מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד KDM1A מטרת האירוסין בתוך תא אנושי או בעלי חיים, רקמות או דגימות דם שטופלו עם KDM1A מעכבי. הפרוטוקול משתמש תיוג כימית של האנזים KDM1A חינם וקוונפיקציה ישירה של הכיבוש היעד באמצעות החיסונית מבוססי כימופי מבוסס והוא יכול לשמש במחקרים פרה-קליניים וקליניים.

Abstract

הערכה של מעורבות היעד, המוגדרת כאינטראקציה של תרופה עם החלבון שהוא תוכנן עבורו, היא דרישה בסיסית לפרשנות הפעילות הביולוגית של כל תרכובת בתחום הפיתוח של הסמים או בפרויקטי מחקר בסיסיים. ב אפיגנטיקה, היעד התחייבות מוערך לרוב על ידי ניתוח של סמנים proxy במקום מדידת האיחוד של המתחם ליעד. במורד הזרם הביולוגי שנותחו כוללים את אפנון סימן האבן או משתנה הביטוי הגנטי. KDM1A הוא ליזין דמטקלז המסיר קבוצות מתיל מH3K4 מונו ודימתיל, שינוי המשויך להשתקה הביטוי הגנטי. אפנון סמני ה-proxy תלויה בסוג התא ובפונקציה של האיפור הגנטי של התאים שנחקרו, אשר יכול להפוך פרשנות והשוואת מקרה הצלב די קשה. כדי לעקוף בעיות אלה, פרוטוקול רב-תכליתי מוצג כדי להעריך את השפעות המינון ואת הדינמיקה של התחייבות ישירה KDM1A היעד. התיקון תיאר עושה שימוש KDM1A chemoprobe כדי ללכוד ולכמת אנזים עצורים, ניתן להחיל באופן נרחב על תאים או דגימות רקמות ללא צורך שינוי גנטי, יש חלון מצוין של גילוי, והוא יכול לשמש הן עבור מחקר בסיסי וניתוח של דגימות קליניות.

Introduction

ליזין מסוים demethylase 1 (KDM1A)¹ הוא demethקלז מעורב בשליטה של תמלול גנים. חלבון זה התפתחה כיעד תרופתי מועמד² באונקולוגיה; כולל לוקמיה מיאלואידית חריפה³ (AML), מיאלודיספלסטית סינדרום (MDS)⁴, myelofibrosis (MF)^5,6, תא קטן סרטן ריאות (sclc)⁷; ב מחלת התאים המגל (scd)^8,9, ו ב מחלות מערכת העצבים המרכזית כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה (MS); ובתוקפנות¹⁰.

רוב התרכובות הKDM1A מעכבות בהתפתחות הקלינית הן נגזרות ציקלופרופילטין ומעכבים את החלבון באמצעות כריכה בעלת כריכת שינוי בעלת הפלאונטי (באופנה). עיכוב של KDM1A גורם ביטוי גנים שינויים, אבל שינויים אלה משתנים מאוד על פני רקמות, סוגי תאים, או מחלות מקרים. עיכוב של KDM1A גם משנה את הסימנים היסטון¹², אך שינויים אלה מיוצרים בדרך כלל באופן מקומי באתר מסוים בגנום, והם שוב, רקמות מאוד תאים ספציפיים.

הפרוטוקול פותח כדי למדוד באופן ישיר התחייבות KDM1A היעד בדגימות ביולוגיות והוא ממוטב לשימוש עם מעכבי נגזרות ציקלוקילאמין. הגישה מבוססת על טכנולוגיית אליסה ומנתחת, במקביל, סה כ חופשי (כלומר לא מאוגד על ידי מעכב) KDM1A בתמצית חלבון יליד ממדגם ביולוגי בתוך שיטת שלב מוצק. כצעד הראשון, המדגם הביולוגי הוא להיות לאחר הנוכחות של KDM1A ביולוגית כימית סלקטיבית OG-881^13,14, נגזר KDM1A מעכב סלקטיבי אורי-1001 (i, מעכב), חזק מעכבי של KDM1A במחקר קליני פיתוח לטיפול במחלות אונקולוגי. לKDM1A יש IC₅₀ של 120 nM וכולל moiety כריכת אופנה מקושר פוליאתילן ביולוגי גליקול (יתד)-זנב. הגלימה מקושרת בלעדית לKDM1A החופשי, אבל לא לKDM1A המדכא במדגם. לאחר הכריכה כימית, KDM1A המכיל מתחמי במדגם נלכדים על צלחות microtiter עם משטח מצופה streptavidin כדי לקבוע KDM1A חינם, או על צלחות מצופה עם נוגדן לכידת מונושבטיים נגד KDM1A כדי לקבוע את סך KDM1A. לאחר שטיפת, שתי הצלחות הן מודקות עם נוגדן זיהוי anti-KDM1A, שטף שוב, ו-מודעם עם משני HRP מצוח חמור נגד ארנב IgG נוגדן לאיתור באמצעות מצע וכימות זורח על ידי מדידת יחסי יחידות אור (RLU) בלומטר (איור 1).

איור 1. הסכמה של אליסה האנזים מקושר כימית מערכת מערכת לKDM1A יעד התחייבות: A) ההגדרה של סה כ KDM1A באמצעות סנדוויץ ' אליסה ו B) קביעת הKDM1A בחינם באמצעות כימול אליסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

עקומה סטנדרטית כלולה בשתי צלחות ה-אליסה כדי לאמת את היניאריות של כל אחד מהסטנדרטים. הקביעה של התחייבות KDM1A יעד בכל מדגם מחושבת לאחר מכן כערך יחסי לדגם טרום-מינון או טיפול בכלי רכב.

Protocol

דגימות הדם הושגו ממכון החקירה של ביודיקה סנט פאו ביאובנק על פי החקיקה הספרדית (האמת Decreto דה Biobancos 1716/2011) ואישור וועדות האתיקה המקומיות. מחקרים עם רקמות בעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים (הוראת מועצת הקהילות האירופית 86/609/eec) שהוקמה על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים ב פראאל-מעגלים מודפסים

1. הכנת דגימות ביולוגיות לצורך הדיגום.

התראה: פרוטוקול זה כרוך בטיפול בדגימות ביולוגיות שעשויות להיות נתונים לבטיחות תעסוקתית ומינהל בריאות (שיטוח ביולוגי) (29 cfr 1910.1030), הוראה 2000/54/EC של הפרלמנט האירופי וה מועצת 18 בספטמבר 2000 או תקנות שוות ערך. בנוסף, הדגימות הביולוגי עשויות להכיל שרידים של תרכובות כימיות פעילות ביולוגית והפרוטוקול עשוי לכלול מניפולציה נוספת של תרכובות כאלה. עיין בגיליון נתוני הבטיחות (SDS) של התרכובות המשמשות לפני תחילת הניסוי והתבונן בקפדנות בכל אמצעי הבטיחות הישימים שנקבעו במרכז המחקר, כולל שימוש בציוד הגנה אישי מספיק (PPE). לבשו בגדי הגנה נאותים והשתמשו במגן מתאים במהלך הניסוי. השמט שאריות ממיכלי הפסולת המתאימים (פסולת ביולוגית/ציטוטוקסיל).

הערה: פרוטוקול זה מתחיל עם תאים או דגימות של נושאים שטופלו עם מעכב KDM1A מטופל או הרכב/פלצבו שלהם שטופלו שליטה³.

1. תאים מטופלים עם רכב או KDM1A מעכבי בתוך מבחנה
   1. עבור התאים גדל בהשעיה, כמו 10 mL תרבויות, להעביר את ההשעיה לתוך נקי 15 מ"ל צינורות חרוטי ולהמשיך 1.1.3.
   2. עבור תאים חסיד (גדל ב 75 ס"מ² מבחנות), להסיר את המדיום מן הבקבוקון ולשטוף בקצרה באמצעות 4 מ"ל PBS. נתק את התאים מכלי הקיבול שלהם באמצעות 1.5 mL של 0.5% טריפסין-EDTA במהלך 2-5 דקות (תנאי טריסיזציה עשוי להשתנות, עקוב אחר המלצות הספק לקו התאים), להוסיף 4 מ"ל PBS ולהעביר את התאים לתוך נקי 15 מ"ל צינורות חרוטי.
   3. הכנס את הצינורות בצנטריפוגה העליון ספסל ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 400 x g ב 4 ° c. הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של ה-PBS באמצעות מיקרופיפטה והעבר את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
   4. הכנס את הדגימות בצנטריפוגה מיקרוצינורית וצנטריפוגה אותם במשך 5 דקות ב-400 x g ב -4 ° c. הסר את ה-PBS על ידי השאיפה עם מיקרופיפטה, או שמור את כדורי על הקרח והמשך לשלב 2; או להקפיא את כדורי על קרח יבש ולאחסן אותם ב-80 ° c עד שלב 3.
2. דגימות מנושאים או בעלי חיים שטופלו עם רכב/פלצבו או KDM1A מעכב
   1. רקמות: חותכים את הרקמה קטן, ≈ 1 ס מ³ חתיכות באמצעות אזמל. להקפיא את חתיכות הרקמות ב N₂ נוזלי במיכל dewar ולאחסן אותם ב-80 ° צ' עד שלב 3.
   2. פולימנליים תאי דם מונוליתיים (PBMCs): לדלל 10 מ ל של דם טרי (תהליך מקסימום 2 h לאחר נסיגת הדם) שנאסף K₂-edta צינורות עם 2 כרכים של PBS בצינור 50 mL חרוט. לבודד את PBMCs מן הדם באמצעות מסחרית שהתקבלו PBMC הפרדת צינורות לפי הוראות היצרן. לשמור על כדורי על הקרח ולהמשיך לשלב 3.2; או להקפיא את כדורי על קרח יבש ולאחסן אותם ב-80 ° c עד שלב 3.
      הערה: גלולה תא רטוב של 20 כדי 50 μL מכיל ≈ 1 x 10⁷ תאים, בהתאם לגודל התא. גלולה PBMC רטוב שהושג 10 מ ל של דם אנושי בריא יש נפח של ≈ 20 μL ו מכיל ≈ 1 x 10⁷ pbmcs. רקמות או כדורי תא ניתן לאחסן ב-80 º c במשך עד 6 חודשים.

2. הכנת התמיסה

1. להכין 2 μm OG-881 לעבוד פתרון: לקחת 10 μl להשתמש בודדת לשימוש של 20 מ"מ ב881 דיקה biotinylated הפתרון מניות של 4 ° c מתוך מקרר ארבע מעלות ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות. להכין את הפתרון 2 μm עובד על ידי דילול סדרתי של OG-881 מ יון ב-PBS, באמצעות מיקרופיפטה עם טיפים לסינון ושינוי הקצה בין שלבי הדילול השונים.
2. הכינו מעכבי הפרוטאז 10x: לפזר 1 טבליה ב 1 מ ל PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה.
3. הכן את הנפח הרצוי של מאגר לפירוק תאים בגודל 1x עם 25 nM-881 כותונת. עבור כל mL, לערבב 100 μL מסחרית השיגה 10x מאגר לפירוק תאים, 150 μL של 10x פרוטאז מעכבי, 12.5 μL של 2 μM OG-881, ו-737.5 μL של סוג 1 מים מזוקקים כפולים.
4. באופן אופציונלי להכין את הנפח הרצוי של מאגר לפירוק תא 1x אבל עם 25 ננומטר ORY-1001 במקום OG-881 כמו בשלב 2.3. מעכבי פחות חזקים ניתן להשתמש אך עשוי לדרוש ריכוזים גבוהים יותר, לשימוש בשליטה חיובית עם 100% עיכוב (ראה שלב 3.5).
   הערה: לנקוט צעדים מתאימים כדי למנוע כל זיהום לא מכוון של פתרונות או דגימות עם OG-881 או KDM1A פתרונות מלאי מעכב. כדי לחשב את הנפח הרצוי של מאגר לפירוק תא 1x עם 25 ננומטר OG-881, נניח כי 400 μL נדרש לכל 40 mg של רקמת מרוסק, או 200 μL לכל גלולה רטובה של 10⁷ תאים.

3. הפקת חלבון מקורי

1. מרקמות:
   1. לרסק ו המגון לתוך ≈ 1 ס מ³ קוביה של רקמה קפואה עם מרגמה ולתקוע מקורר על קרח יבש. מחלקים את הדגימות בבקבוקונים לשימוש יחיד המכיל ≈ 40 מ ג של אבקת רקמות, להימנע מלהפשיר בכל עת. . המשך לשלב 3.1.2 לעיבוד מיידי או לחנות ב-80 ° c.
   2. השהה מחדש 40 מ"ג של אבקת רקמות ב 400 μl של מאגר לוליזיס תא 1x עם 25 ננומטר OG-881, מערבולת עבור 10 s, ולאלץ את המדגם לפחות חמש פעמים באמצעות מחט בוטה בצבע מזרק 18 עד הליזה של הרקמה מושגת האור נחל דלוח צהוב הבולם הכתום הוא השיג. למנוע היווצרות בועה.
   3. המשך לשלב 3.3
2. מפלטות תא (PBMCs וקווי תא):
   1. להשעות מחדש את הגלולה של ≈ 1 x 10⁷ תאים ב-200 μl של מאגר פירוק תאים 1x המכיל 25 ננומטר OG-881. מערבולת הדגימות לזמן קצר ולשמור אותם על הקרח עבור 5 דקות.
   2. Sonicate דגימות בsonicator באמצעות 3 פולסים של 20 כל אחד ב 45 kHz; שים אותם על קרח. במשך 20 שבין פולסים
      הערה: ברגע שהדגימות הביולוגי הושעו מחדש במאגר הפירוק של תא 1x, שמור אותם על הקרח במשך כל התהליך.
3. לשמור את הדגימות על הקרח עבור 5 דקות נוספות, מערבולת בקצרה, צנטריפוגה את הדגימות עבור 10 דקות ב 14 000 x g בצנטריפוגה טרום מקורר ב 4 ° c.
4. באמצעות מיקרופיפטה 1 mL, להעביר את הסופרנטנים לתוך טריים 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות ולהשאיר אותם על הקרח במהלך 2 h.. המשך לשלב 4
5. באופן אופציונלי, שליטה חיובית להדמיית 100% התחייבות היעד עשויה להיות מוכנה כדלקמן:
   1. להשעות מחדש את הגלולה תא או אבקת רקמה מתוך רכב או מטופל (מינון מראש) באמצעי האחסון הנדרש של מאגר לליזה תא 1x עם 25 ננומטר ORY-1001 והתהליך כפי שמתואר בשלב 3.1 ל 3.3.
   2. להעביר את supernatants של השליטה החיובית לתוך טרי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות ולהשאיר אותם על הקרח עבור 1 h. ORY-1001 במזיד לעכב KDM1A ולחסום את הכריכה כימית.
   3. הוסף 5 μL של 2 μM OG-881 פתרון עבודה על השליטה חיובי supernatant (אמצעי האחסון עבור בקרה חיובית שנוצר מדגם מתוך 40 מ ג) או 2.5 μL של 2 μM OG-881 פתרון עבודה (נפח לפקד חיובי שנוצר ממדגם 10⁷תאים) כדי לקבל אותו OG-881 ריכוז כמו הדגימות האחרות ולהשאיר בקרח במהלך 2 h. המשך לשלב 4.

4. קוונפיקציה של חלבון מקורי באמצעות שיטת ברדפורד

1. לדלל את המקור מסחרית ברדפורד חלבון שיטת מגיב 5 פעמים עם H₂O סוג 1 מים מזוקקים כפול. חשב את הנפח של המינון הנדרש עבור הסכום הכולל של דגימות ותקנים (1 mL לכל מדגם או תקן + 5 מ"ל נפח עודף).
2. עבור מעגל סרום של שור (BSA), להכין צינור מיקרוצנטריפוגה אחד עם 1 mL מדולל ברדפורד חלבון שיטת הפתרון (ריק) ושבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה עם 995 μL של הפתרון שיטת ברדפורד חלבון מדולל. הוסף 5 μL של כל אחד מתקני BSA (ריכוז החל 125 כדי 2,000 μg/mL) לכל אחד 7 צינורות מיקרוצנטריפוגה ולערבב אותם על ידי היפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
3. להעביר את התקנים מדולל לתוך כימיקלים ולקרוא את OD של הריק והסרום פרה אלבומין סטנדרטי בספקטרוסקופיה ב 280 nm.
4. עבור דגימות ביולוגיות, להכין שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחת עם 1 mL מדולל ברדפורד חלבון שיטת הפתרון (ריק) וכמו צינורות מיקרוצנטריפוגה רבים עם 999 μL של מדולל ברדפורד חלבון שיטת מגיב כמו דגימות שצריך להיות כימות. באמצעות שימוש אוטומטי P2 מיקרופיפטה, להוסיף 1 μL של תמצית חלבון יליד מוכן בשלב 3 לכל שפופרת מיקרוצנטריפוגה ולערבב על ידי היפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים. מודקון את הדגימות 5 דקות ב RT.
5. להעביר את אמצעי האחסון לתוך כימיקלים ולקרוא את OD של דגימות ב ספקטרוסקופיה ב 280 nm.
6. מעדיפים, המשיכו מיד לשלב 5. לחילופין, אחסן את תמציות החלבון היליד-80 ° צ' עד שלב 5. למנוע הקפאת מחזורי הפשרה.

5. מאיר אליאס לקביעת סה כ וחופשי KDM1A

הערה: המשיכו בטמפרטורת המעבדה ב23-24 ° צ' (RT).

1. ציפוי של צלחות microtiter עם KDM1A לכידת נוגדן או Streptavidin
   1. סה כ KDM1A אליסה: עבור כל צלחת, להכין 10 מ ל של KDM1A לכידת נוגדן לריכוז הסופי של 2 μg/mL ב PBS. העבר 100 μL לתוך כל טוב של הצלחת.
   2. חינם KDM1A אליסה: עבור כל צלחת, להכין 10 מ ל של streptavidin ב 10 μg/mL ב PBS. העבר 100 μL לתוך כל טוב של הצלחת.
   3. Top-לאטום את הצלחות KDM1A אליסה ללא תשלום עם סרט דביק לבין הלוחות הלילה ב 4 ° c במקרר.
2. כביסה וחסימת צלחות
   1. קח את הצלחות מהמקרר ולתת להם שיווי משקל סביב 45 דקות ב RT לפני השימוש.
   2. הכנת 1,000 mL לשטוף מאגר (0.1% הרצף ב-PBS) ו 50 mL חסימת מאגר (1% BSA ב-PBS) לכל צלחת.
   3. לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מאגר לשטוף. בשלב זה ובשלבים הבאים, הקש על הצלחת על מגבות נייר לאחר כל צעד כביסה כדי להסיר את הפתרון שיורית.
   4. הוסף 200 μL של חסימת מאגר לכל היותר לשני הצלחות, העליון חותם שתי צלחות עם סרט דביק ו-דגירה 2 h ב RT.
3. הכנה לדוגמא ביולוגית
   1. לדלל את תמציות חלבון יליד בסוף שלב 3 לריכוז המתאים באמצעות PBS. הריכוז המומלץ ישתנה בהתאם לרמת הביטוי KDM1A במדגם הביולוגי. דוגמאות של טווחים מתאימים הם (1) כדורי תא: 0.5-10 μg לכל טוב. (2) PBMCs: 5-30 μg לכל טוב. (3) רקמת מרוסק (המוח, הריאה, העור): 20-100 μg לכל טוב. שמור את הדגימות על הקרח במהלך ההכנה. במידת האפשר, הפעל ניתוחי שלישיה טכניים.
   2. הכן עיקול רגיל באמצעות rKDM1A אנושי:
      1. כדי להכין את פתרון העבודה KDM1A Standard, ללטף את הנפח המתאים של rKDM1A לריכוז הסופי של 25 pg/μL, להוסיף 75 μL של 2 μM OG-881, ולהשלים עם 1 x PBS לנפח כולל של 6 מ ל בתוך 15 מ"ל שפופרת פלקון. שמור את הפתרון KDM1A תקן העבודה על הקרח במהלך 1 h ולערבב את הפתרון בעדינות על ידי היפוך 15 mL פלקון מספר פעמים כל 20 דקות.
      2. הכינו את סדרת הדילול הסטנדרטית KDM1A ב-1.5 mL בצינורות מיקרוצנטריפוגה בהתאם לטבלה 1 (הכנה סטנדרטית), בנפח מספיק עבור ניתוח הטרילקאט של 2 96 היטב מיקרוטיטר צלחות.

סדרת סטנדרט	KDM1A פתרון עבודה רגיל (μL)
(pg KDM1A/טוב)		ערוץ הPBS (μL)
2500 ג-*	800	-
2500	800	-
1750	560	240
1250	400	400
750	240	560
55W	80	720
25	8	792
0	0	800
הערה
(1) אמצעי האחסון המוכן לכל דילול מספיק כדי לפעול בטריליטה 2 צלחות של שיטת הספק.
(2) הטווח המומלץ בין 2.5 ל-5,000 pg/טוב
* עבור שליטה שלילית C-, ללא נוגדן זיהוי KDM1A

שולחן 1: הכנה סטנדרטית. כדי להכין את הסדרה הסטנדרטית של חלבון KDM1A, פיפטה את הכרכים המצוינים של פתרון העבודה KDM1A רגיל ו-PBS לתוך שמונה שכותרתו כראוי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות.

שולחן 2: עיצוב הצלחת במעמקי הבאר. תקנים (כחול) ודגימות (צהוב) משלב 5.4.2. היו מושחצים לתוך התנוחות המשתקף של צלחת הבאר העמוקה כדי להקל על הטעינה לתוך הצלחות אליסה בעקבות הכיוון של הכחול (סטנדרטי) וצהוב (דגימות) חיצים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

שולחן 3: עיצוב לוחית אליסה. לוח השיטות כולל את עקומת התקן עם כמויות הפחתת היעד רקומביננטי KDM1A (בכחול); דגימות ביולוגיות (ים) בצהוב; ופקדים שליליים מקבילים (מכילים את הדגימות אך לא את נוגדן הזיהוי הראשי) בלבן, שייטענו על צלחות ה-אליסה מלוחית הבאר העמוקה. הריק (0 בעקומה סטנדרטית) מכיל את כל ריאגנטים לכידה ואיתור, אך לא מדגם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

4. אליסה
   1. (המשך משלב 5.2.4.) לאחר 2 שעות דגירה, למחוק את מאגר חסימת ולשטוף את לוחיות עם מאגר לשטוף.
   2. להעביר את הדגימות מדולל כראוי (תמציות חלבון מקורי ועקום רגיל משלב 5.3.) לבלוק בקירור 96 לחסום היטב בעקבות התפלגות לוחית המוצגת בטבלה 2 (בלוח הצלחת עמוק).
   3. שמור על הבלוק הזה על הקרח עד pipetting יטוף 100 μL לדוגמה/גם בצלחות ה-Total ו-דיאגנוסטיקה חינם בעקבות התפלגות הצלחת המוצגת בטבלה 3 (עיצוב לוחית הרישוי של אליסה).
   4. דגירה עבור 1 h ב RT, למחוק את הדגימות ולשטוף את הצלחות 5 פעמים עם מאגר לשטוף.
   5. הכינו 20 מ ל של הארנב anti-KDM1A נוגדן זיהוי ב 0.125 μg/mL במאגר חסימת, להוסיף 100 μL לכל טוב בכל צלחת של השיטת, למעט בארות המתאימות לפקדים שליליים C-. העליון-לאטום את הצלחת ו הדגירה 1 h ב RT.
   6. למחוק את הפתרון נוגדן זיהוי ולשטוף את הצלחות 6 פעמים עם מאגר לשטוף.
   7. הכינו 25 מ ל של עז משנית אנטי הארנב נוגדן HRP כדי דילול 1:5000 במאגר חסימת, להוסיף 100 μL לכל טוב לצלחות microtiter; ו-מודטה 1 h ב RT.
5. גילוי כימומינטאואת
   1. .30 דקות לפני סיום שלב 5.4.7 ותחת תנאי תאורה רכים, מערבבים חלקים שווים של הלומירול ומשפר את התמיסה (10.5 mL: 10.5 mL, עבור 2 צלחות) בבקבוק ענבר ולהשאיר אותו ב-RT.
      הערה: שמור את פתרון העבודה של הלומינול בבקבוק ענבר והימנע מחשיפה ממושכת לכל אור אינטנסיבי. חשיפה לטווח קצר לתאורת מעבדה טיפוסית לא תפגע בפתרון העבודה.
   2. לפחות 20 דקות לפני מדידת האור, לעבור על קורא מיקרופלייט ב 25 ° צ' ולהגדיר את הקריאות 1,000 ms זמן האינטגרציה ו 150 ms זמן להתיישב. הגדרות פרמטר עשויות לדרוש אופטימיזציה בתפקוד הכלי.
   3. אחרי 1 h של דגירה בשלב 5.4.7., למחוק את הפתרון נוגדן משני ולשטוף את הצלחות 6 פעמים עם מאגר לשטוף.
   4. הפיפטה 100 μL לכל היותר של פתרון העבודה של הלומינול (מצע הכימומינטאנמטר) המוכן בשלב 5.5.1. פיפטה לאט מאוד. ולהימנע מהיווצרות בועות השתמש שעון עצר כדי לשלוט על הזמן בין הוספת התוספת של הפתרון ואת מדידת האור של לוחיות ולשמור על הזמן הזה קבוע כדי להשיג שימוש טוב בין שיטת התשובה.
   5. העליון-חותם את הצלחות צנטריפוגה כדי 500 x g ב RT עבור 45 s בצנטריפוגה צלחת לחסל את כל הבועות הנותרים. מודקת את הצלחות עבור 1 דקות על צלחת שייקר ב 100 סל ד.
   6. הכנס את הצלחת בתוך הקורא והשאר אותו למשך 3 דקות כדי לייצב את הטמפרטורה ב -25 ° צ' (ללא דבק). התחל תמיד בצלחת החינם של אליסה.
   7. קרא את יחידות האור היחסיות (RLU) של כל שיטת הצלחות אליסה (KDM1A בחינם וכסה).
   8. שמור והעתק את ערכי RLU הגולמיים מקבצי הנתונים הגולמיים של excel לניתוח נוסף של התוצאות.

6. חישוב התחייבות היעד

1. בתוכנת גיליון אלקטרוני, חשב את הערכים הכולל של RLU בחינם ו-RLU של דגימות S_X ודגימות הפניה REF (מטופל, רכב או מינון טרום-מנה) מתוך שכפול הנתונים הטכניים שלהם מהנתונים הגולמיים שלהם כמפורט להלן:
   1. הזן את הנתונים האישיים Raw RLUi Total ו-Raw RLUi חינם ממקומות ריקים, עקומה סטנדרטית, פקדים שליליים C-ודגימות ביולוגיות (S_X ו-REF) לתוך גליון הנתונים של הניתוח (לדוגמה, Excel). כמו כן, הזן את הסכומים (בתוך pg) של KDM1A מתוך עקומת התקן בגליון הנתונים.
   2. חישוב ממוצע Raw RLU, הסטיות הסטנדרטיות σ_rlu, ומקדם וריאציה של קורות חיים_rlu מהנתונים raw חינם Raw ונתוני rlu ללא תשלום עבור כל נקודת נתונים שכפול טכני.
   3. החל את חיסול החריג (דוגמה לטריליטים): עבור כל הנתונים הפנויים rlu כולל של כל היחידות ו-rlu של מקטע מתוך מאגר מידע, החל את הקריטריונים של Grubbs כאשר קורות החיים עבור הטרילקאט > 0.15, ודחה את ערך ה-RLU של החשוד היחיד כאשר
      ,
      לפיו Z = 1.148 עבור n = 3 ו 90% מרווח ביטחון (CI).
   4. אם חיסול בלתי מושלם הוחל, לחשב מחדש את ממוצע Raw RLU, סטיית תקן σ_rlu ו-CV_rlu מן לא נדחה (Nr) Raw rlu כולל ערכים raw rlu חינם עבור כל נקודת נתונים.
   5. החל את תיקון הרקע: חשב את הערכים הכולל של RLU חינם ו-RLU עבור כל מדגם רגיל, וכל אחד מהדוגמאות S_X ו-REF לדוגמה הפניה:
      
      
2. מייצגים באופן גרפי את הנתונים כדלקמן:
   1. התווה את הערכים הכולל של Rlu בחינם ו-rlu (ציר Y) ביחס לזיהוי המדגם שלהם (ציר X) בגרף עמודות.
   2. כמו כן, התווה את ערכי ה-RLU (ציר Y) של התקנים בהתוויה של פיזור יחסית לכמות הpg של חלבון rKDM1A (ציר X) עבור מדידות בחינם וכולל, כמו גם קווי מגמה של שורה מקבילים וחישוב ה-r² (ריבוע הלינארי מקדם מתאם).
3. חישוב התחייבות היעד (TE); i.e. את אחוז KDM1A כרוך על ידי המעכב KDM1A בכל מדגם S_X יחסית למדגם הפניה REF (מטופל, רכב או מינון טרום מדגם) כדלקמן:
   1. חשב את היחס R של הערכים הממוצע של RLU ללא תשלום עבור הדוגמאות SX ו-REF בשם:
      
      
   2. לאחר מכן לחשב את האירוסין היעד (TE) של המדגם S_X as:
      
      אופציונלי: (1) אם התבצע שכפול ביולוגי של נסיונות N, כל אחד עם n משכפל טכני; לחשב תחילה את ה-TE_SX עבור ערכות השכפול הטכניות. לאחר מכן, לחשב את ממוצע ה-TE, SD ואת ערכי קורות החיים עבור ערכת השכפול הביולוגית.
4. שנה אם קריטריוני קבלת הדרישות מתקיימים: ודא כי (1) רקע הקבלה מקובל והממוצע ריק < 0.05 x 10⁷ rlu; (2) המדגם אוטומטי לאור נעדר ואת RLUs של הפקדים השליליים C-נמצאים מתחת לגבול נמוך של קוונפיקציה (יוסה = ממוצע ריק + 10x SD); (3) העקומה הסטנדרטית rKDM1A היא לינארית ו-r2 ≥ 0.98; (4) הדגימות הביולוגי כוללים ערכי RLU הנופלים בטווח הדינמי והליניארי של השיטת הצריכה הבין ל-יוסה ו-2,500 pg/היטב.
   הערה: שלבים 6.1. ל6.4. יכול להיות אוטומטי בקלות בגליון נתונים אינפיניטסימלי.
5. יצא את נתוני ה-TE לתוכנה בעלת מקור פתוח או סטטיסטיקה מסחרית של בחירה עבור הייצוג הגרפי של ערכי ה-TE והערכות סטטיסטיות נוספות.

תוצאות

יניאריות of סך הכל וההגדרה חינם KDM1A.

סדרות סטנדרטיות הוכנו כמתואר בשלב 5.3.2., באמצעות 0 עד 2500 pg של אנזים רקומביננטי KDM1A אנושי באורך מלא. ערכי ה-RLU של Total ו-rKDM1A Free העריכו לאמת את היניאריות (איור 2A ו- 2a). נתונים מיוצ...

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן פותחה כדי למדוד ישירות KDM1A היעד באמצעות רומן KDM1A chemoprobe ללכוד מבוסס אליסה. השיטה אומתה על קווי הגוף האנושי התרבותי ודגימות vivo לשעבר מן האדם, עכברוש ועכבר בבון (כולל PBMCs, ריאות, המוח, העור, גידולים), אבל יכול להיות מיושם בקלות על מינים אחרים שבו KDM1A נוגדן היעד אפיסקופים ו קטלי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Trypsin-EDTA (1X)	Thermo Scientific	#25300-062
10 X Protease Inhibitor Tablets	Roche	#11836153001
96 deep well storage block	VWR	#734-1679
96 well ELISA plates	Nunc	#436110
Adhesive black Film	Perkin Elmer	#6050173
Adhesive transparent Film	VWR	#60941-062
Biotinylated KDM1A probe OG-881	Oryzon Genomics S.A.	NA
Bovine Serum Albumin	Sigma	# 3117057001
Bovine Serum Albumin Standard	Thermo Scientific	#23208)
Bradford Protein Assay	BioRad	#500-0001
Cell lysis buffer 10X	Cell Signaling	#9803
Centrifuge for 96- well plates	Hettich	Rotina 420R
Flask	Thermo Scientific	#156499
Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A	Active Motif	#31426
Graphpad Prism 5 Project	GraphPad Software	NA
Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)	Thermo Scientific	#37074
Micro Centrifuge	Eppendorf	5415 R
Microplate reader Infinite 200-Tecan	Tecan	Infinite 200
Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)	Abcam	#ab53269
Needle G18 gauge blunt	BD	#303129
ORY-1001 (iadademstat)	Oryzon Genomics S.A.	NA
PBMC separation tubes 10 ml	Greiner bio-one	#163288
PBMC separation tubes 50 ml	Greiner bio-one	#227288
PBS 1x	Sigma	#D8537
Plate shaker	Heidolph Instruments	Rotamax 120
Polysorbate 20	Sigma	#P7949
Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)	Cell Signaling	#672184BF-100
Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	#31458
Spectrophotometer cuvette 1.5	Deltalab	#302100
Spectrophotometer for cuvette	GE Healthcare	GeneQuant 1300
Streptavidin	Promega	#Z704A
Syringe	BD	#303172
Type 1 ultrapure water	Millipore	Milli-Q Advantage A10
Ultrasonic cleaner	VWR	USC200T