Misura di stabilità enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione

Riepilogo

La stabilità termica dell'attività enzimatica è prontamente misurata tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). La maggior parte delle analisi di stabilità di proteina attualmente utilizzato misura proteina sta svolgendo, ma non forniscono informazioni sull'attività enzimatica. ITC consente la determinazione diretta dell'effetto di modifiche di enzima sulla stabilità dell'attività enzimatica.

Abstract

Questo lavoro dimostra un nuovo metodo per misurare la stabilità dell'attività enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione (ITC). Il tasso di calore picco osservato dopo una singola iniezione di soluzione substrato in una soluzione di enzima è correlata con l'attività dell'enzima. Iniezioni multiple del substrato nella stessa soluzione enzima nel tempo mostrano la perdita di attività enzimatica. Il metodo è autonomo, che richiede pochissimo tempo personale ed è applicabile alla maggior parte dei media e degli enzimi.

Introduzione

Gli enzimi sono proteine in grado di catalizzare una vasta gamma di reazioni organiche. La maggior parte funzione di enzimi in soluzione acquosa al vicino a pH neutro, evitando l'uso di solventi aggressivi. A causa della loro elevata selettività, enzima catalizzata reazioni producono meno (in alcuni non casi nessun sottoprodotti) sottoprodotti rispetto catalizzatori non selettivi come acidi e basi¹. Questo è particolarmente rilevante nella produzione di cibo dove tutte le reazioni chimiche devono essere fatto così il prodotto finale è sicuro per il consumo umano. Attualmente, gli enzimi sono usati per produrre alta fruttosio sciroppo di mais², formaggio³, birra⁴, privo di lattosio latte⁵e altri prodotti alimentari importanti. Mentre questa carta si concentra sull'uso degli enzimi nell'industria alimentare, ci sono molti altri usi per enzimi compreso nella sintesi chimica e droga verde.

L'utilità degli enzimi è limitata dalla stabilità dell'attività enzimatica, che dipende dal mantenimento della struttura tridimensionale dell'enzima. La struttura dell'enzima può essere stabilizzata tramite modifiche come PEGilazione⁶, immobilizzazione su un supporto solido⁷, modificazioni genetiche⁸e formulazioni. Attualmente, stabilità enzimatica è in genere misurata di calorimetria differenziale a scansione (DSC), e l'attività enzimatica endpoint saggi⁹. DSC misura la temperatura alla quale si dispiega un enzima; la temperatura è elevata, più stabile la struttura. Tuttavia, la perdita di attività si verifica spesso ad una temperatura inferiore rispetto a richiesta per spiegare l'enzima o domini all'interno degli enzimi¹⁰. Di conseguenza, DSC non è sufficiente per determinare se una modifica di enzima aumenta la stabilità dell'attività enzimatica. Analisi dell'enzima endpoint sono solitamente tempo intensivo, richiedono campioni multipli e spesso comportano una reazione colorimetrica accoppiata che non è applicabile a soluzioni altamente colorati o opachi o sospensioni.

Questo lavoro viene illustrato un metodo per la misura diretta della stabilità dell'attività dell'enzima tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). ITC misura il tasso di calore rilasciato o assorbito nel corso di una reazione. Poiché quasi tutte le reazioni producono o assorbono calore, ITC può essere utilizzato per la maggior parte delle reazioni enzima-catalizzate, compreso le reazioni che non hanno una reazione accoppiata o verificarsi in mezzi opachi come il latte. ITC è stato utilizzato per molte decadi per misurare i parametri di cinetici chimici per molti tipi di reazioni, ma il protocollo qui presentato si concentra sull'utilizzo di ITC per misurare la velocità di picco di calore di reazioni enzima-catalizzate e dimostra che l'attività dell'enzima è linearmente correlato con il tasso di calore di picco. ITC misurazioni di velocità di picco di calore sono per lo più autonome e richiedono pochissimo tempo personale di installazione e analizzare.

Protocollo

1. preparazione dei campioni

1. 1.000 mL di tampone di acetato di sodio 0.1 M a pH 4,6
   1. Misurare da 800 mL di acqua distillata in un becher graduato da 1.000 mL.
   2. Pesare 8,2 g di acetato di sodio anidro e aggiungerlo al bicchiere.
   3. Porre il becher su un piatto di mescolare, inserire un bastoncino per mescolare nel bicchiere graduato, accendere la piastra di mescolare e mescolare fino a completa dissoluzione.
   4. Quando l'acetato di sodio anidro è completamente sciolto, misurare il pH della soluzione con un pHmetro calibrato.
   5. Aggiungere 1 M HCl o NaOH di conseguenza per ottenere il desiderato pH 4.6.
   6. Aggiungere acqua distillata fino a quando il volume totale è di 1.000 mL.
   7. Conservare a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
2. Soluzione enzimatica
   1. Preparare 10 mL di enzima soluzione all'interno della gamma di 10-30 mg/mL di prima misura 8 mL del 0.1 M sodio acetato tampone pH 4.6 in un 15ml laureato cilindro.
   2. Aggiungere la soluzione tampone in una provetta conica da 15 mL con enzima ed agitare vigorosamente fino a sciolta l'enzima.
   3. Aggiungere soluzione tampone più fino a quando il volume totale è di 10 mL.
   4. Conservare la soluzione di enzima a 4 ° C fino all'utilizzo.
3. Soluzione di substrato
   1. Per preparare una soluzione di substrato all'interno della gamma di 300-600 mM, calcolare la quantità di substrato necessario in grammi per rendere la concentrazione desiderata.
   2. Pesare il substrato e inserire in un becher di vetro da 100 mL
   3. Misurare 20 mL della soluzione tampone utilizzando un cilindro graduato da 25 mL e quindi aggiungere il bicchiere di vetro.
   4. Porre il becher su un piatto di mescolare e mettere un bastoncino per mescolare magnetico nel becher. Accendere il fuoco e regolare di conseguenza la velocità dell'agitatore.
   5. Consentire mescolando per continuare fino a quando il substrato ha dissolto.
   6. Versare la soluzione di substrato in una provetta conica da 50 mL e aggiungere tampone 0,1 M a pH 4.6 sodio acetato fino a quando il volume totale è di 45 mL. Mescolare agitando.
   7. Conservare la soluzione di substrato a temperatura ambiente fino all'utilizzo.

2. esecuzione dell'esperimento

1. Preparazione dello strumento ITC
   1. Assicurarsi che la cella di riferimento viene caricata con 350 µ l di acqua distillata. Prima di caricare l'enzima nella cella del campione, verificare che la cella del campione è stata pulita.
   2. Protocollo-riempire la siringa di caricamento con 500 µ l di soluzione di pulizia di 2% (Tabella materiali) di pulizia, inserire delicatamente l'ago nella cella del campione, riempire la cella e rimuovere lentamente il liquido utilizzando la stessa siringa. Eliminare il liquido in un becher. Ripetere questo passaggio due volte con 2% (Tabella materiali), soluzione di pulizia tre volte con etanolo al 70% e poi lavare dieci volte con acqua distillata.
   3. Riempire la siringa di caricamento con 450 µ l di soluzione degli enzimi, con attenzione inserire l'ago fino al fondo della cella campione e premere lo stantuffo verso il basso per la linea 100 µ l lentamente per evitare la formazione di bolle d'aria.
   4. Lavare la siringa di titolazione di 50 µ l con acqua distillata tre volte, inserire la punta dell'ago in acqua poi lentamente riprendendo l'acqua nella siringa, poi erogare l'acqua in un contenitore per rifiuti.
   5. Rimuovere residui di acqua di risciacquo con soluzione substrato tre volte.
   6. Riempire la siringa di titolazione con soluzione di substrato disegnando la soluzione fino a quando la siringa è completa senza bolle d'aria.
   7. Con la siringa ancora nella soluzione di substrato, togliere lo stantuffo e consentire circa 2 µ l di aria per inserire la parte superiore della siringa e reinserire lo stantuffo.
   8. Rimuovere la maniglia buret dell'ITC, posizionare la siringa all'interno del manico buret e avvitare fino al stretto.
   9. Pulire la punta dell'agitatore con un panno privo di lanugine, quindi posizionare la maniglia buret nello strumento ITC e bloccarlo in posizione.

3. configurazione di ITCrun

1. Sul computer, aprire ITCrun e fare clic su impostare.
2. Fare clic su mescolando tasso e impostare a 350 RPM. Verificare la dimensione della siringa (µ l) e assicurarsi che sia a 50 µ l.
3. Impostare la temperatura e premere Update. È consigliabile che questo passaggio venga eseguito almeno 1 h prima di preparare l'ITC. Questo consente un tempo sufficiente per lo strumento riscaldare o raffreddare come necessario.
4. Per la struttura dell'esperimento, selezionare titolazione incrementale.
5. Fare clic su Inserisci per le iniezioni di installazione. Regolare l'intervallo di iniezione a 5.400 s, volume di iniezione (µ l) per 4 e il numero di iniezioni a 4. Premere OK per confermare le impostazioni.
6. Nella casella di equilibrazione, selezionare Auto-equilibrare e grande previsto si riscalda. (Se previste manche sono piccole, uno può selezionare piccole sotto previsto riscalda; tuttavia, questo aumenterà il tempo di equilibramento.)
7. Impostare la previsione iniziale di 300 s.
8. Per iniziare l'esecuzione, clicca l' avviare simbolo accanto al tasso di agitazione e quindi fare clic su Start che si trova accanto al simbolo di chiave.
9. Salvare il file e consentire di eseguire lo strumento.

4. analisi dei dati

1. Aprire il file in NanoAnalyze. Fare clic su dati e selezionare le colonne di dati.
2. Selezionare tutti i dati, copiare e quindi incollare i dati in Microsoft Excel.
3. Regolare zero base aggiungendo il valore richiesto a 300 s per renderlo zero. Applicare questa correzione per l'intera colonna di valori del tasso di calore.
4. Individuare il valore minimo o massimo del tasso di calore per ogni iniezione utilizzando l'equazione: =MIN(cell:cell) o MAX(cell:cell). Ogni punto di dati rappresenta il picco di attività enzimatica dell'enzima ad ogni iniezione.
5. Tracciare grafici dei valori di MIN o MAX contro il tempo in cui il valore si è verificato durante la titolazione.

Risultati

I risultati rappresentativi nella Figura 1 e Figura 5 Visualizza dati da due enzimi, lattasi e invertasi. Lattasi e invertasi catalizzare l'idrolisi di un disaccaride in due monosaccaridi, endothermically ed esotermico, rispettivamente. Entrambe le reazioni enzimatiche sono state eseguite alle concentrazioni che ha precluso la saturazione dell'enzima.

I dati di lattasi dimostrano come ITC dati possono essere utilizzati per stimare la ...

Discussione

Dei principali vantaggi dell'analisi di stabilità dell'enzima ITC descritto qui è l'automazione. Una volta che tutti i buffer appropriato e le soluzioni sono fatte, il tempo di set-up per ogni dosaggio è circa 15 min per la persona che fa il test. Al contrario, i dosaggi convenzionali per attività invertasi e lattasi richiedono circa 2 h con continuo coinvolgimento della persona facendo il test e molti saggi di attività enzimatica prendere considerevolmente più ore per persona. In una pubblicazione precedente, abbi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)