Mesurer la stabilité enzymatique par calorimétrie isotherme de Titration

Résumé

La stabilité thermique de l’activité enzymatique est facilement mesurable par calorimétrie isotherme titration (ITC). Des essais de stabilité protéique plus actuellement utilisé mesure protéine déplier, mais ne fournissent pas d’informations sur l’activité enzymatique. ITC permet la détermination directe de l’effet des modifications des enzymes sur la stabilité de l’activité enzymatique.

Résumé

Ce travail démontre une nouvelle méthode pour mesurer la stabilité de l’activité enzymatique par calorimétrie isotherme titration (ITC). Le taux de chaleur maximale observé après qu’une seule injection de la solution de substrat dans une solution d’enzyme est corrélée avec l’activité enzymatique. Des injections multiples du substrat dans la même solution d’enzyme au fil du temps montrent la perte de l’activité enzymatique. Le dosage est autonome, nécessitant très peu de temps du personnel et s’applique à la plupart des médias et des enzymes.

Introduction

Les enzymes sont des protéines capables de catalyser un large éventail de réactions organiques. La plupart fonction d’enzymes en solution aqueuse à pH neutre évitant ainsi l’utilisation de solvants agressifs. En raison de leur haute sélectivité, réactions enzymatiques catalysée produisent moins (dans certains ne cas, aucun sous-produits) sous-produits que catalyseurs non sélectifs tels que les acides et les bases¹. Ceci est particulièrement important dans la fabrication d’aliments où toutes les réactions chimiques doivent se faire si le produit final est plus sûr pour la consommation humaine. Actuellement, les enzymes sont utilisés pour produire de sirop de maïs riche en fructose², fromage³,⁴de la bière, lait sans lactose⁵et autres produits alimentaires importants. Bien que cet article se concentre sur l’utilisation des enzymes dans l’industrie alimentaire, il y a beaucoup d’autres utilisations pour les enzymes notamment dans la synthèse verte de chimie et de la drogue.

L’utilité des enzymes est limitée par la stabilité de l’activité enzymatique, qui repose sur le maintien de la structure tridimensionnelle de l’enzyme. La structure de l’enzyme peut être stabilisée par des modifications telles que PEGylation⁶, immobilisation sur un support solide⁷, modifications génétiques⁸et formulations. Actuellement, stabilité de l’enzyme est généralement mesurée par analyse calorimétrique différentielle (DSC) et des analyses de l’activité enzymatique point de terminaison⁹. DSC à mesurer la température à laquelle une enzyme se déploie ; plus la température est élevée, les plus stable de la structure. Toutefois, la perte d’activité se produit souvent à une température plus basse que celle nécessaire pour déplier l’enzyme ou les domaines au sein de l' enzyme¹⁰. Par conséquent, DSC ne suffit pas à déterminer si une modification de l’enzyme augmente la stabilité de l’activité enzymatique. Essais enzymatiques de point de terminaison sont généralement temps intensif, nécessitent plusieurs échantillons et impliquent souvent une réaction colorimétrique couplée qui n’est pas applicable aux solutions très colorées ou opaques ou de suspensions.

Ce travail démontre une méthode de mesure directe de la stabilité de l’activité enzymatique par calorimétrie isotherme titration (ITC). ITC mesure le taux de chaleur libérée ou absorbée au cours d’une réaction. Étant donné que presque toutes les réactions produisent ou absorbent la chaleur, ITC peut être utilisé pour la plupart des réactions catalysées par les enzymes, incluant des réactions qui ne pas avoir une réaction de couplage ou se produisent dans les milieux opaques tels que le lait. ITC a été utilisé pendant de nombreuses décennies pour mesurer des paramètres cinétiques chimiques pour de nombreux types de réactions, mais le protocole présenté ici se concentre sur l’utilisation de ITC pour mesurer le débit de chaleur du pic des réactions catalysées par les enzymes et démontre que l’activité enzymatique est linéairement en corrélation avec le débit de chaleur maximal. ITC mesures de taux de pic de chaleur sont le plus souvent autonomes et nécessitent très peu de temps personnel pour configurer et analyser.

Protocole

1. préparation des échantillons

1. 1 000 mL de tampon d’acétate de sodium 0,1 M à pH 4,6
   1. Mesurer 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL gradué.
   2. Environ 8,2 g d’acétate de sodium anhydre et ajoutez-le dans le bécher.
   3. Placer le bécher sur une plaque de remuer, placer une tige de mélanger dans le bol, tournez sur la plaque de remuer et remuer jusqu'à dissolution complète.
   4. Lorsque l’acétate de sodium anhydre est complètement dissous, mesurer le pH de la solution avec un pH-mètre calibré.
   5. Ajouter 1 M HCl ou NaOH en conséquence pour obtenir le pH désiré 4.6.
   6. Ajouter l’eau distillée jusqu'à ce que le volume total est de 1 000 mL.
   7. Conserver à température ambiante avant utilisation.
2. Solution d’enzyme
   1. Préparer 10 mL de la bouteille de solution dans la fourchette de 10 à 30 mg/mL de première mesure 8 mL de le 0,1 M acétate de sodium tampon pH 4,6 dans un 15 mL graduée enzyme.
   2. Ajouter la solution tampon dans un tube conique de 15 mL avec de l’enzyme et agiter vigoureusement jusqu'à ce que l’enzyme soit dissout.
   3. Ajouter plus de solution tampon jusqu'à ce que le volume total est de 10 mL.
   4. Conserver la solution d’enzyme à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
3. Solution de substrat
   1. Pour préparer une solution de substrat dans la fourchette de 300 à 600 mM, calculer la quantité de substrat nécessaire en grammes pour rendre la concentration désirée.
   2. Peser le substrat et les placer dans un bécher de verre de 100 mL
   3. 20 ml de la solution tampon à l’aide d’un cylindre jaugée de 25 mL et puis ajoutez-le à la carafe en verre.
   4. Placer le bécher sur une plaque de remuer et placer une tige d’agitation magnétique dans le bécher. Sur la chaleur et régler la vitesse d’agitation en conséquence.
   5. Laisser en remuant pour continuer jusqu'à ce que le substrat soit dissout.
   6. Verser la solution de substrat dans un tube conique de 50 mL et ajouter 0,1 M de sodium acétate tampon pH 4,6, jusqu'à ce que le volume total est de 45 mL. Mélanger en agitant.
   7. Stocker la solution de substrat à la température ambiante jusqu'à utilisation.

2. effectuer l’expérience

1. Préparation de l’instrument de l’ITC
   1. Veiller à ce que la cellule de référence est chargée avec 350 µL d’eau distillée. Avant de charger l’enzyme dans la cellule, vérifier que la cellule a été nettoyée.
   2. Nettoyage de protocole-remplir la seringue de chargement avec 500 µL de solution de nettoyage de 2 % (Table des matières), insérer l’aiguille dans la cellule, remplir la cellule et retirer lentement le liquide à l’aide de la même seringue. Jeter le liquide dans un bécher. Répétez cette étape deux fois avec la solution de nettoyage de 2 % (Table des matières), trois fois avec l’éthanol à 70 % et laver ensuite dix fois avec de l’eau distillée.
   3. Remplir la seringue de chargement de 450 µL de solution d’enzyme, soigneusement insérer l’aiguille tout le chemin vers le bas de la cellule et appuyez sur le piston jusqu'à la ligne de 100 µL lentement pour éviter la formation de bulles d’air.
   4. Laver la seringue de titrage de 50 µL d’eau distillée trois fois en plaçant la pointe de l’aiguille dans l’eau puis lentement prenant l’eau dans la seringue, puis distribution de l’eau dans un conteneur à déchets.
   5. Enlever l’eau résiduelle en rinçant avec une solution de substrat trois fois.
   6. Remplir la seringue de titrage de la solution de substrat en dessinant la solution jusqu'à ce que la seringue est pleine sans bulles d’air.
   7. Avec la seringue encore dans la solution de substrat, retirer le piston et laisser environ 2 µL de l’air d’entrer dans la partie supérieure de la seringue et réinsérez le piston.
   8. Retirer la poignée de buret du CTI, placez la seringue à l’intérieur de la poignée de buret et visser jusqu’au serrage.
   9. Essuyez l’embout de l’agitateur avec un tissu non pelucheux, puis, avec précaution, placez la poignée de buret dans l’instrument de l’ITC et verrouiller en place.

3. mise en place ITCrun

1. Sur l’ordinateur, ouvrez ITCrun et cliquez sur configurer.
2. Cliquez sur en remuant le taux et la valeur 350 tr/min. Vérifiez la taille de la seringue (µL) et que c’est à 50 µL.
3. Régler la température, puis appuyez sur mise à jour. Il est recommandé d’effectuer cette étape au moins 1 h avant de préparer l’ITC. Cela permet de suffisamment de temps pour l’instrument chauffer ou refroidir selon les besoins.
4. Pour le montage, sélectionnez titration progressive.
5. Cliquez sur insérer pour configurer les injections. Régler l’intervalle d’injection de 5 400 s, volume (µL) d’injection à 4 et le nombre d’injections à 4. Appuyez sur OK pour confirmer les paramètres.
6. Dans la boîte de l’équilibration, sélectionnez Auto-équilibrer , prévu de gros manches. (Si les chaleurs attendues sont faibles, on peut choisir petit sous les chaleurs attendues ; cependant, cela augmentera le temps d’équilibrage).
7. Définir la planification initiale de 300 s.
8. Démarre l’exécution, cliquez le démarrage symbole à côté du taux de brassage , puis cliquez sur Start qui se trouve à côté du symbole de clé.
9. Enregistrez le fichier et laissez l’instrument s’exécuter.

4. analyse des données

1. Ouvrez le fichier dans NanoAnalyze. Cliquez sur données , puis sélectionnez les colonnes de données.
2. Sélectionnez toutes les données, copiez et puis coller les données dans Microsoft Excel.
3. Régler le zéro ligne de base en ajoutant la valeur désirée à 300 s faire zéro. Appliquer cette correction à la colonne entière des valeurs de taux de chaleur.
4. Trouver la valeur minimale ou maximale du taux de chaleur pour chaque injection en utilisant l’équation : =MIN(cell:cell) ou MAX(cell:cell). Chaque point de données représente le pic de l’activité enzymatique de l’enzyme à chaque injection.
5. Tracer les graphiques des valeurs MIN ou MAX contre le temps auquel la valeur s’est produite lors de la titration.

Résultats

Les résultats représentatifs dans la Figure 1 et Figure 5 affichent des données de deux enzymes, la lactase et invertase. La lactase et invertase catalysent l’hydrolyse d’un disaccharide en deux monosaccharides, endothermique et exothermique, respectivement. Les deux réactions enzymatiques ont été exécutées à des concentrations qui empêchaient la saturation de l’enzyme.

Les données de la lactase démontrent comment le...

Discussion

Un avantage majeur de l’ITC stabilité enzymatique décrite ici est automation. Une fois que toutes les zones tampons appropriées et les solutions sont apportées, le temps d’installation pour chaque dosage est environ 15 min pour la personne qui effectue l’essai. En revanche, les tests classiques pour l’activité de l’invertase et la lactase nécessitent environ 2 h avec la participation continue de la personne qui effectue l’essai et de nombreux tests d’activité enzymatique prennent beaucoup plus d’he...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)