等温滴定量计测定酶稳定性

摘要

酶活性的热稳定性很容易用等温滴定量热法 (ITC) 测量。目前使用的大多数蛋白质稳定性检测测量蛋白质展开, 但没有提供有关酶活性的信息。通过国贸中心, 可以直接测定酶修饰对酶活性稳定性的影响。

摘要

本研究展示了一种用等温滴定量法 (ITC) 测量酶活性稳定性的新方法。将底物溶液注入酶溶液后观察到的峰值热率与酶活性相关。随着时间的推移, 多次将底物注射到相同的酶溶液中, 表明酶活性的丧失。该检测是自主的, 只需要很少的人员时间, 适用于大多数培养基和酶。

引言

酶是能够催化各种有机反应的蛋白质。大多数酶在接近中性 ph 值的水溶液中发挥作用, 从而避免使用苛刻的溶剂。由于酶催化反应具有很高的选择性, 因此其副产品产生的副产品比酸和碱等非选择性催化剂少.这在食品制造中尤其重要, 因为在食品制造中, 所有的化学反应都必须进行, 这样最终产品对人类消费是安全的。目前, 酶被用于生产高果糖玉米糖浆², 奶酪³, 啤酒⁴, 无乳糖牛奶⁵, 和其他重要的食品。虽然本文主要研究酶在食品工业中的应用, 但酶还有许多其他用途, 包括在绿色化学和药物合成方面。

酶的效用受到酶活性稳定性的限制, 而酶活性的稳定性取决于酶的三维结构的维持。酶结构可以通过修饰来稳定, 如聚乙二醇化⁶, 固定化上的固体支持⁷, 基因修饰⁸, 和配方。目前, 酶的稳定性通常是通过差示扫描量热法 (DSC) 和端点酶活性检测⁹来测量的。DSC 测量酶展开的温度;温度越高, 结构越稳定。然而, 活性的丧失往往发生在低于所需的温度, 以展开酶^或域内的酶10。因此, DSC 不足以确定酶修饰是否能提高酶活性的稳定性。端点酶检测通常需要大量时间, 需要多个样品, 并且通常涉及不适用于高颜色或不透明溶液或悬浮液的耦合比色反应。

本研究展示了一种用等温滴定量法 (ITC) 直接测定酶活性稳定性的方法。国贸中心测量反应过程中释放或吸收的热量率。由于几乎所有反应都会产生或吸收热量, ITC 可用于大多数酶催化反应, 包括没有耦合反应或发生在牛奶等不透明介质中的反应。几十年来, 国贸中心一直被用来测量多种反应的化学动力学参数, 但这里介绍的协议侧重于使用 itc 来测量酶催化反应的峰值热率, 并表明酶活性是线性的与峰值热速率相关。ITC 对峰值热率的测量大多是自主的, 只需很少的人员时间来设置和分析。

研究方案

1. 样品的制备

1. ph 值4.6 下 0.1 M 醋酸钠缓冲液 1, 000 毫升
   1. 测量800毫升的蒸馏水在一个1000毫升的刻度烧杯。
   2. 称量8.2 克无水醋酸钠, 并将其添加到烧杯中。
   3. 将烧杯放在搅拌板上, 将搅拌棒放入烧杯中, 打开搅拌板搅拌至完全溶解。
   4. 当无水醋酸钠完全溶解时, 用校准的 pH 计测量溶液的 pH 值。
   5. 相应地添加 1 M HCl 或 NaOH, 以获得所需的 pH 值4.6。
   6. 加入蒸馏水, 直到总体积为 1, 000 毫升。
   7. 在室温下存放, 直至使用。
2. 酶溶液
   1. 在 10-30 Mg/ml 范围内准备10毫升的酶溶液, 首先在15毫升刻度缸中测量 0.1 m 醋酸钠缓冲液 pH 4.6 的8毫升。
   2. 将缓冲液加入使用酶的15毫升锥形管中, 用力摇晃, 直到酶溶解。
   3. 添加更多的缓冲区解决方案, 直到总体积为10毫升。
   4. 将酶溶液存放在 4°c, 直至使用。
3. 基板解决方案
   1. 要在 300-600 mM 范围内制备基板溶液, 请计算所需的基板量 (以克为 1), 以获得所需的浓度。
   2. 称量基板, 放入100毫升玻璃烧杯
   3. 使用25毫升刻度缸测量缓冲液的20毫升, 然后将其添加到玻璃烧杯上。
   4. 将烧杯放在搅拌板上, 并将磁棒放入烧杯中。打开暖气, 相应地调整搅拌速度。
   5. 允许搅拌继续, 直到基板溶解。
   6. 将基板溶液浸入50毫升锥形管中, 加入 0.1 m 醋酸钠缓冲液 ph 4.6, 直至总体积为45毫升。通过晃动混合。
   7. 将基板溶液存放在室温下, 直至使用。

2. 执行实验

1. 编写国贸中心文书
   1. 确保参考电池中装载了350μl 的蒸馏水。在将酶加载到样品细胞之前, 请验证样品细胞是否已被清洗。
   2. 清洗协议-用500μl 的2% 清洁溶液 (材料表) 填充装载注射器, 小心地将针头插入样品细胞, 填充电池, 然后使用相同的注射器慢慢取出液体。将液体放入烧杯中。用2% 的清洁溶液 (材料表) 重复此步骤两次, 用70% 乙醇重复三次, 然后用蒸馏水清洗10次。
   3. 用450μl 的酶溶液填充装载注射器, 小心地将针头一直插入样品细胞底部, 然后将柱塞慢慢按下100Μl 线, 以防止气泡的形成。
   4. 用蒸馏水清洗50μl 滴定注射器三次, 方法是将针尖放入水中, 然后慢慢将水放入注射器中, 然后将水分配到废物容器中。
   5. 用衬底溶液冲洗三次, 去除残留的水。
   6. 用底物溶液填充滴定注射器, 直到注射器满, 没有任何气泡。
   7. 由于注射器仍在基板溶液中, 请取出柱塞, 并允许大约2μl 的空气进入注射器顶部, 然后重新插入柱塞。
   8. 取下国贸中心的布袋手柄, 将注射器放在布袋手柄内, 然后拧紧至。
   9. 用无绒毛组织擦拭搅拌器的尖端, 然后小心地将布瑞特手柄放入 ITC 仪器并将其锁定到位。

3. 设置 ITCrun

1. 在计算机上, 打开Itcrun , 然后单击 "设置"。
2. 单击"搅拌速率" , 并将其设置为 350 rpm。检查注射器的大小 (μL), 并确保它是在50μl。
3. 设置温度, 然后按更新。建议在筹备国贸中心之前至少1小时执行这一步骤。这样, 仪器就有足够的时间根据需要加热或冷却。
4. 对于实验设置, 请选择增量滴定。
5. 单击"插入" 设置注射。将注射间隔调整为 5400秒, 注射体积 (μL) 调整为 4, 注射次数调整为4。按"确定"确认设置。
6. 在"均衡" 框中, 选择 "自动平衡"和"大预期加热"。(如果预期的加热是小的, 你可以选择小在预期的热; 但是, 这将增加平衡时间。
7. 将初始基线设置为300秒。
8. 要开始运行, 请单击"搅拌速率" 旁边的"开始" 符号, 然后单击位于扳手符号旁边的"开始" 。
9. 保存文件并允许仪器运行。

4. 分析数据

1. 在纳米分析中打开该文件。单击 "数据" , 然后选择"数据列"。
2. 选择所有数据, 复制数据, 然后将其粘贴到 Microsoft Excel 中。
3. 通过在300s 时添加所需的值使其为零, 调整零基线。将此校正应用于热率值的整个列。
4. 通过使用公式: = MIN (cell: cell) 或 MAX (细胞: 细胞), 找出每次注射的热率的最小值或最大值。每个数据点代表每个注射酶的峰值酶活性。
5. 针对滴定过程中值发生的时间绘制 min 或 MAX 值的绘图。

结果

图 1和图 5显示了两种酶 (乳糖酶和转化酶) 的数据。乳糖酶和转化酶催化将二糖水解成两个单糖, 分别在内膜和放热中水解。这两种酶反应都是在浓度下运行的, 从而阻止了酶的饱和度。

乳糖酶数据显示了如何利用 ITC 数据来估计酶的稳定性。四次连续注射600mm 乳糖 (图 1), 滴定成 20 mg/mL 乳糖酶。每次注射之间?...

讨论

此处描述的 ITC 酶稳定性分析的一个主要优点是自动化。一旦所有适当的缓冲液和解决方案都得到了, 每次检测的设置时间约为15分钟。相反, 传统的转化酶和乳糖酶活性检测需要约 2小时, 而进行检测的人持续参与, 许多酶活性检测需要大量的人小时。在以前的一份出版物中, 我们演示了 ITC 方法的数据与更传统的转化酶^{活性方法相比}如何。

ITC 检测的另一个优?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)