1 型糖尿病のバイオ医薬品候補ワクチンの赤カブの一過性発現

要約

ここでは、食用植物の 1 型糖尿病に対する経口ワクチン候補を生成するためのプロトコルを提案する.

要約

分子農業の興味の分子を生成するために植物の使用であります。このような観点で植物が両方使用するバイオリアクターとして生産と最終製品のそれに続く浄化のため、異種蛋白質の直接の口頭配達の食用植物の種を使用する場合。この作品は、食用植物を用いて解体工場ウイルスによる組換え DNA 技術、真空浸潤と配信のタイプ 1 の糖尿病 (T1D) に対する候補の経口ワクチンの開発を紹介します。我々 の結果は、赤いビーツが T1D ワクチンとして有望な候補であると T1D に関連付けられている人間の派生疱瘡一過性発現に適したホストであることを示します。胃消化に対する抵抗力、細菌の残留電荷の存在および潜在的な使用のためのプロセス生産の概要を与える彼らの二次代謝プロファイル、自己抗原の生産葉が特徴付けられた徹底的に植物による異種タンパク質の直接の口頭配達のため。我々 の分析を示した次のシミュレートされた胃の消化は、GAD の植物由来ワクチンの製造にカプセル化戦略が必要なことを示唆している凍結候補の経口ワクチンのほぼ完全劣化。

概要

1980 年代に植物分子生物学の革命以来バイオ医薬品の生産のための植物ベースのシステムは、微生物や哺乳動物細胞¹に基づく従来のシステムに代わるものとして考えることが。植物は、スケーラビリティ、費用対効果と安全が最も関連性の高い²伝統的なプラットフォーム上のいくつかの利点を表示します。遺伝子組換え製品の形質転換体組織から精製や、経口的、どちらか口頭配達の直接変換の食用植物を使用ことができます経口投与し、また、することができます。経口ルートは同時に粘膜と全身の免疫を促進し、針や専門の医療関係者のための必要があります。さらに、口頭配達は通常組換え蛋白質³の総製造費用の 80% を占めている複雑なダウン ストリーム処理を排除します。すべてのこれらの利点は、生産、供給および労働の各投与量、世界の人口のほとんどが薬を手頃な価格のコスト削減で節約に翻訳できます。

安定した変換と過渡式の両方のいくつかの戦略は、植物における遺伝子組換え蛋白質の生産のために開発されました。その中で、高収率解体工場式のウイルス ベース システム (例えば、magnICON) は比較的短いタイム スケール⁴で組換えタンパク質の高収率をリードする優れた性能を提供します。ベンサミアーナ タバコ植物の植物ウイルス ベースの式を用いた一過性発現の多くの例が報告されているゴールド スタンダード本番ホストをされています。ただし、このモデルの植物はアルカロイドとその葉の蓄積は、他の毒性代謝産物により食用種とみなされない。

この作品は、赤ビート 2 つの食用植物システムの比較について述べる (ベータ版尋常 cvムーラン ルージュ) とほうれん草 (及ぼす oleracea cvインドゥストリア)、グルタミン酸の 65 kDa のアイソ フォームの 2 つの候補形式の表現のため脱炭酸酵素 (GAD65) 植物ウイルス ベースで実施の^{5 を}ベクトルします。GAD65 はタイプ 1 の糖尿病 (T1D) に関連付けられている主要な自己抗原と、それは現在または許容値⁶を誘導することによって T1D を遅延するを防ぐため人間臨床試験で調査中。植物における GAD65 の生産は、タバコと(名) ベンサミアーナ^4,5,6,7としてモデル植物で広く研究されています。ここでは、直接口頭配達のために意味することができます組織の分子の生産のための食用植物の種の使用について述べる。ビューの技術的な観点から検討し、異なるパラメーターを評価することによって植物の agroinfiltration のシステムと GAD65 の生産のための食用植物プラットフォームを選択: 組換え蛋白質の表現のレベル、残留微生物工場にて組織の口頭配達、胃の消化に GAD65 の抵抗と野生型に変換された植物の同等のためのもの。

プロトコル

1. 赤いビーツとホウレンソウの栽培

1. 赤カブを育てる (B の尋常性 cvムーラン ルージュ) とほうれん草 (s. キャベツ cvインドゥストリア) 23/21 ° C でそれぞれ照度, 相対湿度 65%, 12 時間の明暗サイクルの 150 Με を使用して成長部屋の植物。
2. 種子発芽後市販肥料 (材料表) の 1 グラム/L の溶液で週二回植物を肥やしなさい。Agroinfiltration 5 週齢ほうれん草と 6 週齢赤ビーツの植物を使用します。

2. 過渡式解体工場ウイルス ベースの技術を

1. 植物発現ベクターの構築
   1. -5' モジュール (pICH20111)、3' モジュール (pICH31070.GAD65mut、pICH31070.∆87G65mut、pICH7410.eGFP)、前述^1,2、7、準備およびインテグラーゼ モジュール (pICH14011) - ベクトルを紹介します。アグロバクテリウムGV3101 ひずみで標準的な技術を使用してください。2 日間の 28 ° C の 50 μ g/mL リファンピシンおよび適切なベクトル特定の抗生物質 (pICH20111、pICH14011 および pICH7410.eGFP の 50 carbenicillin μ g/mL)、pICH31070 の 50 μ g/mL カナマイシンを含む LB 培地で育つ
   2. コロニー各ベクトルについて次の特異的プライマーを用いた PCR による植民地を画面: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' と 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' モジュール pICH31070.GAD65mut と pICH31070.∆87G65mut、55 ° C の熱処理温度と伸長時 110 s、5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' と 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3 3' モジュール pICH7410.eGFP、53 ° C の熱処理温度と 30 の伸長時間の s、5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' と 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3'53 ° C の熱処理温度と 20 s と 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3 の伸長時間 5' モジュール ' と 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' 57 ° C の熱処理温度と 45 の伸長時間インテグラーゼ モジュールの s。
   3. 総量が次の特定の反応サイクルを使用して 20 μ L の PCR 反応を行う: 5 分初期変性 95 ° c、30 の 35 サイクル 95 ° c、30 秒焼鈍温度と 72 ° C で延長のステップで s (アニール温度と伸びの時間、各プライマーのカップルのために特定の日時)、72 ° C で 7 分の最終的な延長のステップ
2. 注射器 agroinfiltration
   1. 50 ml の LB 培地含む 50 μ g/mL のリファンピシンの次の適切なベクトル特定抗菌薬 3 A. 根頭がんしゅ病菌形質転換体を接種する: A. 根頭がんしゅ病菌pICH20111 と変換のための 50 μ g/mL carbenicillinpICH14011 または pICH7410.eGFP、またはA. 根頭がんしゅ病菌pICH31070 と変換のための 50 μ g/mL カナマイシン。一晩 28 ° c. で揺することによって成長します。
   2. 20 分 4,500 × gで遠心分離によって一晩細菌文化をペレットし、10 mM 4-morpholineethanesulfonic 酸 (MES; pH 5.5) を含む浸潤バッファーの 100 mL (または初期の細菌文化の 2 つの容積) でそれらを再懸濁しますと 10 mMMgSO₄OD を考慮せず₆₀₀ 。懸濁液 3 時間 (RT) 室温で孵化させなさい。
   3. 3 つのモジュールでは、GAD65mut、5' モジュールと ∆87GAD65mut または eGFP の 3' モジュール、およびインテグラーゼ モジュールの 1 つを含む細菌懸濁液の平等なボリュームをミックスします。赤ビーツとほうれん草の葉の注射器浸潤用懸濁液ミックスを使用します。
   4. 針なしシリンジ 5 mL の懸濁液を配置します。ほうれん草とビーツの植物の葉の裏側から注射器の先端を押し、一方葉の反対側に優しい counterpressure を適用します。
   5. 各工場の頂点から始まって最初の 3 つの完全展開葉に潜入します。葉茎の紙タグと agroinfiltrated の葉のラベルを付けます。標準的な条件下で成長室で植物を返します。
      注: 保健及び安全性の理由のためには目の保護と手袋を着用浸透過程中にして。
   6. 14 日後に感染症 (dpi) とそれらを液体窒素で凍結する 4 から収集 agroinfiltrated の葉します。-80 ° C でストア植物組織
3. 真空 agroinfiltration
   1. 一晩 28 ° c. で揺することによって抗生物質の 50 μ g/mL リファンピシンおよび適切なベクトルに固有を含む LB 培地 50 mL に別途 3 A. 根頭がんしゅ病菌形質を成長します。
   2. ペレットで 4,500 x gで 20 分間の遠心分離で一晩細菌文化は 0.35 の OD₆₀₀浸潤バッファーの 1 L でペレットを再懸濁し、RT で 3 h の懸濁液を孵化させなさい。
   3. 各サスペンションに 0.01 %v/v の洗剤 (ポリソルベート 20) を追加します。3 つのモジュールでは、GAD65mut、5' モジュールと ∆87GAD65mut または eGFP の 3' モジュール、およびインテグラーゼ モジュールの 1 つを含む細菌懸濁液の平等なボリュームをミックスします。
   4. 1 つのプラントを挿入 (6 週古い赤カブ植える、セクション 1 を参照してください) ホルダーに。ホルダーを反転し、浸透浴浸潤の懸濁液で葉が水没する (2 L) を含むビーカーの上に配置します。
      注: は、すべての葉は、細菌懸濁液につけて完全にことを確認します。必要な場合は、余分な浸透の懸濁液を追加してレベルを上げます。
   5. 沈水植物の浸透浴を浸潤室に転送して閉じます。真空ポンプをオンにし、浸潤チャンバーの真空の吸気バルブを開きます。
   6. 浸潤チャンバー内の圧力が 90 mbar に縮小されると一度維持 3 分リリース真空 45 真空 s。浸潤室は大気圧に返されると、商工会議所を開き、細菌浴から浸透した工場を削除します。
   7. 標準的な条件下で成長室で植物を返します。
   8. 組換え蛋白質によって最大式 dpi で agroinfiltrated の葉を収集し、それらを液体窒素で凍結します。-80 ° C でストア植物組織

3. 組換え蛋白質発現解析

1. 全可溶性タンパク (TSP) 抽出
   1. 注射器を挽くまたは真空浸透赤ビーツとほうれん草葉、乳鉢と乳棒を使用して液体窒素中微細粉末に 2.2.6、2.3.8、ステップで収集しました。15 mL プラスチック チューブに粉を転送および-80 ° C で素材を保存します。
   2. リーフ パウダー 300 mg に抽出バッファー (50 mM リン酸ナトリウム pH 8.0、メタ重亜硫酸ナトリウム 20 mM) の 900 μ L を追加します。
      注: 選択したバッファー量 (μ L) を植物組織重量 (mg) 比は 1:3 です。
   3. 1 分間ボルテックスによって混合物を均質化し、4 ° C で 40 分間 30,000 × gで遠心分離
   4. クリーン チューブに上清を収集し、-80 ° C で保存
2. 工場 eGFP の可視化と定量化
   1. 96 ウェル プレートに葉では、3 つの技術的なレプリケートを表現する eGFP から得られた各 TSP 抽出物の 100 μ L をロードします。
   2. 96 ウェルのプレートを入れて蛍光リーダーと測定を開始します。485/535 nm のフィルターが eGFP 蛍光検出に必要なセットを使用します。
   3. 絶対的な定量化のため同じプレートに準備校正曲線荷重別数量 (62.5、125、500、750、1,000 ng) 精製 eGFP の。
3. ビシンコニン酸 (BCA) 試金小さじ定量化のため
   1. 試薬 B (材料表) の 1 部分に 50 部試薬 A (材料表) をミックスします。試金するためのサンプルと校正標準器の新鮮な BCA 実用的なソリューションの十分な量を準備します。
      注: BCA 作業ソリューションの各サンプルの必要量は 1.9 mL です。9 基準 (空白を含む) の標準的な手順、17.1 mL BCA 実用的なソリューションが必要です。
   2. 各標準 (空白を含む) とラベル付きチューブに小さじエキス 0.1 mL のピペットします。
      注: 校正標準器としては、ウシ血清アルブミンの新鮮なセットを準備できれば水などのサンプルとして同じ希釈を使用して 10 1,000 μ g/mL の範囲で (BSA) 標準。空白は、校正標準と試料調製用希釈液の 0.1 mL で構成されています。
   3. BCA 実用的なソリューションの 1.9 mL を加え、徹底的に混ぜます。チューブをカバーし、30 分の 37 ° C で孵化させなさい。
   4. RT。 562 で吸光度を測定する管を冷却 10 分以内のすべてのサンプルの nm。
      注: も常温色開発が続行されます。10 分以内ですべてのチューブの吸光度測定が行われた場合、重大なエラーは発生しません。
   5. 基準と小さじ抽出物の測定値から空白の 562 nm の吸光度の値を減算します。
   6. プロット空白修正 562 nm 濃度ごとの標準のための読書。各 TSP 抽出液のタンパク質濃度を決定します。
4. Gecchele ら⁸で説明したとおり染色 Coomassie ゲルを実行します。
5. 西部のしみの分析
   1. Gecchele ら⁸に示したように西部のしみの分析を実行します。
   2. 蛋白質の電気泳動の分離後標準的な手法を用いた硝酸セルロースの膜の上にそれらを転送します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4 で 4% の牛乳を混ぜてブロック ソリューションを準備します。1 h の RT でブロッキング溶液 10 mL と膜をブロックします。
   3. ウサギ第一抗体抗 GAD65/67 および反 LHCB2、1: 10,000、0.1% 洗剤でブロッキング溶液 5 mL にアンチ eGFP の 1:20,000 を準備します。一晩で 4 ° C または一定の攪拌で常温 4 時間準備された一次抗体ソリューションと膜を孵化させなさい。
   4. 一次抗体を破棄し、ブロッキング溶液 0.1% 洗剤で 3 回各 5 分の膜を洗浄します。
   5. 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の準備-0.1% 洗剤ソリューションをブロックの 1: 10,000 共役抗家兎抗体。一定の攪拌と RT で 1.5 h の膜を孵化させなさい。
   6. 二次抗体を破棄し、5 回 PBS-T (0.1% 洗剤を添加した PBS) で各 5 分の膜を洗浄します。
   7. 製造元の指示に従って市販ルミノール溶液を膜を孵化させなさい。化学発光イメージング システムを用いた信号を検出します。

4. 工場加工

1. 真空 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 表現赤カブの収穫式ピーク (11 dpi) に出発し、液体窒素で凍結します。
2. -50 ° C で 0.04 mbar 72 h の冷凍の葉を凍結乾燥します。-80 ° C で保存します。
3. 葉は細かい粉に挽くし、水分を除外するシリカゲルと密封された容器で常温保存します。

5. 胃消化シミュレーションとセル ・ インテグリティ解析

1. 胃消化シミュレーション
   1. 砕いたフリーズドライ赤ビートの葉の 100 mg の重量を量るし、6 mL の PBS (pH 7.4) でそれを再懸濁します。
   2. 6 M 塩酸で 2 サンプルの pH を調整します。
   3. 10 ミリメートル最後ペプシン濃度 1 mg/mL または 1:20 に可溶性蛋白質の比率を取得する HCl のブタの胃粘膜から 4 mg/mL ペプシンを追加します。120 分の 37 ° C でサンプルを振る。
   4. ペプシンを不活化する 1 M NaOH で pH 8 にサンプルを調整します。
   5. 遠心分離機の 20,000 × g 4 ° C で 20 分間の各サンプルの 750 μ 因数別に上清を収集し、読み込みバッファーの 1 つの上清ボリュームでペレットを再懸濁します (1.5 M トリス塩酸で pH 6.8, 3 %sds、15% グリセロールおよび 4 %2-メルカプトエタノール)。
      注: 保健及び安全性の理由から、手袋を着用し、試料のヒューム フードの下で動作します。
   6. 西部のしみの分析⁸によって清と再懸濁のペレットの両方を分析します。
2. セル ・ インテグリティ解析
   1. 砕いたフリーズドライ赤ビートの葉の 100 mg の 2 つのサンプルを準備し、6 mL の PBS (pH 7.4) の両方を再懸濁します。
   2. だけで 1 つの 120 分の 37 ° C で両方のサンプルを 6 M 塩酸シェイク 2 サンプルの pH を調整します。
   3. 遠心分離機の 20,000 × g 4 ° C で 20 分間の各サンプルの 750 μ 因数別に上清を収集し、読み込みバッファーの 1 つの上清ボリュームでペレットを再懸濁します。
   4. 西部のしみの分析によって清と再懸濁のペレットの両方を分析します。

6. バイオバーデン法

1. フリーズドライの赤ビートの葉の 100 mg の重量を量る。8 mL の滅菌 PBS (pH 7.4) と 1 分の渦の中はパウダーを再懸濁します。
2. 抗生物質有無 (i) 50 μ G/ml リファンピシン、または (ii) 50 μ G/ml リファンピシンおよび carbenicillin の各、(iii) 50 μ g/mL 各リファンピシン、カナマイシン、(iv) 50 μ g/mL 各カナマイシン、carbenicillin、リファンピシンを含む LB 培地を準備します。
3. プレート各 5 LB 培のいずれかで凍結乾燥した葉に磨砕液の 1 mL。
4. 28 ° C で 3 日間のすべての版を孵化させなさい
5. 各プレート上に成長したアグロバクテリウムコロニーをカウントします。
6. 計算し、凍結乾燥した葉のホモジネート (CFU/mL) の mL あたりコロニー形成単位 (CFU) 数として残留細菌電荷を定義します。

7. 代謝物抽出

1. 主な代謝物抽出
   1. 格納されている-80 ° C の 30 mg の重量を量る、真空 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 表現 2 mL プラスチック チューブに赤ビートの葉の粉末。
   2. 2 時間-20 ° C で 30 s. 加温の冷たい 70/30 (v/v) メタノール/クロロホルムと渦の 750 μ L を追加します。
      注: すべての溶剤と添加剤は、LC MS グレードをする必要があります。
   3. 新しい 2 mL のチューブに冷たい水と 10 分間収集 17,900 x gで 4 ° C で遠心と転送の 600 μ L 上するフェーズを追加します。下のクロロ相、相間を破棄します。
   4. 溶媒を蒸発させるため 3 h 用真空濃縮器にサンプルを入れてください。
   5. 50/50 (v/v) アセトニ トリル/水のステップ 7.1.4 で 300 μ L から得られたペレットを溶解し、3 分間サンプルを超音波照射します。
   6. ソリューションを 0.2 μ m のメンブラン フィルターを通過し、透明固定 300 μ L 挿入ガラス チューブに入れてください。
2. 二次代謝産物の抽出
   1. -80 ° C 保存の 300 mg の重量を量る、真空 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 表現 15 mL プラスチック チューブに赤ビートの葉の粉末。
   2. 3 mL のメタノール、30 の渦を追加 s、15 分間 40 khz 超音波と。
      注: すべての溶剤と添加剤は、LC MS グレードをする必要があります。
   3. 4,500 × g 10 分のための 4 ° c でサンプルを遠心し、培養上清を新しい 15 mL チューブに移します。
   4. 希釈 100 μ L の水と 1:3 (v/v) を抽出し、解決策を 0.2 μ m のメンブラン フィルターを通過します。
   5. 透明な固定 300 μ L 挿入ガラス管に、ソリューションを配置します。
3. 極性脂質の抽出
   1. -80 ° C 保存の 200 mg の重量を量る、真空 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 表現 15 mL プラスチック チューブに赤ビートの葉の粉末。
   2. 水を 200 μ l 添加し、メタノール 2 mL を追加し、1 h の氷をします。
      注: すべての溶剤と添加剤は、LC MS グレードをする必要があります。
   3. 渦 30 s と 15 分の 40 khz 超音波。
   4. 2 mL チューブにクロロホルム段階を 25 分収集のための 4 ° C で 4,500 x gでサンプルと転送に遠心します。上するフェーズと相間を破棄します。
   5. 溶剤を蒸発させる 3 h 用真空濃縮器にサンプルを入れてください。
   6. メタノールの 600 μ L で 7.3.5 ステップから得られたペレットを溶解します。
   7. 100 μ L 希釈 1:5 (v/v) とメタノールを抽出し、ソリューションを 0.2 μ m のメンブラン フィルターを通過します。
   8. 透明な固定 300 μ L 挿入ガラス管に、ソリューションを配置します。

8. 液体クロマトグラフィー質量分析およびデータ処理

1. 製造元によって推奨されている LC MS システムを設定します。
   注: LC セクションから成ります装備 C18 カラム (75 × 2.1 mm、粒子サイズ 5 μ m) C18 カラム (150 x 2.1 mm、粒子サイズ 3 μ m) の前に二次代謝産物と極性脂質の分析用 HPLC と相まって、オートサンプラー、一方、HILIC カラム (150 x 2.1 mm、粒子サイズ 2.7 μ m) の前に HILIC ガード列 (7.5 x 2.1 mm、3 μ m) を持つ。MS は、エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) または大気圧化学イオン化 (APCI) ソースで提供されるイオン トラップ質量分析計です。
2. 高速液体クロマトグラフィー グラデーションの適切な溶剤を準備します。主代謝物分析用溶剤 A としてギ酸アンモニウム 20 mM を使用します。95% アセトニ トリル、水 5% プラス溶剤 B としてギ酸アンモニウム 10 mM二次代謝産物の解析、水プラス 0.05% ギ酸 (A) とアセトニ トリル 0.05% ギ酸 (B) を使用します。極性脂質の分析、水プラス 0.05% (A) と 100% ギ酸アセトニ トリル (B) を使用します。
   注意: 溶剤と添加剤が LC MS グレードでなければなりません。
3. 代謝物溶出の表 1で報告されたグラデーションを使用します。一方流量 0.2 mL/分二次代謝産物と極性脂質の各サンプルの注入の 10 μ L のセットは、主要代謝物の 5 μ L を挿入します。
4. 品質管理 (QC) のサンプルを準備するには、各実験条件の代表的な混合物を持っているさまざまなサンプルの等しい部分を混合します。計測器の効率を監視するための実験中に QC サンプルを分析します。具体的には、それぞれの 10 のサンプル バッチ後 QC サンプル分析を挿入します。
5. 計測器駆動の影響を避けるためにサンプルをランダムに。
6. 9 解析後クリーニング方法およびブランク分析カラムに挿入直後後。
   注: は、最強の溶媒の割合が高いをイソクラティック溶出と 2 つの溶媒間遅いグラデーションを実行します。純粋なメタノールの注入から成っている空白: 水 (50/50、v/v) 以下における保持時間の再現性を改善します。
7. 表 2に記載されているパラメーターを使用して代替の正と負イオン化モードで質量スペクトルを取得する楽器を設定します。
   注: その他のパラメーターは、特定のプラットフォームに依存します。
8. Dal サントら⁹で説明したように、次のデータ処理を実行します。

結果

この作品は、食用植物組織の経口ワクチンの開発のためのワークフローが表示されます。この作品の焦点は、食用宿主植物のターゲット蛋白質の発現と潜在的な経口ワクチンの評価です。

最初のステップでは、食用植物システムで組換えタンパク質を生産する植物ウイルス ベース式技術の適合性の評価を関与しています?...

ディスカッション

本研究では、自己免疫の糖尿病のための候補者の経口ワクチンの設計のための予備的な分析を示した。この実験のターゲット蛋白質は人間 65 kDa の生産と機能が、容易に検出および測定可能な¹²グルタミン酸脱炭酸酵素の変異する形式だった別の食用の植物の組織での発現ベクトル⁵では非常に短い時間枠で組換えタンパク質生産の高いレベルを仲介媒介だ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	-	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	-	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	-	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	-	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	-	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	-	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	-	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	-	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	-
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade