ארעי ביטוי סלק אדום של חיסון ביולוגיות המועמד לסוכרת מסוג 1

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מועמד חיסון אוראלי נגד סוכרת מסוג 1 במפעל אכיל.

Abstract

הצמח בחקלאות מולקולרי הוא השימוש של צמחים כדי לייצר מולקולות של עניין. בפרספקטיבה הזו, צמחים עשוי לשמש הן ריאקטורים על ההפקה ועל טיהור עוקבות של המוצר הסופי, למסירה אוראלי ישירה של חלבונים heterologous בעת שימוש מיני צמחים אכילים. בעבודה זו, אנו מציגים הפיתוח של חיסון אוראלי המועמד נגד סוכרת סוג 1 (T1D) מערכות צמח אכיל בעזרת טכנולוגיה מבוססת-וירוס דנ א רקומביננטי צמח המפורקים, הנכללת הסתננות ואקום. התוצאות שלנו מראים כי סלק אדום פונדקאי מתאים לביטוי ארעית autoantigen נגזר האנושי קשור T1D, נחשב מועמד מבטיח כמו חיסון T1D. עלים לייצר את autoantigen מאופיינים ביסודיות שלהם עמידות עיכול קיבה, נוכחות של מטען חיידקי שיורית, שלהם פרופיל מטבולי המשני, נותן סקירה כללית של תהליך הייצור לשימוש פוטנציאלי הצמחים עבור משלוח אוראלי ישירה של חלבון heterologous. הניתוח שלנו הראה השפלה כמעט מוחלטת של המועמד הליחה חיסון אוראלי בעקבות עיכול קיבה מדומה, רומז כי אסטרטגיית כימוס בייצור של החיסון גד הצמחי נדרש.

Introduction

מאז המהפכה ביולוגיה מולקולרית צמח בשנות ה-80, מערכות מבוססות-מפעל לייצור ביופרמצבטיקה יכול להיחשב כאלטרנטיבה למערכות מסורתית המבוססת על חיידקים בתרבית של תאים¹. צמחים להציג כמה יתרונות על פני פלטפורמות מסורתי, עם מדרגיות, עלות האפקטיביות והבטיחות להיות הרלוונטיים ביותר². המוצר רקומביננטי ניתן לטהר מרקמות הצמח טרנספורמציה, ואז מנוהל, גם parenterally או בעל פה, יתר על כן, צמח מאכל טרנספורמציה ניתן להשתמש ישירות עבור משלוח אוראלי. תוואי אוראלי בו זמנית מקדם חסינות הרירית ומערכתית, זה מבטל את הצורך של מחטים וצוותים רפואיים מיוחדים. יתר על כן, משלוח אוראלי מבטלת את העיבוד במורד הזרם מורכבים, עובייה בד כ 80% של העלות הייצור הכולל של חלבון רקומביננטי³. כל היתרונות הללו יכול להיות מתורגם חסכון בעלויות ייצור, אספקה, העבודה הפחתת העלויות של כל מנה, לבצע את התרופה במחיר נוח רוב האוכלוסייה הכללית.

מספר אסטרטגיות, הן עבור שינוי יציב, ביטוי ארעי, פותחו לייצור של חומרים בצמחים. ביניהם, מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח המפורקים תשואה גבוהה (למשל, magnICON) מספק ביצועים מעולים מובילים תפוקה גבוהה של חומרים על צירי זמן קצר יחסית⁴. דוגמאות רבות של ביטוי ארעי באמצעות מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח בצמחים benthamiana טבק ידווחו, להיות המארח ייצור תקן הזהב. עם זאת, צמח מודל זה לא נחשב זן אכיל בשל של אלקלואידים אחרים מטבוליטים רעילים שאינן שהצטברו העלים שלו.

בעבודה זו, אנו מתארים את ההשוואה בין שתי מערכות צמח אכיל, סלק אדום (בטא דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (Spinacea הבר קורות חיים תעשייה), עבור הביטוי של שתי צורות המועמד איזופורם 65 kDa חומצה גלוטמית decarboxylase (GAD65), בוצע על ידי המפעל מבוסס-וירוס המומנט⁵. GAD65 autoantigen העיקריים הקשורים לסוכרת סוג 1 (T1D) וזה כרגע תחת חקירה בניסויים קליניים אנושי כדי למנוע או לעכב את T1D על ידי גרימת רגישות⁶. הייצור של GAD65 בצמחים בהרחבה נחקרה במין צמח מודל כמו טבק tabacum ו- benthamiana (ש ע)^4,5,6,7. כאן, אנו מתארים את השימוש מיני צמחים אכילים לייצור המולקולה ברקמות זה הכוונה על משלוח אוראלי ישירה. מנקודת מבט טכנית, אנחנו למד ונבחר את המערכת עבור הצמח agroinfiltration ואת פלטפורמת צמח אכיל לייצור GAD65 על-ידי הערכת פרמטרים שונים: רמות הביטוי חלבון רקומביננטי, החיוב מיקרוביאלי שיורית בצמח רקמות מיועד משלוח אוראלי, ההתנגדות של GAD65 כדי עיכול קיבה ולאחר את אקוויוולנטיות של הצמחים טרנספורמציה עם סוג הפרוע.

Protocol

1. אדום טיפוח סלק ותרד

1. לגדל סלק אדום (דרב דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (ס הבר קורות חיים Industria) צמחים כדורים צמיחה, באמצעות µE 150 של עוצמת האור, 65% לחות יחסית, 12 h/כהה מחזור ב 23/21 ° C, בהתאמה.
2. לאחר נביטת הזרעים, לדשן את הצמחים פעמיים בשבוע עם פתרון 1 g/L של דשן זמין מסחרית (טבלה של חומרים). Agroinfiltration לשימוש תרד בת שבוע חמש וצמחים בת שבוע 6 אדום כסלק.

2. ארעי ביטוי באמצעות הטכנולוגיה צמח המפורקים המבוססת על וירוס

1. בנייה של צמח הביטוי וקטורים
   1. להציג את הווקטורים - 5' מודול (pICH20111) 3' המודולים (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut ו pICH7410.eGFP), מוכנים כמו שתואר לעיל^1,2,7, מודול integrase (pICH14011)- Agrobacterium tumefaciens GV3101 זן באמצעות טכניקות סטנדרטי. גדלים על בינוני LB המכיל 50 μg/mL ריפאמפיצין ואנטיביוטיקה המתאימה וקטור ספציפיים (50 μg/mL carbenicillin pICH20111, pICH14011, pICH7410.eGFP), 50 kanamycin μg/mL עבור pICH31070 2 ימים ב- 28 מעלות צלזיוס.
   2. מסך המושבות על-ידי המושבה PCR באמצעות תחל ספציפית את הבאים עבור כל וקטור: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' ו 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' עבור מודולים pICH31070.GAD65mut 3' והן pICH31070.∆87G65mut, עם טמפרטורת מחזק 55 ° C, מועד התארכות של 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' ו 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' עבור השלישי 3' מודול pICH7410.eGFP, עם טמפרטורה מחזק של 53 ° C וזמן של התארכות של 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' ו 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' עבור 5' מודול, עם טמפרטורה מחזק של 53 ° C של התארכות זמן של 20 s ו- 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' ו 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' עבור מודול integrase עם טמפרטורה מחזק של 57 ° C וזמן של התארכות של 45 s.
   3. לבצע את התגובה PCR ב הנפח הכולל של 20 μL באמצעות מחזור התגובה הספציפיים הבאים: 5 דקות הראשונית דנטורציה ב 95 מעלות צלזיוס, 35 מחזורים של 30 s ב 95 ° C, 30 s הטמפרטורה מחזק, הצעד התארכות ב-72 מעלות (חישול טמפרטורה וזמן התארכות re ספציפיים עבור כל זוג פריימר) צעד התארכות הסופי של 7 דקות-72 מעלות צלזיוס.
2. מזרק agroinfiltration
   1. לחסן את transformants tumefaciens א 3 ב 50 מ ל LB בינוני המכיל 50 μg/mL ריפאמפיצין, האנטיביוטיקה וקטור ספציפיים המתאימים הבאים: carbenicillin 50 μg/mL עבור tumefaciens א טרנספורמציה עם pICH20111, pICH14011 או pICH7410.eGFP, או 50 kanamycin μg/mL עבור tumefaciens א טרנספורמציה עם pICH31070. לגדול ע י ניעור בין לילה ב 28 º C.
   2. גלולה לילה תרביות חיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 4,500 גרם במשך 20 דקות, resuspend אותם 100 מ ל (או שני כרכים של התרבות חיידקי ראשוני) של הסתננות מאגר המכיל חומצה 4-morpholineethanesulfonic 10 מ מ (MES; pH 5.5) ו- 10 מ מ MgSO₄, בלי להתחשב OD_600. דגירה של המתלים בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 שעות.
   3. מערבבים נפחים שווים של המתלים בקטריאלי המכיל אחת של שלושת המודולים, GAD65mut, ∆87GAD65mut או eGFP 3' מודול, עם 5' מודול ומודול integrase. השתמש המיקס ההשעיה מזרק חדירה של אדום עוזב סלק ותרד.
   4. מקום 5 מ של ההשעיה מזרק ללא המחט. לחץ על קצה המזרק מול החלק התחתון של העלה על תרד צמחים סלק אדום, ולהחיל בינתיים counterpressure עדין לצד השני של העלה.
   5. לחדור את העלים מורחבת לגמרי שלושת מתחיל מהקודקוד עבור כל צמח. תווית העלים agroinfiltrated עם תג נייר על הגזע עלה. להחזיר את הצמחים בתוך תא גדילה בתנאים רגילים.
      הערה: מטעמי בטיחות וגהות, ללבוש הגנה העין וכפפות במהלך תהליך הסתננות.
   6. Agroinfiltrated לאסוף עלים מ 4 עד 14 ימים פוסט זיהום (dpi) ומקפיאים בחנקן נוזלי. חנות רקמות הצמח ב-80 מעלות צלזיוס.
3. Agroinfiltration ואקום
   1. גדלים בנפרד transformants tumefaciens א 3 ב 50 מ ל LB בינוני המכיל 50 ריפאמפיצין μg/mL ו המתאימה וקטור ספציפיים לאנטיביוטיקה ע י ניעור בין לילה ב 28 º C.
   2. צניפה תרבויות חיידקי לילה על ידי צנטריפוגה ב 4,500 x גרם במשך 20 דקות Resuspend בגדר ב- 1 ליטר הסתננות המאגר יתר₆₀₀ של 0.35, דגירה של המתלים ב RT במשך 3 שעות.
   3. להוסיף 0.01% v/v של הנוזל (polysorbate 20) כל ההשעיה. מערבבים נפחים שווים של המתלים בקטריאלי המכיל אחת של שלושת המודולים, GAD65mut, ∆87GAD65mut או eGFP 3' מודול, עם 5' מודול ומודול integrase.
   4. להוסיף צמח אחד (בת שבוע 6 סלק אדום צמח, עיין בסעיף 1) בהמחזיק. היפוך המחזיק ומניחים על גבי גביע המכיל האמבט חדירה (L 2) ומטביעים את העלים ההשעיה הסתננות.
      הערה: ודא כי כל העלים לגמרי טבל ההשעיה חיידקי. להעלות את הרמה עם התוספת של הבולם חדירה נוספת במידת הצורך.
   5. העברה לאמבטיה. חדירה עם הצמח המשוקע לתא הסתננות וסגור אותו. להפעיל את משאבת ואקום ופתח את שסתום היניקה ואקום-תא הסתננות.
   6. ברגע הלחץ בבית הבליעה הסתננות הפחיתה את 90 mbar, לשמור על הואקום במשך 3 דקות לשחרור הוואקום עבור 45 s. ברגע תא הסתננות חזר הלחץ האטמוספרי, לפתוח את התא ולהסיר את הצמח הסתנן מהאמבטיה חיידקי.
   7. להחזיר את הצמחים בתוך תא גדילה בתנאים רגילים.
   8. לאסוף עלים agroinfiltrated ב ה-ביטוי מרבי dpi, בהתאם חלבון רקומביננטי, ולהקפיא אותן בחנקן נוזלי. חנות רקמות הצמח ב-80 מעלות צלזיוס.

3. ניתוח ביטוי חלבון רקומביננטי

1. מיצוי חלבונים מסיסים הכולל (כפית)
   1. לטחון את המזרק או ואקום הסתננו אדום עוזב סלק ותרד, שנאספו בשלבים 2.2.6 ו 2.3.8, כדי אבקה של חנקן נוזלי באמצעות עלי ומכתש. להעביר את האבקה לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל ולאחסן את החומר ב-80 מעלות צלזיוס.
   2. להוסיף µL 900 החילוץ מאגר (50 מ מ סודיום פוספט pH 8.0, metabisulphite נתרן 20 מ מ) 300 מ ג של אבקת עלים.
      הערה: היחס הנבחר בין משקל רקמות הצמח (מ ג) מאגר אחסון (µL) הוא 1:3.
   3. Homogenize את התערובת על-ידי vortexing עבור 1 דקות, ואז צנטריפוגה ב x 30,000 g למשך 40 דקות ב 4 º C.
   4. לאסוף את תגובת שיקוע צינור נקי ולאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.
2. צמח eGFP ויזואליזציה, כמת
   1. לטעון µL 100 של כל תמצית כפית המתקבל eGFP לבטא עלים, ב משכפל טכני 3, על צלחת 96-ובכן.
   2. מכניסים את הצלחת 96-ובכן קורא פלורסצנטיות ולהתחיל את המדידה. השתמש במסנן 485/535 nm להגדיר נדרש לגילוי קרינה פלואורסצנטית eGFP.
   3. עבור כימות מוחלטת, באותה הצלחת להכין עקומת כיול כמויות שונות טעינה (62.5, 125, 500, 750 ו- 1,000 ng) של eGFP מטוהרים.
3. Bicinchoninic assay חומצה (BCA) על כימות כפית
   1. מערבבים 50 חלקים של ריאגנט A (טבלה של חומרים) עם חלק 1 של ריאגנט B (טבלה של חומרים). היכונו נפח מספיק של הפתרון עובד BCA טריים את הדוגמאות כדי להיות לבדיקה ואת הסטנדרטים כיול.
      הערה: הנפח של BCA הפתרון עובד הדרושים עבור כל דגימה היא 1.9 מ. עבור הליך רגיל עם סטנדרטים 9 (כולל כרטיס ריק), נדרש 17.1 מ של BCA הפתרון עובד.
   2. פיפטה 0.1 מ"ל של כל סטנדרטיים (כולל כרטיס ריק), וכן תמציות כפית לתוך צינור עם תוויות ברורות.
      הערה: כמו סטנדרטים כיול, להכין קבוצה חדשה של אלבומין שור (BSA) סטנדרטים בטווח μg/mL 10-1, 000, רצוי תוך שימוש באותה diluent כדוגמאות, כמו מים. הריק מורכב מ 0.1 ל diluent המשמש לסטנדרטים כיול של הכנת הדוגמא.
   3. מוסיפים 1.9 מ של הפתרון עובד BCA ומערבבים היטב. מכסה הצינורות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   4. מגניב הצינורות RT. מודדים ספיגת במלון-562 nm של כל הדגימות בתוך 10 דקות.
      הערה: אפילו RT, פיתוח צבע ממשיך. אין שגיאה משמעותיים יוכנסו אם המדידות ספיגת של כל צינורות נעשים בתוך 10 דקות.
   5. להחסיר את ערך ספיגת nm 562 הריק של הקריאות של הסטנדרטים ותמציות כפית.
   6. מגרש 562 מתוקן-ריק nm קריאת כל תקן על הריכוז שלו. לקבוע את ריכוז חלבון כל תמצית כפית.
4. לבצע ג'ל Coomassie מכתים כפי שתואר קודם לכן ב- Gecchele et al.⁸.
5. ניתוח תספיג חלבון
   1. לבצע את הניתוח תספיג כאמור המתוארים Gecchele et al.⁸.
   2. לאחר ההפרדה electrophoretic של חלבונים, להעביר אותם לתוך קרום ניטרוצלולוזה בטכניקות סטנדרטי. הכן את הפתרון חסימה על ידי ערבוב 4% חלב באגירה פוספט מלוחים (PBS) pH 7.4. לחסום את הקרום עם 10 מ"ל של הפתרון חסימה ב- RT לשעה.
   3. להכין ארנב נוגדן ראשוני 1:10,000 אנטי-GAD65/67 ו anti-LHCB2, ועל 1:20,000 עבור האנטי-eGFP ב 5 מ של פתרון חסימה עם חומר ניקוי 0.1%. דגירה הקרום עם הפתרונות מוכן נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C או במשך 4 שעות ב- RT עם עצבנות מתמדת.
   4. למחוק נוגדן ראשוני, לשטוף את הקרום 3 פעמים במשך 5 דקות עם חסימה לאודנום דטרגנט 0.1%.
   5. להכין את חזרת peroxidase (HRP)-תרכיב נוגדן אנטי-ארנב-1:10,000 בחסימה פתרון עם חומר ניקוי 0.1%. דגירה הקרום עבור 1.5 h RT עם עצבנות מתמדת.
   6. למחוק את הנוגדן משני ולשטוף את הקרום 5 פעמים במשך חמש דקות כל עם PBS-T (PBS בתוספת אבקת 0.1%).
   7. דגירה הקרום עם פתרון זמין מסחרית הלומינול ההוראות של היצרן. לזהות את האות באמצעות מערכת הדמיה chemiluminescence.

4. מפעל לעיבוד חומר

1. קציר agroinfiltrated ואקום לבטא ∆87GAD65mut אדום כסלק עוזב בשיא ביטוי (11 dpi) ומקפיאים אותם בחנקן נוזלי.
2. Lyophilize את העלים קפוא במשך 72 h ב-50 ° C ו 0.04 mbar. לאחסן אותם ב- 80 ° c
3. לטחון את העלים כדי אבקה ואחסן אותו ב RT במיכל אטום עם סיליקה ג'ל כדי לא לכלול את הלחות.

5. עיכול קיבה סימולציה וניתוח תקינות התא

1. סימולציה עיכול קיבה
   1. שוקל 100 מ ג של עלים חרקו סלק אדום קפוא ומיובש, resuspend זה ב 6 מ של PBS (pH 7.4).
   2. התאם את רמת החומציות מדגם 2 עם 6 M HCl.
   3. להוסיף 4 מ"ג/מ"ל פפסין חזירי רירית קיבה ב- 10 מ מ ב- HCl כדי להשיג ריכוז פפסין הסופי של 1 מ"ג/מ"ל או יחס של 1:20 חלבונים מסיסים הכולל. לנער את הדגימה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות.
   4. התאם את דגימות ה-pH 8 עם NaOH M 1 כדי להשבית את פפסין.
   5. צנטריפוגה 750 aliquots µL של כל מדגם ב x 20,000 g למשך 20 דקות ב 4 º C. לאסוף בנפרד את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בכרך אחד supernatant של טעינת מאגר (1.5 מ' טריס HCl, pH 6.8, 3% מרחביות, גליצרול 15% ו- 4% מרקפטואתנול).
      הערה: מטעמי בטיחות וגהות, ללבוש כפפות, לעבוד תחת מכסה המנוע fume עבור הכנת הדוגמא.
   6. לנתח את תגובת שיקוע והן בגדר resuspended על ידי ניתוח תספיג⁸.
2. ניתוח שלמות התא
   1. להכין שני מדגמים של 100 מ ג של עלים חרקו סלק אדום קפוא ומיובש, resuspend הן 6 מ של PBS (pH 7.4).
   2. התאם את רמת החומציות של רק אחד לטעום 2 עם 6 M HCl. הנענוע שתי דוגמאות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות.
   3. צנטריפוגה 750 aliquots µL של כל מדגם ב x 20,000 g למשך 20 דקות ב 4 º C. לאסוף בנפרד את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בכרך אחד supernatant של טעינת מאגר.
   4. לנתח את תגובת שיקוע והן בגדר resuspended על ידי ניתוח תספיג חלבון.

6. עומס מיקרוביאלי assay

1. שוקל 100 מ ג של עלים מיובשים בהקפאה סלק אדום. Resuspend את האבקה 8 מ של PBS סטרילי (pH 7.4) ו מערבולת עבור 1 דקות.
2. להכין את המדיום LB ללא אנטיביוטיקה או המכיל 50 (א) µg/mL ריפאמפיצין, (ii) 50 µg/mL כל ריפאמפיצין, carbenicillin, (iii) 50 µg/mL כל ריפאמפיצין, kanamycin או (iv) 50 µg/mL כל ריפאמפיצין, carbenicillin ו kanamycin.
3. בצלחת 1 מ"ל של כל homogenate עלים מיובשים בהקפאה באחד התקשורת LB סלקטיבי 5.
4. תקופת דגירה הצלחות של 3 ימים-28 מעלות צלזיוס.
5. לספור את המושבות Agrobacterium גדל על כל צלחת.
6. לחשב ולהגדיר את המטען חיידקי שיורית ככל שמספר יחידות ויוצרים מושבה (CFU) לכל מיליליטר homogenate עלה הליחה (CFU/mL).

7. מטבוליט החילוץ

1. מטבוליט ראשי החילוץ
   1. שוקל 30 מ"ג-80 ° C המאוחסן, ואקום agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ביטוי סלק אדום אבקה בתוך צינור פלסטיק 2 מ"ל.
   2. להוסיף µL 750 של 70/30 (v/v) קר מתנול/כלורופורם, מערבולת של Incubate ס' 30 ב-20 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
      הערה: כל ממיסים, תוספים חייב להיות כיתה LC-MS.
   3. להוסיף 600 µL של מים קרים, צנטריפוגה ב x 17,900 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לאסוף והעברת השלב העליון hydroalcoholic לתוך צינור 2 מ"ל. להיפטר השלב chloroformic התחתון של לאטמוספרה.
   4. מכניסים את הדגימות מיכשור עבור 3 h מתמוססות ממיסים.
   5. להמיס בגדר המתקבל שלב 7.1.4 ב 300 µL של 50-50 (v/v) acetonitrile/מים, sonicate את הדגימות למשך 3 דקות.
   6. עוברים את הפתרונות 0.2 μm ממברנה מסננים ולשים אותם לתוך שקוף קבוע 300 µL הוספה צינורות זכוכית.
2. מטבוליט משני החילוץ
   1. שוקל 300 מ"ג-80 ° C המאוחסן, ואקום agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ביטוי סלק אדום אבקה בתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל.
   2. להוסיף 3 מ"ל של מתנול, מערבולת ב-30 s, ו sonicate-40 קילו-הרץ למשך 15 דקות.
      הערה: כל ממיסים, תוספים חייב להיות כיתה LC-MS.
   3. Centrifuge את הדגימות ב x 4,500 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להעביר את supernatants לתוך צינורות 15 mL החדש.
   4. שתדללו 100 µL של תמצית 1:3 (v/v) עם מים ולהעביר את הפתרון דרך פילטר ממברנה μm 0.2.
   5. מכניסים את הפתרון שקוף קבוע 300 µL הוספה שפופרת זכוכית.
3. ליפידים קוטביים החילוץ
   1. שוקל 200 מ ג-80 ° C המאוחסן, ואקום agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ביטוי סלק אדום אבקה בתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל.
   2. להוסיף 200 µL של מים, ולאחר מכן 2 מ של מתנול, אז שמור על קרח לשעה.
      הערה: כל ממיסים, תוספים חייב להיות כיתה LC-MS.
   3. מערבולת ב-30 s ו sonicate ב 40 קילו-הרץ למשך 15 דקות.
   4. Centrifuge את דגימות ב x 4,500 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות לאסוף והעברת השלב כלורופורם לתוך צינורות 2 מ"ל. להיפטר השלב העליון hydroalcoholic של לאטמוספרה.
   5. מכניסים את הדגימות מיכשור עבור 3 h מתמוססות הממס.
   6. להמיס בגדר המתקבל שלב 7.3.5 עם 600 µL של מתנול.
   7. שתדללו 100 µL של 1:5 (v/v) עם מתנול לחלץ ולהעביר את הפתרון דרך פילטר ממברנה 0.2-μm.
   8. מכניסים את הפתרון שקוף קבוע 300 µL הוספה שפופרת זכוכית.

8. כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטר מסה ניתוח ועיבוד נתונים

1. להגדיר את המערכת LC-MS כפי שהומלץ על ידי הספק.
   הערה: הסעיף LC מורכב תעשיה בשילוב עם HPLC מצויד סי18 משמר עמודה (75 x 2.1 מ"מ, חלקיקים בגודל 5 מיקרומטר) מול עמודה סי18 (150 x 2.1 מ"מ, חלקיקים בגודל 3 מיקרומטר) לניתוח של מטבוליטים משניים, ליפידים קוטביים , ואילו עם עמודה משמר HILIC (7.5 x 2.1 מ מ, 3 מיקרומטר) מול טור HILIC (150 x 2.1 מ"מ, חלקיקים בגודל 2.7 מיקרומטר). MS היא ספקטרומטר מסה מלכודת יונים סיפק יינון ספקטרומטריית electrospray (ESI) או מקורות יוניזציית כימי (APCI) של לחץ אטמוספירי.
2. היכונו ממיסים המתאים את מעברי הצבע HPLC. לניתוח מטבוליט ראשי, להשתמש formate אמוניום 20 מ מ A ממס; acetonitrile 95%, 5% מים בתוספת 10 מ מ formate אמוניום כמו B. הממס ניתוח מטבוליט המשני, לשימוש מים פלוס 0.05% חומצה פורמית (א) ו- acetonitrile 0.05% חומצה פורמית (B). ניתוח ליפידים קוטביים, לשימוש מים פלוס 0.05% חומצה פורמית (א) ו- 100% acetonitrile (B).
   הערה: ממיסים, תוספים, חייב להיות כיתה LC-MS.
3. השתמש מעברי הצבע שדווחו ב טבלה 1 עבור מטבוליט • תנאי. סט הזרם לדרג ב 0.2 מ"ל לדקה 10 להזריק µL של כל מדגם מטבוליטים משניים וגם ליפידים קוטביים, ואילו להזריק 5 µL של המטבוליטים העיקרי.
4. הכן מדגם בקרת איכות (QC) על ידי ערבוב מנות שוות של דוגמאות שונות יש תערובת נציג של כל תנאי הניסוי. לנתח את המדגם QC במהלך הניסוי כדי לנטר את יעילות המכשיר. באופן ספציפי, הכנס ניתוח מדגם QC לאחר כל 10 מדגם-אצווה.
5. אקראי הדגימות כדי להימנע מונחה מכשיר אפקטים.
6. לאחר ניתוחים 9, הוספת עמודה ניקיון שיטת ניתוח ריק מיד לאחר.
   הערה: לבצע מעבר הדרגתי איטי בין ממיסים שני עם • איזוקראטית תנאי על אחוז גבוה של הממס הכי חזק. הריק מורכב הזרקת מתנול טהור: מים (50-50, v v) כדי לשפר את השמירה הפארמצבטית זמן בניתוח הבא.
7. להגדיר את המכשיר כדי לרכוש ספקטרה המוני במצבי יינון חיוביים ושליליים חלופיים באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה מס ' 2.
   הערה: פרמטרים אחרים תלויים על פלטפורמת ספציפיים.
8. לבצע עיבוד נתונים הבא כפי שהוסבר ב- Dal סנטו et al.⁹.

תוצאות

בעבודה זו, מוצג את זרימת העבודה עבור הפיתוח של חיסון אוראלי ברקמות הצמח אכיל. המוקד של עבודה זו היא הביטוי של חלבון המטרה זן צמח אכיל מארח אפיון חיסון אוראלי פוטנציאליים.

הצעד הראשון מעורב הערכת ההתאמה של הטכנולוגיה מבוססת-וירוס הביטוי צמ...

Discussion

במחקר זה הראינו ניתוח ראשוני על עיצוב האתר של חיסון אוראלי מועמד לטיפול בסוכרת אוטואימונית. החלבון היעד עבור ניסוי זה היה בצורת מוטציה kDa 65 בני אדם Decarboxylase גלוטמט, אשר ייצור ופונקציונליות הם לזיהוי בקלות וניתנת למדידה¹². הביטוי שלה ברקמות צמח מאכל שונים הייתה מתווכת על-ידי וקטו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	-	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	-	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	-	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	-	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	-	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	-	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	-	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	-	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	-
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade