris cv Мулен Руж) и шпинат (Spinacea oleracea cv Industria), для выражения два кандидата форм 65 кДа изоформы глутаминовой кислоты Декарбоксилаза (GAD65), проведенного на заводе на базе вирус векторы5. GAD65 основных аутоантиген, связанные с диабетом 1 типа (T1D) и это в настоящее время под следствием в человека клинические испытания, чтобы предотвратить или отсрочить T1D, вызывая терпимости6. Производство GAD65 в растения широко учился в модель видов растений Nicotiana tabacum и н. benthamiana4,5,6,7. Здесь мы описывают использование видов съедобных растений для производства молекулы в тканях, которые могут быть предназначены для прямой доставки устные. С технической точки зрения, мы изучали и выбрали системы для agroinfiltration растений и съедобных растений платформы GAD65 производства путем оценки различных параметров: рекомбинантных белков уровнях, остаточная микробной заряд на заводе ткани, предназначенные для перорального, сопротивление GAD65 желудочного пищеварения и биоэквивалентности трансформированных растений с дикого типа.

протокол

1. красный выращивания свеклы и шпинатом

  1. Расти красной свеклы (B. vulgaris cv Мулен Руж) и шпината (S. oleracea cv Industria) растений в камере роста, используя 150 µE интенсивности света, относительная влажность 65%, 12 h свет/темно цикла в 23/21 ° C, соответственно.
  2. После прорастания семян Удобряйте растения дважды в неделю раствором 1 г/Л коммерчески доступные удобрения (Таблица материалов). Для agroinfiltration использования пяти недельных шпинат и 6 week-old свекла установок.

2. Переходное выражение через деконструкции завод вирус-технологии

  1. Строительство завода векторов выражения
    1. Представления векторов - 5' модуль (pICH20111), 3' модули (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut и pICH7410.eGFP), подготовленный как описано в1,2,7и интеграза модуля (pICH14011)- в Agrobacterium tumefaciens GV3101 штамма с использованием стандартных методов. Растут на LB среде, содержащей 50 мкг/мл рифампицин и соответствующий вектор конкретные антибиотики (50 мкг/мл carbenicillin для pICH20111, pICH14011 и pICH7410.eGFP), 50 мкг/мл канамицин для pICH31070 за 2 дня на 28 ° C.
    2. Экран колоний колонии PCR, используя следующие конкретные Праймеры для каждого вектора: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3 "и 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' модули pICH31070.GAD65mut и pICH31070.∆87G65mut, с отжига Температура 55 ° C и удлинение время 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' и 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' для третьего 3' модуль pICH7410.eGFP, отжига Температура 53 ° C и удлинение время 30 сек, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' и 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' для 5' модуля, с отжига Температура 53 ° C и удлинения времени 20 s и 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3 "и 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' для модуля интеграза отжига температура 57 ° C и удлинение время 45 s.
    3. Осуществлять реакции PCR в общем объеме 20 мкл, используя следующие конкретные реакции цикла: первоначальный денатурации 5 мин при температуре 95 ° C, 35 циклов 30 сек при 95 ° C, 30 s при отжиге температуре и удлинение шаг в 72 ° C (отжига температура и удлинение времени ре, специфические для каждой пары праймера) и удлинение окончательный шаг 7 мин при 72 ° C.
  2. Шприц agroinfiltration
    1. Прививать три A. tumefaciens трансформантов в 50 мл LB средних содержащие 50 мкг/мл рифампицин и следующие соответствующие антибиотики вектор конкретных: 50 мкг/мл carbenicillin для A. tumefaciens преобразована с pICH20111, pICH14011 или pICH7410.eGFP или 50 мкг/мл канамицин для A. tumefaciens преобразована с pICH31070. Расти путем встряхивания в ночь на 28 ° C.
    2. Пелле ночи бактериальных культур центрифугированием на 4500 x g 20 мин и Ресуспензируйте их в 100 мл (или два тома первоначальных бактериальной культуры) инфильтрации буфер, содержащий 10 мм 4-morpholineethanesulfonic кислота (MES; рН 5,5) и 10 мм MgSO4, без учета ОД600. Инкубируйте суспензий при комнатной температуре (RT) за 3 ч.
    3. Смесь равных объемов бактериальных суспензий, содержащий один из трех модулей, GAD65mut, ∆87GAD65mut или eGFP 3' модуль, с 5' модуль и модуль интегразы. Израсходовать подвеска для проникновения шприц красных листьев свеклы и шпинат.
    4. Место 5 мл суспензии в шприц без иглы. Прижмите кончик шприца против нижней части листьев шпината и красная свекла установок и тем временем применять нежные противодавления на другую сторону листа.
    5. Проникнуть в первые три полностью расширенной листья, начиная от вершины для каждого растения. Метка agroinfiltrated листья с тегом бумаги на стебле листья. Возвращение растения в камере роста при стандартных условиях.
      Примечание: По соображениям охраны здоровья и безопасности, носите защитные очки и перчатки во время процесса инфильтрации.
    6. Сбор agroinfiltrated листья от 4 до 14 дней после заражения (dpi) и заморозить их в жидком азоте. Магазин тканей растений-80 ° c.
  3. Вакуумный agroinfiltration
    1. Растут отдельно три A. tumefaciens трансформантов в 50 мл LB среде, содержащей 50 мкг/мл рифампицин и соответствующий вектор конкретного антибиотика путем встряхивания в ночь на 28 ° C.
    2. Пелле ночи бактериальных культур центрифугированием на 4500 x g 20 мин Ресуспензируйте гранулы в 1 Л инфильтрации буфера ОД600 0,35 и инкубировать суспензий в РТ за 3 ч.
    3. Добавьте 0,01% v/v моющего средства (Полисорбат 20) для каждого подвеска. Смесь равных объемов бактериальных суспензий, содержащий один из трех модулей, GAD65mut, ∆87GAD65mut или eGFP 3' модуль, с 5' модуль и модуль интегразы.
    4. Вставьте один завод (6 week-old свекла растений, см. раздел 1) в держатель. Инвертируйте держателем и наложить на стакан, содержащие инфильтрации баня (2 Л), чтобы погрузить листья в инфильтрации подвеска.
      Примечание: Убедитесь, что все листья полностью погружают в бактериальных подвеска. Поднимите уровень с добавлением дополнительных инфильтрации подвеска, если требуется.
    5. Передача инфильтрации Ванна с погруженной завод в палату инфильтрации и закройте его. Включите вакуумный насос и открыть клапан вакуумного всасывания на проникновение камеры.
    6. После того, как давление в камере инфильтрации сократилось до 90 мбар, держите пылесос на 3 мин релиз вакуума для 45 s. После проникновения палата вернулся в атмосферном давлении, открыть камеру и удалить проникли растение от бактериальных бани.
    7. Возвращение растения в камере роста при стандартных условиях.
    8. Собирают листья agroinfiltrated на максимальное выражение ДОИ, в зависимости от рекомбинантных белков и заморозить их в жидком азоте. Магазин тканей растений-80 ° c.

3. Рекомбинантный белок анализ выражения

  1. Общая растворимого белка (TSP) добыча
    1. Растереть шприц или вакуум проникли красной свеклы и шпинат листья, собранные в шаги 2.2.6 и 2.3.8, для мелкого порошка в жидком азоте, используя ступку и пестик. Передача порошка в 15 мл пластиковых трубок и хранить материал в-80 ° C.
    2. Мкл 900 извлечения буфера (50 мм натрия фосфат рН 8,0, метабисульфит натрия 20 мм) до 300 мг порошка листьев.
      Примечание: Выбранный соотношение вес ткани растений (мг) объем буфера (мкл) составляет 1:3.
    3. Гомогенизации смеси, vortexing за 1 мин, а затем центрифуги на 30000 x g 40 мин при 4 ° C.
    4. Собирать супернатант в чистой трубку и храните его при температуре-80 ° C.
  2. Завод eGFP визуализации и количественная оценка
    1. Загрузите 100 мкл каждого Ч.Л. экстракта полученные от eGFP, выражая листья, в трех технических реплицирует, на 96-луночных тарелку.
    2. Положите пластину 96-луночных флуоресценции читателя и начать измерение. Используйте фильтр 485/535 Нм, набор необходимых для eGFP флуоресценции обнаружения.
    3. Для абсолютного количественной оценки, в том же пластины подготовить калибровочной кривой загрузки различных количествах (62,5, 125, 500, 750 и 1000 нг) из очищенного eGFP.
  3. Bicinchoninic кислота (BCA) assay для квантификации TSP
    1. Смешайте 50 частей реагента A (Таблица материалов) с 1 частью реагент Б (Таблица материалов). Подготовьте достаточный объем свежего BCA рабочего раствора для образцов быть assayed и калибровки стандартов.
      Примечание: Объем BCA рабочего раствора, необходимых для каждой выборки составляет 1,9 мл. Для стандартной процедурой с 9 стандартов (в том числе пустым) 17.1 мл BCA рабочего раствора не требуется.
    2. Пипетка 0,1 мл каждого стандарта (в том числе пустым), и TSP экстрактов в маркированных трубку.
      Примечание: Как стандарты калибровки, подготовить свежий набор бычьим сывороточным альбумином (БСА) стандарты в диапазоне 10-1000 мкг/мл, предпочтительно с использованием тех же разбавителя как образцы, такие как вода. Пустые состоит из 0,1 мл растворителя используется для калибровки стандартных и пробоподготовки.
    3. Добавить 1.9 мл BCA рабочего раствора и тщательно перемешать. Обложка трубы и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.
    4. Прохладный трубы для RT. измерения поглощения в 562 Нм всех образцов в течение 10 мин.
      Примечание: Даже на RT, продолжается разработка цвет. Существенные ошибки не будут вводиться если измерения поглощения всех труб производится в течение 10 мин.
    5. Вычтите значение поглощения 562 Нм заготовки из чтений стандартов и экстракты Ч.Л.
    6. Участок заготовки исправлены 562 Нм чтения для каждого стандарта на его концентрации. Определите концентрацию белка каждого Ч.Л. экстракта.
  4. Выполняйте Кумасси гель окрашивание как описано в Gecchele et al.8.
  5. Западный анализ помаркой
    1. Выполните анализ Западная помарка, как описано в Gecchele et al.8.
    2. После электрофоретического разделения белков перенести их на нитроцеллюлозную мембрану с использованием стандартных методов. Подготовьте блокировки решение путем смешивания 4% молока в фосфат амортизированное saline (PBS) рН 7,4. Блокировать мембраны с 10 мл блокировки раствора в РТ за 1 час.
    3. Подготовка основного антитела кролика мэм анти GAD65/67 и анти LHCB2 и топографической для анти eGFP в 5 мл раствора блокировки с 0.1% моющего средства. Проинкубируйте мембрану с подготовленной основное антитело решения на ночь при 4 ° C или 4 h на RT с постоянным перемешиванием.
    4. Отказаться от основного антитела и промойте мембрану 3 раза за 5 мин блокировки раствор, содержащий 0.1% моющего средства.
    5. Подготовьте пероксидазы (ПХ)-конъюгата антитела анти кролик на мэм блокировать решение с 0.1% моющего средства. Проинкубируйте мембрану за 1,5 часа на RT с постоянным перемешиванием.
    6. Отменить вторичные антитела и промойте мембрану 5 раз за 5 мин с PBS-T (PBS с 0,1% моющего средства).
    7. Проинкубируйте мембрану с коммерчески доступных luminol решения следуя инструкциям производителя. Обнаружение сигнала, используя систему визуализации хемилюминесценции.

4. завод обработки материалов

  1. Урожай вакуумной agroinfiltrated ∆87GAD65mut-выражая свекла оставляет на выражение пик (11 dpi) и заморозить их в жидком азоте.
  2. Lyophilize замороженные листья за 72 ч-50 ° C и 0,04 мбар. Хранить их при температуре-80 ° C.
  3. Измельчить листья для мелкого порошка и хранить его на RT в запечатанном контейнере с силикагель исключить влаги.

5. желудочного пищеварения моделирования и ячейки анализ целостности

  1. Моделирование желудочного пищеварения
    1. Вешу 100 мг листьев шлифованный лиофилизированной красной свеклы и Ресуспензируйте в 6 мл PBS (рН 7,4).
    2. Настройка образца pH 2 с 6 М HCl.
    3. Добавьте 4 мг/мл пепсин из свиных слизистой оболочки желудка в 10 мм HCl для получения окончательного пепсин концентрации 1 мг/мл или в соотношении 1:20 до всего растворимые белки. Встряхните образца при 37 ° C для 120 мин.
    4. Настройка образцов до pH 8 с 1 M NaOH в Инактивирует пепсин.
    5. Центрифуга 750 мкл аликвоты каждого образца на 20000 x g 20 мин при 4 ° C. Собирают отдельно супернатант и Ресуспензируйте гранулы в одном супернатанта объем загрузки буфера (1,5 М трис HCl, pH 6.8, SDS 3%, 15% глицерина и 2-меркаптоэтанол 4%).
      Примечание: Из соображений безопасности и здоровья надевайте перчатки и работать под зонт для пробоподготовки.
    6. Вестерн-блот анализ8анализировать супернатант и ресуспензированы гранул.
  2. Анализ целостности ячейки
    1. Подготовка двух образцов 100 мг листьев шлифованный лиофилизированной красной свеклы и Ресуспензируйте оба в 6 мл PBS (рН 7,4).
    2. Отрегулируйте pH только один образец 2 с 6 М HCl. Shake обоих образцов при 37 ° C для 120 мин.
    3. Центрифуга 750 мкл аликвоты каждого образца на 20000 x g 20 мин при 4 ° C. Собирают отдельно супернатант и Ресуспензируйте гранулы в одном супернатанта объем загрузки буфера.
    4. Анализировать супернатант и ресуспензированы гранул, Западный анализ помаркой.

6. микрофлоры пробирного

  1. Вешу 100 мг лиофилизированных красной свеклы листьев. Ресуспензируйте порошок в 8 мл стерильного PBS (рН 7,4) и вихревые за 1 мин.
  2. Подготовка среднего фунтов без антибиотиков или содержащие рифампицин (i) 50 мкг/мл, (ii) 50 мкг/мл каждый, рифампицин и carbenicillin, (iii) 50 мкг/мл каждый рифампицин и канамицин или (iv) 50 мкг/мл каждый рифампицин, carbenicillin и канамицин.
  3. Плита 1 мл каждого лиофилизированной листьев огневки в одном из 5 избирательного LB средств массовой информации.
  4. Инкубируйте все пластины для 3 дней на 28 ° C.
  5. Граф Agrobacterium колоний, выращенных на каждой пластине.
  6. Рассчитать и определить остаточного заряда бактериальных как число единиц образуя колонии (CFU) мл лиофилизированной лист огневки (кое/мл).

7. метаболит добыча

  1. Основной метаболит добыча
    1. Весят 30 мг-80 ° c хранится, вакуумные, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-выражая Свекла порошок листьев в пластиковую трубку 2 мл.
    2. Мкл 750 холодный 70/30 (v/v) метанол/хлороформе и вихревые для 30 s. инкубировать в-20 ° C в течение 2 ч.
      Примечание: Все растворители и добавки должны быть класса LC-MS.
    3. Мкл 600 холодной водой и центрифуги на 17 900 x g при 4 ° C на 10 мин сбор и передача этапа верхней водноспиртовой в новом 2-мл пробирку. Отказаться от этапа нижнего chloroformic и интерфазе.
    4. Поместите образцы в вакуумной концентратор для 3 h для испарения растворителей.
    5. Растворяют гранулы, полученные из шаг 7.1.4 в 300 мкл представленности (v/v) Ацетонитрил/воды и sonicate образцы для 3 мин.
    6. Передайте решения через мембранные фильтры 0,2 мкм и положить их в прозрачной фиксированной 300 мкл Вставка стеклянных трубок.
  2. Вторичные метаболиты добыча
    1. Весят 300 мг-80 ° c хранится, вакуумные, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-выражая Свекла порошок листьев в пластиковой трубке 15 мл.
    2. Добавить 3 мл метанола, вихрь 30 сек и sonicate на 40 кГц на 15 мин.
      Примечание: Все растворители и добавки должны быть класса LC-MS.
    3. Центрифугуйте образцы на 4500 x g при 4 ° C на 10 мин и передачи supernatants в новые трубы 15 мл.
    4. Разбавляют 100 мкл экстракта 1:3 (v/v) с водой и передать решение через мембранный фильтр 0.2 мкм.
    5. Положите раствор в прозрачной фиксированной 300 мкл вставить стеклянную трубку.
  3. Экстракция полярных липидов
    1. Весят 200 мг-80 ° c хранится, вакуумные, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-выражая Свекла порошок листьев в пластиковой трубке 15 мл.
    2. Добавить 200 мкл воды, а затем 2 мл метанола и затем сохранить на льду за 1 час.
      Примечание: Все растворители и добавки должны быть класса LC-MS.
    3. Вихрь 30 s и sonicate на 40 кГц на 15 мин.
    4. Центрифугуйте образцы на 4500 x g при 4 ° C на 25 мин сбор и передача этапа хлороформ в 2 мл пробирок. Отказаться от верхней водноспиртовой фазы и интерфазе.
    5. Поместите образцы в вакуумной концентратор для 3 h для испарения растворителя.
    6. Растворяют гранулы, полученные из шага 7.3.5 с 600 мкл метанола.
    7. Разбавляют 100 мкл экстракта 1:5 (v/v) с метанолом и передать решение через мембранный фильтр 0,2 мкм.
    8. Положите раствор в прозрачной фиксированной 300 мкл вставить стеклянную трубку.

8. жидкостной хроматографии масс-спектрометрии анализ и обработка данных

  1. Настройка системы LC-MS, как рекомендованный поставщик.
    Примечание: LC Секция состоит из Автоматический пробоотборник, в сочетании с ВЭЖХ, оборудованы со столбцом C18 гвардии (75 x 2,1 мм, частиц размером 5 мкм) перед C18 столбец (150 x 2,1 мм, частиц размером 3 мкм) для анализа вторичных метаболитов и полярных липидов , тогда как со столбцом HILIC гвардии (7,5 x 2,1 мм, 3 мкм) перед столбцом HILIC (150 x 2,1 мм, размер 2.7 частиц мкм). MS-ионная ловушка масс-спектрометр с электроспрей ионизации (ESI) или химические ионизации (ИУППА) источников атмосферного давления.
  2. Подготовьте соответствующие растворители для ВЭЖХ градиентов. Для анализа основной метаболит используйте 20 мм аммония формате как растворителя; Ацетонитрил 95%, 5% воды плюс 10 мм аммония формате как растворитель б. Для анализа вторичных метаболитов используйте воду плюс 0,05% муравьиной кислоты (A) и ацетонитриле плюс 0,05% муравьиной кислоты (B). Для анализа полярных липидов используйте воду плюс 0,05% муравьиной кислоты (A) и 100% Ацетонитрил (B).
    Примечание: Растворители и добавки должны быть класса LC-MS.
  3. Используйте градиенты, сообщается в таблице 1 для элюции метаболит. Набор скорости расхода на 0,2 мл/мин Inject 10 мкл каждого образца для вторичных метаболитов и полярных липидов, тогда как придать 5 мкл для первичных метаболитов.
  4. Подготовьте образец контроля качества (КК), смешивая равными долями различных образцов, чтобы иметь представительный смесь каждого экспериментальные условия. Анализ образца КК в ходе эксперимента для мониторинга эффективности инструмент. В частности вставьте анализа образцов КК после каждого 10 образец пакета.
  5. Случайном порядке образцы избежать инструмент driven эффектов.
  6. После 9 анализов, вставьте столбец очистки метод и пустых анализа сразу же после.
    Примечание: Выполните медленный градиент между двумя растворителей с Изократические элюции в высокий процент сильнейших растворителя. Пустые состоит из инъекция чистого метанола: вода (представленности, v/v) для улучшения удержания время воспроизводимости при следующем анализе.
  7. Настройка инструмента для получения массового спектры в альтернативный положительной и отрицательной ионизации режимах с помощью параметров, перечисленных в таблице 2.
    Примечание: Другие параметры зависят от конкретной платформы.
  8. Выполните следующий обработки данных, как описано в Dal Santo et al.9.

Результаты

В этой работе представлен рабочий процесс для развития устной вакцины в тканях съедобных растений. В центре внимания этой работы является выражением целевого белка в съедобных принимающей видов растений и характеристика потенциальных пероральной вакциной.

Обсуждение

В этом исследовании мы показали предварительный анализ для разработки кандидат оральная вакцина для аутоиммунного диабета. Целевого белка для этого эксперимента был мутировал форме человека 65 кДа Глутаматдекарбоксилаза, которых производство и функциональность являются легко обнар?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана совместного проекта «Использование растений для производства съедобных вакцины аутоиммунный диабет (eDIVA)» (проект ID: 891854) финансируется Веронский университет – в рамках вызова 2014.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filtersSartorius-Stedim17764
2–mercaptoethanolSigmaM3148Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)SigmaM8250pH 5.5
96-well plateSarstedt833924
Acetic acidSigma27221Corrosive
Acetonitrile LC-MS gradeSigma34967
AcetosyringoneSigmaD134406Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological GradeApplichemA094915 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formateSigma70221
Anti-eGFP antibodyABCamab290
Anti-GAD 65/67 antibodySigmaG5163
Anti-LHCB2 antibodyAgriseraAS01 003
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
C18 ColumnGrace   -Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard ColumnGrace   -Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15Fertilizer
Carbenicillin disodiumDuchefa BiochemieC0109Toxic
Chemiluminescence imaging systemBioRad1708370ChemiDoc Touch Imaging System
ChloroformSigmaC2432
DetergentSigmaP5927Polysorbate 20
Fluorescence readerPerkin-Elmer 1420-011VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS gradeSigma94318
GlycerolSigmaG551615 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerasePromegaM7841
HClSigmaH1758Corrosive
HILIC ColumnGrace   -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard ColumnGrace   -Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibodySigmaA6154Do not freeze/thaw too many times
HPLC AutosamplerBeckman Coulter   -System Gold 508 Autosampler
HPLC SystemBeckman Coulter   -System Gold 128 Solvent Module HPLC
IsopropanolSigma24137Flamable
Kanamycin sulfateSigmaK4000Toxic
KClSigmaP95412 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4SigmaP97912.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solutionGe HealthcareRPN2232Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator5PascalLIO5P0000DGT
Mass SpectometerBruker Daltonics  -Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
MethanolSigma32213
MgSO4SigmaM7506
Milk-blocking solutionRistora   -3 % in PBS
Na2HPO4SigmaS7907Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaClSigmaS301480 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4SigmaS8282 Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOHSigmaS8045
Nitrocellulase membraneGe Healthcare10600002
Pepsin from porcine gastric mucosaSigmaP7000
Peroxidase substrate ECLGE HealthcareRPN2235Light sensitive material
Pump Vacuum PressVWR111400000098
Reagent ASigmaB9643Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent BSigmaB9643Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
RifampicinDuchefa BiochemieR0146Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)SigmaL3771Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphiteSigma7681-57-4
Sonicator systemSoltec090.003.0003Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
SyringeTerumo   -
Transparent fixed 300-µL insert glass tubesThermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
TryptoneFormediumTRP0310 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentratorHeto3878 F1-3Speed-vac System
Water LC-MS gradeSigma39253
Yeast extractSigmaY13335 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

Ссылки

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?. Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. . Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015)
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145T1DagroinfiltrationGAD65

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены