İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar

Özet

Enzim aktivitesinin termal kararlılık kolayca izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından ölçülür. Çoğu protein istikrar deneyleri şu anda ölçü protein unfolding kullanılan ancak enzimatik etkinliği hakkında bilgi sağlamaz. ITC enzim değişiklikleri istikrarı üzerinde enzim aktivitesinin etkisini doğrudan tayini sağlar.

Özet

Bu eser izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) enzim aktivitesi kararlılığını ölçmek için yeni bir yöntem gösterir. Substrat çözeltisi tek bir enjeksiyon bir enzim çözüm içine enzim aktivitesi ile ilişkili sonra gözlenen en yüksek ısı hızı. Belgili tanımlık substrate zaman içinde birden çok enjeksiyonları aynı enzim çözüm içine kayıp enzim aktivitesinin göster. Tahlil gerektiren çok az personel zaman, özerk ve çoğu medya ve enzimler için geçerlidir.

Giriş

Proteinler organik reaksiyonlar geniş bir dizi katalizlerler yetenekli enzimlerdir. Çoğu enzim işlevinde yakınındaki nötr pH böylece sert çözücüler kullanımı kaçınarak sulu çözüm. Onların yüksek seçicilik nedeniyle daha az katalize enzim reaksiyonlar üretmek (bazı durumlarda hiçbir yan) yan asitler ve bazlar¹gibi non-selektif katalizörler daha. Bu tüm kimyasal reaksiyonlar nihai ürün insan tüketimi için güvenli bu yüzden burada yapılması gereken gıda üretiminde özellikle önemlidir. Şu anda, enzimleri yüksek fruktoz mısır şurubu², peynir³, bira⁴, laktozsuz süt⁵ve diğer önemli gıda ürünleri üretmek için kullanılır. Enzim kullanımı gıda sektöründe bu kağıt odaklanır iken enzimleri yeşil kimya ve ilaç sentezi de dahil olmak üzere çok çeşitli amaçlarla.

Belgili tanımlık yarar enzimlerin enzim üç boyutlu yapısını korumak üzerinde bağlıdır enzim aktivitesinin istikrar ile sınırlıdır. Enzim yapısı PEGylation⁶, immobilizasyon sağlam destek⁷, genetik değişiklikler⁸ve formülasyonları gibi değişiklikleri tarafından stabilize. Şu anda, enzim istikrar genellikle diferansiyel tarama Kalorimetre (DSC) tarafından ölçülür ve bitiş noktası enzim etkinliği⁹deneyleri. DSC hangi bir enzim izlerken sıcaklık ölçer; yüksek sıcaklık, daha istikrarlı bir yapı. Ancak, aktivite kaybı kez enzim veya etki alanları enzim¹⁰içinde açılmak için gerekenden daha düşük bir sıcaklıkta oluşur. Bu nedenle, DSC bir enzim değişiklik enzim aktivitesinin istikrar artıp artmadığını belirlemek için yeterli değildir. Bitiş noktası enzim deneyleri genellikle yoğun zaman, birden fazla örnekleri gerektirir ve genellikle son derece renkli veya opak çözümleri veya kullanılamaz hale için geçerli değildir eşleşmiş bir kolorimetrik reaksiyon içerir.

Bu eser bir enzim aktivitesi kararlılığını doğrudan ölçme izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) gösterir. ITC serbest veya bir tepki boyunca absorbe ısı hızını ölçer. Neredeyse tüm reaksiyonlar üretmek veya ısı emer, ITC eşleşmiş bir tepki veya oluşan reaksiyonlar süt gibi opak medya da dahil olmak üzere çoğu enzim katalize reaksiyonlar için kullanılabilir. ITC uzun yıllar çeşitli tepkiler için kimyasal kinetik parametreleri ölçmek için kullanılmıştır, ancak burada sunulan protokolü en yüksek ısı hızı enzim katalize reaksiyonların ölçmek için ITC kullanarak üzerinde odaklanır ve enzim aktivite doğrusal olduğunu gösterir en yüksek sıcaklık hızı ile ilişkili. En yüksek ısı hızını ITC ölçümleri çoğunlukla özerk ve kurulum ve analiz etmek için çok az personel zaman gerektirir.

Protokol

1. hazırlanması örnekleri

1. 1000 mL 0.1 M sodyum asetat arabelleği pH 4.6
   1. 800 mL distile su bir 1000 mL mezun ölçek ölçmek.
   2. Susuz sodyum asetat 8.2 g tartmak ve kabı için ekleyin.
   3. Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin, bir heyecan çubuk ölçek kabı yerleştirin, heyecan plaka üzerinde açmak ve tamamen eriyene kadar karıştırın.
   4. Ne zaman susuz sodyum asetat tamamen çözülmüş, kalibre edilmiş pH metre ile pH çözüm ölçmek.
   5. Buna göre 1 M HCl veya NaOH istenen pH 4,6 elde etmek için ekleyin.
   6. Kadar toplam hacmi 1000 mL distile su ekleyin.
   7. Oda sıcaklığında kullanmak kadar saklamak.
2. Enzim çözüm
   1. Enzim mezun çözüm 15 ml 0.1 M sodyum asetat tampon pH 4,6 ilk ölçüm 8 mL tarafından 10-30 mg/mL aralığında silindir 10 mL hazırlayın.
   2. Arabellek çözüm 15 mL konik tüp enzim ile içine ekleyin ve enzim eriyene kadar şiddetle çalkalanır.
   3. Toplam hacim 10 mL olana daha fazla arabellek çözüm ekleyin.
   4. 4 ° C'de enzim çözüm kullanmak kadar saklamak.
3. Substrat çözeltisi
   1. 300-600 mM aralığında bir substrat çözeltisi hazırlamak için gram cinsinden istediğiniz toplama yapmak için gerekli substrat miktarı hesaplamak.
   2. Belgili tanımlık substrate tartmak ve 100 mL cam kabı yerleştirin
   3. 20 mL 25 mL mezun silindir kullanarak tampon çözeltisi ölçmek ve daha sonra cam kabı ekleyin.
   4. Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin ve bir manyetik heyecan çubuk ölçek kabı yerleştirin. Klimayı açabilir ve karıştırma hızı buna göre ayarlayın.
   5. Belgili tanımlık substrate eriyene kadar devam etmek için karıştırma izin verir.
   6. Substrat çözeltisi 50 mL konik tüp içine dökün ve kadar Toplam hacim 45 mL 0.1 M sodyum asetat tampon pH 4,6 ekleyin. Sallayarak karıştırın.
   7. Substrat çözeltisi, oda sıcaklığında kullanmak kadar saklamak.

2. deneme gerçekleştirme

1. ITC enstrüman hazırlanıyor
   1. Başvuru hücresi 350 µL distile su ile yüklü emin olun. Enzim örnek hücre yüklemeden önce örnek hücre temizledi doğrulayın.
   2. İletişim kuralı-dolgu yükleme şırınga 500 µL % 2 temizleme solüsyonu (Malzemeler tablo) ile Temizleme, dikkatle iğne örnek hücreye, hücreyi doldurmak ekleyip yavaş yavaş sıvı aynı Ģırınga kullanarak kaldırabilirsiniz. Sıvı kabı atın. Bu % 2 temizleme solüsyonu (Malzemeler tablo) ile iki kez üç kez % 70 etanol ile adımları yineleyin ve sonra on kere distile su ile yıkayın.
   3. Enzim çözüm 450 µL ile yükleme şırıngaya doldur, dikkatle sonuna kadar örnek hücrenin altına iğne yerleştirin ve yavaş yavaş hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için pompayı 100 µL satır aşağı tuşuna basın.
   4. İğne ucu suya koyarak sonra yavaş yavaş şırınga suya alarak sonra atık konteyner içine su dağıtımı tarafından üç kez 50 µL titrasyon şırınga distile su ile yıkayın.
   5. Artık su substrat çözeltisi ile üç kez durulama tarafından kaldırın.
   6. Titrasyon şırınga yukarıya-e kadar belgili tanımlık tenkıye herhangi bir hava kabarcığı tam çözüm çizerek substrat çözeltisi ile doldurun.
   7. Hala substrat çözeltisi içinde şırınga pistonu çıkarın ve yaklaşık 2 µL hava şırınga girin ve pistonu eski mevkiini geri vermek için izin.
   8. ITC buret kolu Kaldır, içinde buret tanıtıcı şırınga yerleştirin ve sıkı kadar canı cehenneme.
   9. Bir hav bırakmayan dokusu ile karıştırıcı ucu silin sonra dikkatlice buret kolu ITC araç yerleştirin ve yerine kilitlemek.

3. ITCrun ayarlama

1. Bilgisayarda ITCrun açın ve ayarla' yı tıklatın.
2. Oranı karıştırma tıklatın ve 350 RPM için ayarlayın. Şırınga büyüklüğü (µL) denetleyin ve 50 µL olduğundan emin olun.
3. Sıcaklığı ayarlamak ve Updatetuşuna basın. Bu adım gerçekleştirilmesi önerilir ITC hazırlamadan önce en az 1 h. Bu kadar ısı veya gerektiği gibi soğuması araç için yeterli zaman sağlar.
4. Deneme kurulumu için artımlı titrasyon seçin.
5. Enjeksiyonlar kurulum için Ekle ' yi tıklatın. 5.400 için enjeksiyon aralığını ayarlama s, enjeksiyon hacmi (µL) 4 ve 4 iğne sayısı. Ayarlarını onaylamak için Tamam tuşuna basın.
6. Denge kutusu, Otomatik equilibrate ve büyük ısıtır beklenenseçin. (Beklenen ısıtır küçük, bir küçük altında beklenen ısıtır seçebilirsiniz; ancak, bu denge süreyi uzatmış olursunuz.)
7. 300'e ilk temel küme s.
8. Çalışma, tıklayın başlatmak için Başlat karıştırma oranı yanındaki simge ve yanında İngiliz anahtarı simgesi bulunan Başlat ' ı tıklatın.
9. Dosyayı kaydedin ve aracı çalıştırmak izin verir.

4. verilerin analizi

1. Açık belgili tanımlık eğe içinde NanoAnalyze. Veri ' ı tıklatın ve veri sütunlarıseçin.
2. Tüm verileri seçin, kopyalayın ve sonra verileri Microsoft Excel'e yapıştırabilirsiniz.
3. 300 gerekli değeri ekleyerek sıfır temel ayarlamak yapmak için s sıfır. Bu düzeltme ısı oranı değerleri sütunun tamamına uygulanır.
4. Denklemi kullanarak her enjeksiyon için ısı oranı en küçük veya en büyük değeri bulmak: =MIN(cell:cell) veya MAX(cell:cell). Her veri noktası en yüksek enzimatik aktivite her enjeksiyon adlı enzim temsil eder.
5. Değeri titrasyon sırasında oluştuğu zamana karşı MIN veya MAX değerleri grafikleri çizmek.

Sonuçlar

Şekil 1 ve şekil 5 temsilcisi sonuçlarında iki enzimler, laktaz ve invertase gelen verileri göstermek. Laktaz ve invertase bir disaccharide hidroliz iki bol katalizler endothermically ve exothermically, anılan sıraya göre. Her iki enzimatik reaksiyonları doygunluk enzim durdurulmasını emretti konsantrasyonları işletilmiştir.

Laktaz veri ITC verileri enzim istikrar tahmin etmek için nasıl kullanılabileceğini gösterme...

Tartışmalar

Burada açıklanan ITC enzim istikrar tahlil önemli bir avantajı otomasyon sistemidir. Tüm uygun arabellek ve çözümleri yapıldıktan sonra her tahlil için hazırlık süresi yaklaşık 15dk için tahlil yapan biri var. Buna ek olarak, geleneksel deneyleri invertase ve laktaz aktivitesi için tahlil yapan kişinin sürekli katılımı ile yaklaşık 2 h gerektirir ve birçok enzimatik aktivite deneyleri miktardan çok daha fazla adam-saat değerlerini alır. Bir önceki yayında veri ITC yönteminden daha geleneks...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)