1型糖尿病生物制药候选疫苗在红甜菜中的瞬态表达

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以产生一个口服疫苗候选1型糖尿病在食用植物。

摘要

植物分子耕作是利用植物生产感兴趣的分子。从这个角度来看, 植物既可以作为生物反应器, 用于生产和随后纯化最终产品, 也可以用于使用可食用植物物种时直接口服异源蛋白质。在这项工作中, 我们提出了一个候选口服疫苗1型糖尿病 (T1D) 在食用植物系统中使用解构植物病毒重组 DNA 技术, 以真空渗透交付。我们的研究结果表明, 红甜菜是一个合适的宿主, 用于与 T1D 相关的人类衍生自身抗原的瞬态表达, 被认为是 T1D 疫苗的一个有希望的候选疫苗。对产生自体抗原的叶片进行了彻底的检测, 以了解其对胃消化的抵抗力、残留细菌电荷的存在以及对其的次生代谢状况, 并概述了该过程中的生产, 以便对其潜在的用途进行概述用于直接口服异源蛋白的植物。我们的分析显示, 在模拟胃消化后, 冻干候选口服疫苗几乎完全降解, 这表明在制造植物衍生的 GAD 疫苗时需要一种封装策略。

引言

自20世纪80年代植物分子生物学革命以来, 以植物为基础的生物制药生产系统可以被认为是基于微生物和哺乳动物细胞^{1 的}传统系统的替代品。与传统平台相比, 工厂具有多种优势, 可扩展性、成本效益和安全性是最相关^{的 2}。重组产物可以从转化后的植物组织中纯化, 然后在肠外或口服, 此外, 转化后的食用植物可以直接用于口服。口腔途径同时促进黏膜和全身免疫, 消除了对针头和专业医务人员的需求。此外, 口服可消除复杂的下游加工, 而下游加工通常占重组蛋白³制造总成本的80%。所有这些优势都可以转化为在生产、供应和劳动力方面的节约, 降低每剂的成本, 使全球大多数人口都能负担得起这种药物。

为植物重组蛋白的生产, 提出了几种稳定转化和瞬态表达的策略。其中, 一种高产量解构的植物病毒表达系统 (如 Mamonicon) 提供了卓越的性能, 在相对较短的时间范围内提高了重组蛋白的高产量⁴。报道了在作为金标准生产宿主的烟碱植物中使用植物病毒表达系统的许多瞬态表达的例子。然而, 这种示范植物并不被认为是一种可食用的物种, 因为它的叶子中积累了生物碱和其他有毒代谢物。

在这项工作中, 我们描述了两个可食用的植物系统的比较, 红色甜菜 (贝塔寻常的 Cv红磨坊) 和菠菜 (菠菜就是cv 工业), 表达了两种候选形式的 65 kda 谷氨酸异形脱羧酶 (GAD65), 由基于植物病毒的载体⁵进行。GAD65 是一种与1型糖尿病 (T1D) 相关的主要自身抗原, 目前正在人体临床试验中进行研究, 以通过诱导耐受性⁶来预防或延缓 T1D。在植物中生产 gad65 的过程中, 以烟叶和5%、⁶、^7为典型植物种类进行了广泛的研究。在这里, 我们描述了使用食用植物物种生产的分子组织, 可用于直接口服。从技术角度出发, 通过对重组蛋白表达水平、植物残留微生物电荷等不同参数的评价, 研究并选择了 GAD65 生产的植物农业渗透系统和食用植物平台。用于口服的组织, GAD65 对胃消化的抵抗力, 以及转化后的植物与野生类型的生物等效性。

研究方案

1. 红甜菜和菠菜栽培

1. 生长红甜菜(b. vulgaris cv红磨坊) 和菠菜 (s.深恶痛绝 cv industria) 植物在生长室中, 分别使用150μe 的光强, 65% 相对湿度, 在231°c 下12小时光/暗周期。
2. 种子萌发后, 每周用市售肥料的 1 gl 溶液 (材料表) 给植物施肥两次。对于农业渗透使用5周龄菠菜和6周龄的红甜菜植物。

2. 解构植物病毒技术的瞬态表达

1. 植物表达载体的构建
   1. 介绍载体----5 ' 模块 (pich20111)、3 ' 模块 (pICH20111. gad65mut、pICH31070.∆87G65mut 和 pich7410. egfp), 如前面所述的^1、2、7和集成酶模块 (pICH20111)----采用标准技术对农杆菌 gv3101 菌株进行研究。生长在含有50μgml 利福平和适当的 vector 特异性抗生素的 LB 培养基上 (50μgml 卡比西林用于 pICH20111, PICH20111 和 pich争取 7410. Egfp, 50μgml 卡那霉素治疗 PICH20111), 在28°C 下为期2天。
   2. 使用每个载体的特定引物, 用菌落 PCR 筛选菌落: 5 '-ATTAAGGGTACCTCG-3 ' 和 5 '-ACACCCTTCTCTTTTC-3 ' 的 3 ' 模块 pich31070. gadd65mut 和 pICH31070.∆87G65mut, 退火温度为55°c 和第三个 3 ' 模块 pich74. 10. egfp 的伸长时间为110、5 '-TGAGTCATCACCACC-3 ', 退火温度为 53°c, 伸长时间为 30秒, 5 '-AATGTCTCTCTCG-3 ' 和 5 '-TCCCTTAAGGTGTG-3 '对于 5 ' 模块, 退火温度为 53°c, 伸长时间为20秒和 5 '-GGACCCTGATGGATCC-3 ' 和 5 '-GATGGGCCGCAACGACGA-3 ' 的整合酶模块的退火温度为 57°c, 伸长时间为45秒。
   3. 使用以下特定反应周期在20μl 的总体积内进行 PCR 反应: 95°c 时初始变性 5分钟, 95°c 时 350个月, 退火温度下 30秒, 72°c 时伸长率步长 (退火温度和伸长率为对于每对底漆夫妇, 请选择特定的), 在72°c 下, 最后的伸长率为7分钟。
2. 注射器农业浸润
   1. 在含有50μgml 利福平的 LB 介质和以下适当的 Vector-specific 特异性抗生素中接种三种 a.肿瘤转化剂: 50μml 卡比西林 (pich20111, pICH14011 或 pich7410. egfp, 或50μgml 卡那霉素, 用 pICH31070 转化为a. tumefaciens 。在28°c 下连夜晃动而生长。
   2. 在 4, 500 x克离心 20分钟, 并在含有 10 mL 4-吗啡-乙磺酸 (mes; ph 5.5) 和 10 mm 的渗透缓冲液的100毫升 (或初始细菌培养的两卷) 中重新悬浮细菌培养, 并将其重新悬浮在渗透缓冲液中。MgSO₄, 不考虑 od_600.在室温下 (RT) 下对悬浮液进行3年的孵化。
   3. 将含有 GAD65mut、"87Gad65mut" 或 eGFP 3 ' 模块的三个模块之一的等量细菌悬浮液与 5 ' 模块和集成酶模块混合。使用悬浮液混合注射器渗透红甜菜和菠菜叶。
   4. 将悬浮液的5毫升放置在没有针头的注射器中。将注射器的尖端按在菠菜和红甜菜植物的叶子下部, 同时对叶片的另一侧施加温和的反压。
   5. 渗透前三个完全膨胀的叶子从顶点开始为每个植物。在农业浸润的叶子上贴上纸标签。在标准条件下将生长室内的植物送回。
      注: 出于健康和安全原因, 在渗透过程中佩戴护目镜和手套。
   6. 收集感染后4至14天的农业浸润叶片 (dpi), 并将其冷冻在液氮中。将植物组织存放在-80°c。
3. 真空农业渗透
   1. 在含有50μgml 利福平和适当的 VECTOR 特异性抗生素的 lb 培养基50毫升中分别生长, 在28°c 下夜间晃动.
   2. 在 4, 500 x克离心下进行隔夜细菌培养, 20分钟. 将渗透缓冲液 1 l 中的颗粒重新悬浮到0.35 的 od 600,并在 rt 孵育3小时。
   3. 在每个悬浮液中加入0.01% 的洗涤剂 (聚山梨酸酯 20)。将含有 GAD65mut、"87Gad65mut" 或 eGFP 3 ' 模块的三个模块之一的等量细菌悬浮液与 5 ' 模块和集成酶模块混合。
   4. 在支架中插入一个工厂 (6周前的红甜菜厂, 见第1节)。将含有渗透浴 (2 L) 的烧杯上的支架和地方倒置, 将叶片浸入渗透悬浮液中。
      注: 确保所有的叶子完全浸入细菌悬浮液。提高水平, 如有需要, 增加额外的渗透暂停。
   5. 将浸入式浴池与浸没的植物转移到渗透室并将其关闭。打开真空泵, 打开渗透腔上的真空进气阀。
   6. 一旦渗透室内的压力降低到90毫巴, 将真空保持 3分钟, 释放真空45秒。一旦渗透室恢复到大气压力, 打开腔内, 将浸润的植物从细菌浴中取出。
   7. 在标准条件下将生长室内的植物送回。
   8. 根据重组蛋白的不同, 以最大表达 dpi 收集农业浸润的叶片, 并将其冷冻在液氮中。将植物组织存放在-80°c。

3. 重组蛋白表达分析

1. 总可溶性蛋白质 (TSP) 提取
   1. 将注射器或真空浸润的红甜菜和菠菜叶磨碎, 按步骤收集2.2.6 和 2.3.8, 用砂浆和茎在液氮中细粉。将粉末转移到15毫升塑料管中, 并将材料存放在-80°c。
   2. 加入900Μl 的萃取缓冲液 (50 mM 磷酸钠 pH 值 8.0, 20 mM 亚亚硫酸钠) 到300毫克的叶粉中。
      注: 植物组织重量 (mg) 与缓冲液体积 (μL) 之间的选定比率为1:3。
   3. 通过旋涡 1分钟, 然后在4°C 下离心 40分钟, 使混合物均匀.
   4. 将上清液收集在干净的管中, 并将其存放在-80°c。
2. 植物 eGFP 可视化和定量
   1. 在96孔板上, 以三个技术复制的形式加载从 eGFP 表达叶子的每个 TSP 提取物的100Μl。
   2. 将96孔板放入荧光读取器中, 开始测量。使用 eGFP 荧光检测所需的 485535 nm 滤光片集。
   3. 为了绝对定量, 在同一板块中准备校准曲线, 加载不同数量的纯化 eGFP (62.5、125、500、750和 1, 000 纳克)。
3. 双氯苯酸 (BCA) 测定 TSP 的定量
   1. 将试剂 A (材料表) 的50个部分与试剂 b (材料表) 的1份混合。准备足够数量的新鲜 BCA 工作解决方案, 以便对样品进行检测和校准标准。
      注: 每个样品所需的 BCA 工作解决方案的体积为 1.9 mL。对于具有9个标准 (包括空白) 的标准程序, 需要 17.1 mL 的 BCA 工作解决方案。
   2. 每个标准的移液器 0.1 mL (包括一个空白) 和 TSP 提取成一个标记的管。
      注: 作为校准标准, 在10-1000 微米范围内制定一套新的牛血清白蛋白 (BSA) 标准, 最好使用与样品相同的稀释剂, 如水。该空白由 0.1 mL 的稀释剂组成, 用于校准标准和样品制备。
   3. 加入1.9 毫升的 BCA 工作溶液, 彻底混合。盖上管子, 在37°c 孵育30分钟。
   4. 将管材冷却到 RT, 在10分钟内测量所有样品的562纳米吸收率。
      注: 即使在 RT, 颜色的发展仍在继续。如果在10分钟内完成所有管的吸收率测量, 不会出现重大误差。
   5. 从标准和 TSP 提取物的读数中减去空白的 562 nm 吸收值。
   6. 绘制每个标准的空白校正 562 nm 读数的浓度。确定每个 TSP 提取物的蛋白质浓度。
4. 进行 Coomassie 凝胶染色, 如前面在 Gecchele 等人。
5. 西方印迹分析
   1. 按照 Gecchele 等人的前面描述的, 进行西方印迹分析.
   2. 蛋白质电泳分离后, 使用标准技术将其转移到硝化纤维素膜上。将4% 的牛奶混合在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) pH 值7.4 中, 制备阻止溶液。用10毫升的阻塞溶液在 RT 封堵膜1小时。
   3. 用0.1% 洗涤剂在1:10000 处制备抗 Gad65/67 和抗 LHCB2 的兔原代抗体, 在1:20000 时制备抗 egfp 的抗 egfp。在4°C 下用准备好的原代抗体溶液在4°c 下或在 RT 中连续搅拌4小时对膜进行培养。
   4. 丢弃原代抗体, 用含有0.1% 洗涤剂的阻滞液清洗膜 3次, 每次5分钟。
   5. 用0.1% 洗涤剂在阻止溶液中制备辣根过氧化物酶 (HRP)-共轭抗家兔抗体。在 RT 处不断搅拌, 将膜培养1.5 小时。
   6. 丢弃二级抗体, 用 PBS-T (PBS 补充0.1% 洗涤剂) 清洗膜 5次, 每次5分钟。
   7. 按照制造商的说明, 用市售的发光醇溶液对膜进行培养。使用化学发光成像系统检测信号。

4. 植物材料加工

1. 在表达峰 (11 dpi) 采集真空农业浸润的87GAD65mut 表示红甜菜叶, 并将其冷冻在液氮中。
2. 在-50°c 和0.04 毫巴的情况下, 将冷冻叶冷冻干燥72小时。将它们存放在-80°c。
3. 将叶子磨成细粉, 并将其存放在用硅胶密封的容器中, 以排除水分。

5. 胃消化模拟和细胞完整性分析

1. 胃消化模拟
   1. 称量100毫克的磨碎冻干红甜菜叶, 并在6毫升的 PBS (pH 7.4) 中重新悬浮。
   2. 使用 6m HCl 将样品 ph 值调整为2。
   3. 在 10mm Porcine 中加入猪胃黏膜中的 4 Mg\ ml 胃蛋白酶, 最终得到 1 mg/mL 或1:20 与总可溶性蛋白的比例。在37°c 下摇晃样品120分钟。
   4. 用 1 M NaOH 将样品调整到 pH 值 8, 以灭活胃蛋白酶。
   5. 在4°C 条件下, 以 20, 000 x g 的速度离心每个样品的 750μl aliquots, 时间为20分钟。分别收集上清液并将颗粒重新悬浮在一个加载缓冲液的上清液体积中 (1.5 M Tris HCl, pH 值 6.8, 3% SDS, 15% 甘油和 4% 2-甲基)。
      注: 出于健康和安全原因, 请戴手套, 在通风罩下工作, 以便制备样品。
   6. 用西方印迹分析8对上清液和再悬浮颗粒进行了分析^.
2. 细胞完整性分析
   1. 准备两个样品的100毫克磨冻干燥红甜菜叶, 并重新悬浮在6毫升的 PBS (pH 7.4)。
   2. 将只有一个样品的 pH 值调整到 2, HCl 为 6 m HCl. 在37°c 下将两个样品摇一摇120分钟。
   3. 在4°C 条件下, 以 20, 000 x g 的速度离心每个样品的 750μl aliquots, 时间为20分钟。分别收集上清液, 并将颗粒重新悬浮在一个加载缓冲液的上清液体积中。
   4. 采用西方印迹分析的方法对上清液和再悬浮颗粒进行了分析。

6. 生物检测

1. 重量100毫克冻干红甜菜叶。将粉末在无菌 PBS (pH 7.4) 和涡旋的8毫升中重新采样1分钟。
2. 在不使用抗生素或含有 (i) 50μgml 利福平的情况下制备 LB 培养基, (ii) 利福平和卡苯青霉素各 50μgml, (三) 利福平和卡那霉素各 50μgl, 或 (四) 利福平、卡贝西林和卡那霉素各50μgml。
3. 在5个选择性 LB 介质中的一种中, 每种冻干叶均质板1毫升。
4. 在28°c 下将所有板材取出3天。
5. 数一数每个盘子上生长的农杆菌菌落。
6. 计算并定义残留细菌电荷为冻干叶均质 (cfu) 每毫升的菌落形成单元 (CFU) 的数量。

7. 代谢物提取

1. 主要代谢物提取
   1. 重量30毫克-80°c 储存, 真空农业浸润 "87GAD65mut-表达红甜菜叶粉在一个2毫升塑料管。
   2. 加入750Μl 的冷 70/30 (v/v), 为 30s. 在-20°c 时培养2小时。
      注: 所有溶剂和添加剂必须是 LC-MS 级。
   3. 在17900Xg 的4°c 下加入600μl 冷水和离心机, 在4°c 下收集并转移到新的2毫升管中。丢弃较低的氯仿相和间期。
   4. 将样品放入真空集中器 3小时, 使溶剂蒸发。
   5. 将从步骤7.1.4 中获得的颗粒溶解在300Μl 中, 每 50 (v/v) 乙腈/水, 并将样品与样品进行3分钟的超声处理。
   6. 通过0.2μm 膜过滤器将溶液通过, 并将其放入透明的固定300μl 插入玻璃管中。
2. 次生代谢物提取
   1. 重量300毫克-80°c 储存, 真空农业浸润 "87GAD65mut-表达红甜菜叶粉在一个15毫升塑料管。
   2. 加入3毫升甲醇, 涡流 30秒, 在 40 kHz 的情况下超声15分钟。
      注: 所有溶剂和添加剂必须是 LC-MS 级。
   3. 在4°c 条件下以 4, 500 x克的温度离心样品 10分钟, 并将上清液转移到新的 15 ml 管中。
   4. 用水稀释 1: 3 (vv) 的 100μl, 并通过0.2μm 的滤膜将溶液通过。
   5. 将溶液放入透明的固定300μl 插入玻璃管中。
3. 极脂萃取
   1. 重量200毫克-80°c 储存, 真空农业浸润 "87GAD65mut-表达红甜菜叶粉在一个15毫升塑料管。
   2. 加入200Μl 的水, 然后加入2毫升的甲醇, 然后在冰上保持1小时。
      注: 所有溶剂和添加剂必须是 LC-MS 级。
   3. 30 s 的涡流和声音在 40 kHz 15分钟。
   4. 在4°c 下以 4, 500 x 克的速度离心样品 25分钟, 收集氯仿相并将其转移到2毫升管中。放弃上氢酒精期和间期。
   5. 将样品放入真空集中器 3小时, 使溶剂蒸发。
   6. 用600μl 甲醇溶解从步骤7.3.5 中获得的颗粒。
   7. 用甲醇稀释 1: 5 (vv) 的100μl 萃取物, 并通过0.2μm 的滤膜将溶液通过。
   8. 将溶液放入透明的固定300μl 插入玻璃管中。

8. 液相色谱质谱分析和数据处理

1. 按照供应商的建议建立 LC-MS 系统。
   注: LC 部分由自动取样器和 HPLC 组成, 在 C18 柱 (150 x 2.1 毫米, 粒径3微米) 前装有 C18 防护柱 (75 x 2.1 毫米, 粒径 5μm), 用于分析次生代谢物和极性脂质, 而在 HILIC 柱前面使用 HILIC 防护柱 (7.5 x 2.1 mm, 3μm) (150 x 2.1 mm, 粒径 2.7μm)。MS 是一种离子陷阱质谱仪, 具有电喷雾电离 (ESI) 或大气压力化学电离 (APCI) 源。
2. 为高效液相色谱梯度准备适当的溶剂。在初级代谢物分析中, 使用 20 mM 甲酸铵作为溶剂 A;95% 乙腈, 5% 水加 10 mm 甲酸铵为溶剂 B。对于次生代谢物分析, 请用水加0.05% 甲酸 (A) 和乙腈加0.05% 甲酸 (B)。对于极性脂质分析, 用水加0.05% 甲酸 (A) 和100% 乙腈 (B)。
   注: 溶剂和添加剂必须是 LC-MS 级。
3. 使用表 1中报告的梯度进行代谢物洗脱。将流量定为 0.2 Ml/min, 为次生代谢物和极性脂质注入每个样本 10μl, 而为初级代谢物注入5μl。
4. 通过混合不同样品的相等部分来制备质量控制 (QC) 样品, 以使每个实验条件具有代表性的混合物。在实验过程中分析 QC 样品, 以监测仪器效率。具体而言, 在每个采样批次之后插入 QC 样品分析。
5. 随机的样品, 以避免仪器驱动的影响。
6. 9分析后, 立即插入列清洗方法和空白分析。
   注: 在最强溶剂的高百分比下, 用等温洗脱法在两种溶剂之间执行慢速梯度。空白包括注射纯甲醇: 水 (50/50, v2), 以提高保留时间的重现性在以下分析。
7. 使用表 2中列出的参数设置仪器, 以交替的正负电离模式获取质谱。
   注: 其他参数取决于特定平台。
8. 按照 Dal Santo 等人的解释, 执行下一个数据处理.

结果

本文介绍了在食用植物组织中开发口服疫苗的工作流程。这项工作的重点是在可食用寄主植物物种中表达目标蛋白和对潜在口服疫苗的定性。

第一步是评估基于植物病毒的表达技术是否适合在食用植物系统中产生重组蛋白。为此, 我们首先使用 eGFP 作为模型蛋白, 并将其表达为两个可食用的叶植物系统: 红甜菜和菠菜。植物通?...

讨论

在这项研究中, 我们对自身免疫性糖尿病候选口服疫苗的设计进行了初步分析。本实验的目标蛋白是人类 65 kDa 谷氨酸脱羧酶的突变形式, 其生产和功能易于检测和测量 12.它在不同食用植物组织中的表达是由载体⁵介导的, 在很短的时间内介导高水平的重组蛋白产生。根据红甜菜和菠菜叶片中 eGFP 表达的方法, 通过人工农业浸润, 选择了最佳候选植物食用寄主。由?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	-	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	-	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	-	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	-	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	-	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	-	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	-	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	-	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	-
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade