A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
هنا، نقدم بروتوكوللقياس المشاركة المستهدفة KDM1A في خلية بشرية أو حيوانية، أو أنسجة أو عينات دم عولجت بمثبطات KDM1A. يستخدم البروتوكول وضع علامات المسبار الكيميائي لإنزيم KDM1A المجاني والتحديد الكمي المباشر للمهنة المستهدفة باستخدام الاختبارات المناعية المستندة إلى العلاج الكيميائي ويمكن استخدامها في الدراسات ما قبل السريرية والسريرية.
وتقييم المشاركة المستهدفة، التي تعرف بأنها تفاعل دواء مع البروتين الذي صمم له، هو شرط أساسي لتفسير النشاط البيولوجي لأي مركب في تطوير المخدرات أو في مشاريع البحوث الأساسية. في علم الوراثة، يتم تقييم المشاركة المستهدفة في معظم الأحيان عن طريق تحليل علامات الوكيل بدلاً من قياس اتحاد المركب إلى الهدف. تتضمن التبيّات البيولوجية في المصب التي تم تحليلها تعديل علامة الهيستون أو تغييرات التعبير الجيني. KDM1A هو demethylase يسين الذي يزيل مجموعات الميثيل من H3K4 أحادية وثنائية الميثيل، وهو تعديل يرتبط بإسكات التعبير الجيني. تعديل علامات الوكيل يعتمد على نوع الخلية ووظيفة التركيبة الوراثية للخلايا التي تم التحقيق فيها، والتي يمكن أن تجعل التفسير والمقارنة بين الحالات صعبة للغاية. وللتحايل على هذه المشاكل، يتم تقديم بروتوكول متعدد الاستخدامات لتقييم آثار الجرعة وديناميات المشاركة المستهدفة المباشرة في KDM1A. الفحص الموصوف يجعل استخدام مسبار كيميائي KDM1A لالتقاط وقياس الإنزيم غير المثبط، ويمكن تطبيقه على نطاق واسع على الخلايا أو عينات الأنسجة دون الحاجة إلى التعديل الوراثي، لديه نافذة ممتازة للكشف، ويمكن استخدامها على حد سواء للبحوث الأساسية وتحليل العينات السريرية.
ليسين demethylase محددة 1 (KDM1A)1 هو demethylase تشارك في السيطرة على النسخ الجيني. وقد برز هذا البروتين كهدف الدوائية المرشح2 في علم الأورام; بما في ذلك سرطان الدم النقوي الحاد3 (AML), متلازمة خلل التنسج النقوي (MDS)4, التليف النقوي (MF)5,6, سرطان الرئة الخلية الصغيرة (SCLC)7; في مرض الخلايا المنجلية (SCD)8،9، وفي أمراض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، التصلب المتعدد (MS)؛ وفي العدوان10.
معظم المركبات المثبطة KDM1A في التنمية السريرية هي مشتقات السيكلوبروبيلان وتمنع البروتين عن طريق ربط covalent إلى الفلافين الدينوكليوتيد (FAD) عامل مساعد11. تثبيط KDM1A يحفز تغييرات التعبير الجيني، ولكن هذه التغييرات تختلف اختلافا كبيرا عبر الأنسجة، وأنواع الخلايا، أو حالات المرض. تثبيط KDM1A أيضا يغير علامات الهيستون12،ولكن يتم إنتاج هذه التغييرات عموما محليا في موقع معين في الجينوم، ومرة أخرى، والأنسجة العالية والخلية محددة.
وقد تم تطوير البروتوكول لقياس المشاركة المستهدفة KDM1A مباشرة في العينات البيولوجية، وقد تم تحسينه للاستخدام مع مثبطات سيكلوبروبيلامين المشتقة. ويستند هذا التقييم على تكنولوجيا ELISA ويحلل، في موازاة ذلك، توتال وفري (أي غير مقيدة بمثبط) KDM1A في استخراج البروتين الأصلي من عينة بيولوجية في اختبار مرحلة صلبة. وكخطوة أولى، يتم تحليل العينة البيولوجية في وجود البكيويند KDM1A الانتقائي ة العلاج الكيميائي OG-88113،14،المستمدة من مثبطات KDM1A الانتقائية ORY-1001 (iadademstat)، وهو مثبط قوي من KDM1A في السريرية تطوير لعلاج أمراض الأورام. يحتوي المسبار الكيميائي على50 IC لKDM1A من 120 nM ويشمل moiety ملزمة FAD مرتبطة بالبولي ايثيلين غليكول biotinylated (PEG) الذيل. يرتبط المسبار الكيميائي حصريًا بـ KDM1A المجاني، ولكن ليس بـ KDM1A المثبط في العينة. بعد ربط المسبار الكيميائي، يتم التقاط المجمعات التي تحتوي على KDM1A في العينة على لوحات ميكروتيدر مع سطح مطلي streptavidin لتحديد KDM1A مجانا، أو على لوحات مغلفة مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لKDM1A التقاط لتحديد مجموع KDM1A. بعد الغسيل، يتم احتضان كلا اللوحتين بجسم مضاد للكشف المضاد لـ KDM1A، وغسلهما مرة أخرى، واحتضنهما بجسم مضاد للأرنب مضاد للأرانب من نوع HRP-conju،( HRP-conju/ لكشفه باستخدام الركيزة المضيئة والقياس الكمي عن طريق قياس النسبية وحدات الضوء (RLU) في مقياسالإنارة (الشكل 1).
الشكل 1 مخطط إنزيم إليسا مرتبط بالفحص المناعي الكيموبي للمشاركة المستهدفة KDM1A: أ) تحديد إجمالي KDM1A باستخدام ساندويتش ELISA و B) تحديد KDM1A مجانا باستخدام العلاج الكيميائي ELISA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم تضمين منحنى قياسي في كل من لوحات ELISA للتحقق من خطية كل مستوى. ثم يتم حساب تحديد المشاركة المستهدفة KDM1A في كل عينة كقيمة نسبية للعينة قبل الجرعة أو السيارة المعالجة.
وتم الحصول على عينات من الدم من معهد البحوث الحيوية في سانت باو وفقا للتشريعات الإسبانية (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) وموافقة لجان الأخلاقيات المحلية. أُجريت دراسات مع الأنسجة الحيوانية وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (توجيه مجلس الجماعات الأوروبية 86/609/EEC) الذي أنشأته اللجنة الأخلاقية لتجارب الحيوانات في PRAAL-PCB.
1. إعداد العينات البيولوجية للفحص.
تحذير: ينطوي هذا البروتوكول على التلاعب بالعينات البيولوجية التي قد تخضع لمعيار مسببات الأمراض المنقولة بالدم التابع لإدارة السلامة والصحة المهنيتين (29 CFR 1910.1030)، والتوجيه 2000/54/EC الصادر عن البرلمان الأوروبي وللمحكمة الأوروبية بشأن المؤرخ 18 أيلول/سبتمبر 2000 أو ما يعادله من لوائح. وبالإضافة إلى ذلك، قد تحتوي العينات البيولوجية على آثار للمركبات الكيميائية التحقيقية النشطة بيولوجيا، وقد ينطوي البروتوكول على مزيد من التلاعب بهذه المركبات. مراجعة صحيفة بيانات السلامة (SDS) للمركبات المستخدمة قبل بدء التجربة والتقيد الصارم بجميع تدابير السلامة المعمول بها في مركز البحوث، بما في ذلك استخدام معدات الحماية الشخصية الكافية(PPE). ارتداء الملابس الواقية المناسبة واستخدام التدريع السليم خلال التجربة. التخلص من المخلفات في حاويات النفايات المناسبة (النفايات البيولوجية/السامة للخلايا).
ملاحظة: يبدأ هذا البروتوكول بخلايا أو عينات من الأشخاص الذين عولجوا بمثبطKDM1A وضوابطهم غير المعالجة أو المركبات/الغفل المعالجة 3.
2. إعداد الحلول
3. استخراج البروتين الأصلي
4. القياس الكمي للبروتين الأصلي باستخدام برادفورد &
5. ELISAs الإنارة لتحديد KDM1A الكلي والحر
ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة المختبر ثابتة عند 23-24 درجة مئوية (RT).
سلسلة قياسية | [ككم1ا] معياريّة عمل حل ([كدم1ل]) | |
(pg KDM1A/well) | PBS (μL) | |
2500 لC-* | 800 | - |
2500 | 800 | - |
1750 | 560 | 240 |
1250 | 400 | 400 |
750 | 240 | 560 |
250 | 80 | 720 |
25 | 8 | 792 |
صفر | صفر | 800 |
ملاحظه: | ||
(1) حجم أعدت من كل تخفيف يكفي لتشغيل في 3licate 2 لوحات من التصاق. | ||
(2) النطاق الموصى به هو بين 2.5 و 5000 pg / well | ||
* للسيطرة السلبية C-، دون KDM1A كشف الأجسام المضادة |
الجدول 1: إعداد المعايير. لإعداد السلسلة القياسية من البروتين KDM1A، ماصة الكميات المشار إليها من كدف1A القياسية حل العمل وPBS في ثمانية أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل المسمى بشكل صحيح.
الجدول 2: تصميم لوحة بئر عميق. المعايير (الأزرق) والعينات (الصفراء) من الخطوة 5.4.2. تم الأنابيب في المواقف المنعكسة من لوحة بئر عميقة لتسهيل التحميل في لوحات ELISA بعد اتجاه الأسهم الزرقاء (القياسية) والأصفر (عينات). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول 3: تصميم لوحة إليسا. وتشمل لوحة الاختبار المنحنى القياسي مع انخفاض كميات من الهدف KDM1A المؤتلف (باللون الأزرق)؛ العينات البيولوجية (S) باللون الأصفر؛ والضوابط السلبية المقابلة (تحتوي على عينات ولكن ليس الأجسام المضادة الكشف الأولية) باللون الأبيض، ليتم تحميلها على لوحات ELISA من لوحة بئر عميق. تحتوي الفارغة (0 في المنحنى القياسي) على كافة كواشف الالتقاط والكشف ولكن لا توجد عينة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
6 - حساب المشاركة المستهدفة
خطية التحديد الكلي والحر KDM1A.
تم إعداد سلسلة قياسية كما هو موضح في الخطوة 5.3.2.، وذلك باستخدام 0 إلى 2500 pg من إنزيم KDM1A المؤتلف البشري كامل الطول. تم تقييم قيم RLU من المجموع وRKDM1A الحرة للتحقق من الخطية (الشكل2A و 2B).
تم تطوير البروتوكول المعروض هنا لقياس المشاركة المستهدفة KDM1A مباشرة باستخدام رواية القبض على المسبار الكيميائي KDM1A مقرها ELISA. وقد تم التحقق من صحة هذه الطريقة على خطوط الخلايا البشرية المستزرعة وعينات الجسم الحي السابق من الإنسان والفئران والفأر والبابون (بما في ذلك PBMCs والرئة والدماغ وال...
المؤلف تمارا مايس هو المدير التنفيذي والمساهم، والمؤلفين كريستينا Mascaró وراكيل رويز رودريغيز هي موظفة في Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. تطور مثبطات KDM1A ويحمل براءات الاختراع التي تغطي المركبات والأساليب المستخدمة في هذه المادة.
تم تمويل هذه الدراسة من قبل أورزون جينوميكس. S.A., هوفمان لاروش, وبدعم جزئي من CIIP-20152001 وRETOS برنامج التعاون RTC-2015-3332-1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
Streptavidin | Promega | #Z704A | |
Syringe | BD | #303172 | |
Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved