قياس الاستقرار الانزيمية بالقياس متحاور المعايرة

Summary

ويقاس الثبات الحراري لنشاط إنزيم سهولة بمعايرة متحاور القياس (ITC). معظم فحوصات الاستقرار البروتين المستخدمة في قياس البروتين التي تتكشف حاليا، ولكن لا توفر معلومات حول النشاط الأنزيمي. مركز التجارة الدولية يتيح التصميم مباشرة أثر التعديلات الإنزيم على الاستقرار نشاط الإنزيم.

Abstract

ويوضح هذا العمل أسلوب جديد لقياس استقرار نشاط إنزيم بمعايرة متحاور القياس (مركز التجارة الدولية). ذروة الحرارة المعدل الملاحظ بعد حقنه واحدة من الحل الركيزة في حل إنزيم يرتبط بنشاط إنزيم. إظهار حقنات متعددة من الركازة إلى نفس الحل الإنزيم مع مرور الوقت الخسارة في نشاط إنزيم. المقايسة المتمتعة بالحكم الذاتي، التي تتطلب القليل جداً من وقت الموظفين، وهو ينطبق على معظم وسائل الإعلام والأنزيمات.

Introduction

الإنزيمات بروتينات قادرة على حفز مجموعة واسعة من التفاعلات العضوية. معظم الإنزيمات الدالة في محلول مائي في القرب من الأس الهيدروجيني محايدة وبالتالي تجنب استخدام المذيبات قاسية. وبسبب هذه الانتقائية العالية، إنتاج إنزيم حفزت ردود الفعل أقل (في بعض الحالات لا تركات) تركات من محفزات غير انتقائية مثل الأحماض والقواعد¹. وهذا مهم خصوصا في تصنيع الأغذية ويجب أن يتم فيها جميع التفاعلات الكيميائية حتى المنتج النهائي آمنة للاستهلاك البشري. حاليا، والأنزيمات تستخدم لإنتاج ارتفاع سكر الفواكه عصير الذرة²والجبن³، البيرة⁴، الحليب الخالي من اللاكتوز⁵، وغيرها من المنتجات الغذائية الهامة. بينما تركز هذه الورقة على استخدام إنزيم في صناعة المواد الغذائية، وهناك العديد من الاستخدامات الأخرى للإنزيمات بما في ذلك في توليف المخدرات والكيمياء الخضراء.

الأداة المساعدة للإنزيمات محدود باستقرار نشاط الإنزيم، الذي يعتمد على الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد للانزيم. يمكن أن تستقر بنية الإنزيم التعديلات مثل بيجيليشن⁶، والتثبيت على دعم قوي⁷والتعديلات الوراثية⁸والصياغات. حاليا استقرار الإنزيم يقاس عادة بالقياس المسح التفاضلي (DSC)، ونشاط إنزيم نقطة النهاية فحوصات⁹. DSC يقيس درجة الحرارة التي تتكشف إنزيم؛ ارتفاع درجة الحرارة، الأكثر استقرارا في الهيكل. ومع ذلك، غالباً ما يحدث فقدان النشاط عند درجة حرارة أقل مما هو مطلوب تتكشف إنزيم أو المجالات داخل الإنزيم¹⁰. ولذلك، DSC ليس كافياً لتحديد ما إذا كان تعديل إنزيم يزيد من استقرار نشاط إنزيم. فحوصات إنزيم نقطة النهاية هي عادة الوقت مكثفة، وتتطلب عينات متعددة، وغالباً ما تنطوي على رد فعل اللونية إلى جانب أن هذا لا ينطبق على الحلول عالية الملونة أو مبهمة أو تعليق.

يوضح هذا العمل وسيلة لقياس مباشر لاستقرار نشاط إنزيم بمعايرة متحاور القياس (مركز التجارة الدولية). مركز التجارة الدولية يقيس معدل الحرارة الإفراج أو استيعابها وأثناء رد فعل. منذ ما يقرب من جميع ردود الفعل إنتاج أو امتصاص الحرارة، يمكن استخدام المركز لمعظم الإنزيم حفزت ردود الفعل، بما في ذلك ردود الفعل التي لا يكون لها رد فعل يزوج أو تحدث في وسائل الإعلام مبهمة مثل الحليب. مركز التجارة الدولية وقد استخدمت لعقود عديدة لقياس البارامترات الحركية الكيميائية لأنواع كثيرة من ردود الفعل، ولكن البروتوكول المعروضة هنا يركز على استخدام المركز لقياس معدل الحرارة الذروة لحفز إنزيم ردود الفعل ويدل على أن نشاط إنزيم خطيا يرتبط بمعدل الحرارة القصوى. مركز التجارة الدولية إجراء قياسات لمعدلات الحرارة القصوى هي في معظمها المتمتعة بالحكم الذاتي وتتطلب القليل جداً من وقت الموظفين لإعداد وتحليل.

Protocol

1-إعداد العينات

1. 1,000 مل مخزن خلات الصوديوم 0.1 M في الأس الهيدروجيني 4.6
   1. قياس 800 مل ماء المقطر في كوب 1,000 مل تخرج.
   2. وزن ز 8.2 من خلات الصوديوم اللامائية وإضافته إلى الكأس.
   3. ضع في الكأس على طبق من إثارة ووضع قضيب إثارة في الكأس، تشغيل لوحة ضجة ويحرك حتى يذوب تماما.
   4. خلات الصوديوم لا مائي عندما يذوب تماما، وقياس درجة حموضة الحل مع مقياس الأس الهيدروجيني معايرة.
   5. أضف 1 M HCl أو هيدروكسيد الصوديوم تبعاً لذلك للحصول على درجة الحموضة المطلوبة 4.6.
   6. أضف الماء المقطر حتى يصل إجمالي حجم مل 1,000.
   7. تخزين في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
2. حل الإنزيم
   1. إعداد 10 مل اسطوانة الحل داخل نطاق 10-30 ملغ/مل من أول مل 8 قياس من 0.1 متر صوديوم اسيتات المخزن المؤقت pH 4.6 في 15 مل تخرج إنزيم.
   2. إضافة حل المخزن المؤقت إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع الإنزيم واهتز بشدة حتى الإنزيم قد حلت.
   3. إضافة المزيد المخزن المؤقت الحل حتى يصل إجمالي حجم 10 مل.
   4. تخزين محلول الإنزيم عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
3. الحل الركيزة
   1. إعداد حلاً الركيزة في نطاق 300-600 مم، حساب كمية الركازة اللازمة في غرام لجعل التركيز المطلوب.
   2. تزن من الركازة ووضع في دورق زجاج 100 مل
   3. قياس 20 مل الحل المخزن المؤقت باستخدام اسطوانة 25 مل تخرج وثم إضافته إلى كوب الزجاج.
   4. ضع في الكأس على طبق من إثارة ووضع قضيب إثارة مغناطيسية في الكأس. تحويل الحرارة وضبط سرعة إثارة تبعاً لذلك.
   5. السماح بالتحريك للمتابعة حتى الركيزة قد حلت.
   6. صب الحل الركيزة في أنبوب 50 مل مخروطية وإضافة 0.1 م خلات الصوديوم المخزن المؤقت pH 4.6 حتى يصل إجمالي حجم 45 مل. مزيج من الهز.
   7. تخزين الحل الركيزة في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.

2-القيام بالتجربة

1. إعداد الصك مركز التجارة الدولية
   1. تأكد من أن يتم تحميل الخلية المرجعية مع 350 ميليلتر من الماء المقطر. قبل تحميل الإنزيم إلى الخلية عينة، تحقق من أنه قد تم تنظيف الخلية عينة.
   2. تنظيف البروتوكول في ملء المحاقن التحميل مع 500 ميليلتر من محلول التنظيف 2% (جدول المواد)، بعناية إدراج الإبرة في الخلية عينة وتعبئة الخلية وإزالة السائل باستخدام نفس المحاقن ببطء. التصرف السائل في كوب. كرر هذه الخطوة مرتين مع محلول التنظيف 2% (جدول المواد)، ثلاث مرات مع الإيثانول 70% ويغسل عشر مرات بماء مقطر.
   3. ملء المحاقن التحميل مع 450 ميليلتر من حل الإنزيم، بعناية إدراج الإبرة وصولاً إلى الجزء السفلي من نموذج الخلية واضغط المكبس وصولاً إلى الخط 100 ميليلتر ببطء منع تكوين فقاعات الهواء.
   4. أغسل المحاقن معايرة 50 ميليلتر بالماء المقطر ثلاث مرات بوضع طرف الإبرة في الماء ثم تناول الماء في المحاقن ببطء، ثم الاستغناء عن المياه في حاوية نفايات.
   5. إزالة المياه المتبقية قبل الشطف بمحلول الركازة ثلاث مرات.
   6. ملء المحاقن المعايرة بمحلول الركازة برسم الحل الأعلى حتى يتم حقنه الكامل دون أي فقاعات الهواء.
   7. مع المحاقن لا يزال في الحل الركازة، إزالة المكبس والسماح لحوالي 2 ميليلتر من الجو إدخال الجزء العلوي من المحاقن وإعادة تركيبها المكبس.
   8. إزالة مقبض بريت لمركز التجارة الدولية، ووضع حقنه داخل المقبض بريت والمسمار حتى ضيق.
   9. مسح غيض محرض مع أنسجة خالية من الوبر، ثم بعناية وضع مقبض بريت في الصك المركز وقفله في المكان.

3-إعداد إيتكرون

1. على جهاز الكمبيوتر، افتح إيتكرون ثم انقر فوق إعداد.
2. انقر فوق معدل التحريك وتعيين إلى 350 دورة في الدقيقة. تحقق من حجم المحاقن (ميليلتر) والتأكد من أنها في 50 ميليلتر.
3. ضبط درجة حرارة وضغط التحديث. من المستحسن أن يتم تنفيذ هذه الخطوة على الأقل 1 ساعة قبل إعداد مركز التجارة الدولية. وهذا ما يسمح الوقت الكافي للصك تسخين أو تبريد حسب الحاجة.
4. لتجربة برنامج الإعداد، حدد المعايرة تزايدي.
5. انقر فوق إدراج للإعداد الحقن. ضبط الفاصل الزمني الحقن إلى 5,400 s، حجم الحقن (ميليلتر) إلى 4 وعدد الحقن إلى 4. اضغط موافق لتأكيد الإعدادات.
6. في خانة الموازنة، حدد حجته السيارات و الكبيرة المتوقع مع ارتفاع درجات الحرارة. (إذا كانت صغيرة ارتفاع درجات الحرارة المتوقعة، واحد يمكن تحديد الصغيرة تحت ارتفاع درجات الحرارة المتوقعة؛ ومع ذلك، وهذا سيزيد الوقت الموازنة).
7. تعيين الأساس الأولية إلى 300 ثانية.
8. لبدء التشغيل، انقر فوق الرمز الموجود بجانب معدل التحريك ابدأ وثم انقر فوق بدء تشغيل الذي يقع بجوار الرمز وجع.
9. قم بحفظ الملف وتسمح هذه الوسيلة لتشغيل.

4-تحليل البيانات

1. قم بفتح الملف في نانواناليزي. انقر فوق البيانات وتحديد أعمدة البيانات.
2. حدد كافة البيانات ونسخ ثم لصق البيانات في Microsoft Excel.
3. ضبط خط الأساس الصفري بإضافة القيمة المطلوبة 300 s لتجعل من الصفر. تطبيق هذا التصحيح على العمود بأكمله من قيم معدل الحرارة.
4. البحث عن قيمة الحد الأدنى أو الحد الأقصى لمعدل الحرارة لكل الحقن باستخدام المعادلة: =MIN(cell:cell) أو MAX(cell:cell). كل نقطة بيانات يمثل ذروة النشاط الأنزيمي إنزيم في كل حقن.
5. رسم الرسوم البيانية للقيم الأدنى أو الأقصى مقابل الوقت الذي حدث القيمة أثناء المعايرة.

النتائج

النتائج ممثلة في الشكل 1 و الشكل 5 إظهار البيانات من الإنزيمات اثنين، اللاكتاز وإينفيرتاسي. اللاكتاز و invertase تحفيز التحلل المائي ديساكهارايد إلى اثنين من السكريات الأحادية، اندوثيرميكالي واكسوثيرميكالي، على التوالي. تم تشغيل كل التفاعلات الانزيمية في الت...

Discussion

ميزة رئيسية للمقايسة الاستقرار إنزيم المركز الموصوفة هنا هو التشغيل الآلي للمكاتب. حالما يتم إجراء كافة المخازن المؤقتة الملائمة والحلول، وقت الإعداد لكل فحص حوالي 15 دقيقة للشخص الذي يقوم الفحص. على النقيض من ذلك، تتطلب فحوصات التقليدية للنشاط invertase واللاكتاز حوالي 2 ح مع مشاركة مستمرة م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)