Medição direta do KDM1A Target Engagement usando imunoensaios baseados em Quimiosonda

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para medir KDM1A engajamento alvo em uma célula humana ou animal, tecido ou amostras de sangue tratadas com inibidores da KDM1A. O protocolo emprega a marcação do chemoprobe da enzima livre de KDM1A e a quantificação direta da ocupação do alvo usando immunoensaios quimioprobe-baseados e pode ser usada em estudos pré-clínicos e clínicos.

Resumo

A avaliação do engajamento alvo, definida como a interação de um fármaco com a proteína para a qual foi projetada, é um requisito básico para a interpretação da atividade biológica de qualquer composto no desenvolvimento de fármacos ou em projetos de pesquisa básica. No Epigenetics, o acoplamento do alvo é avaliado o mais frequentemente pela análise de marcadores do proxy em vez de medir a União do composto ao alvo. Os leituras biológicos a jusante que foram analisados incluem a modulação da marca do histona ou as mudanças da expressão de Gene. KDM1A é uma desmetililase de lisina que remove grupos metilo de mono e H3K4 dimetilizados, uma modificação associada ao silenciamento da expressão gênica. A modulação dos marcadores do proxy é dependente do tipo e da função da pilha da make-up genética das pilhas investigadas, que pode fazer a interpretação e a comparação do Cruz-caso completamente difícil. Para contornar estes problemas, um protocolo versátil é apresentado para avaliar os efeitos da dose e a dinâmica do acoplamento direto do alvo de KDM1A. O ensaio descrito faz uso de uma quimiosonda KDM1A para capturar e quantificar a enzima desinibida, pode ser amplamente aplicada a células ou amostras de tecido sem a necessidade de modificação genética, tem uma excelente janela de detecção, e pode ser usado tanto para pesquisa básica e análise de amostras clínicas.

Introdução

O demetilase específico 1 de lysine (KDM1A)¹ é um demetilase envolvido no controle da transcrição do gene. Esta proteína emergiu como um alvo farmacológico candidato² em Oncologia; incluindo leucemia mielóide aguda³ (AML), síndrome de mielodisplasia (MDS)⁴, mielofibrose (MF)^5,6, câncer de pulmão de pequenas células (SCLC)⁷; em doença falciforme (SCD)^8,9, e em doenças do sistema nervoso central, incluindo a doença de Alzheimer (AD), esclerose múltipla (MS); e na agressão¹⁰.

A maioria dos compostos inibidores da KDM1A no desenvolvimento clínico são derivados da ciclopropilamina e inibem a proteína por ligação covalente ao seu cofator¹¹de flavina-dinucleotídeo (FAD). A inibição da KDM1A induz alterações na expressão gênica, mas essas alterações variam enormemente nos tecidos, tipos de células ou casos de doença. A inibição da KDM1A também altera as marcas de histona¹², mas essas mudanças são geralmente produzidas localmente em um local específico no genoma, e são novamente, altamente tecido e células específicas.

O protocolo foi desenvolvido para medir diretamente o engajamento alvo de KDM1A em amostras biológicas e foi otimizado para o uso com inibidores derivados da ciclopropilamina. O ensaio é baseado na tecnologia ELISA e analisa, em paralelo, total e livre (ou seja, não acoplado por inibidor) KDM1A em um extrato de proteína nativa de uma amostra biológica em um ensaio de fase sólida. Como primeiro passo, a amostra biológica é lisada na presença da quimiosonda seletiva biotinilada KDM1A og-881^13,14, derivada do inibidor seletivo KDM1A Ory-1001 (iadademstat), um potente inibidor da KDM1A em clínica desenvolvimento para o tratamento da doença oncológica. O chemoprobe tem um IC₅₀ para KDM1A de 120 nanômetro e inclui um metade obrigatório do FAD lig a um polietileno biotinylated glicol (PEG)-cauda. A quimiosonda liga-se exclusivamente à KDM1A livre, mas não à KDM1A associada ao inibidor na amostra. Após a ligação do chemoprobe, os KDM1A que contêm complexos na amostra são capturados em placas do de microtitulação com a superfície revestida estreptavidina para determinar o KDM1A livre, ou em placas revestidas com um anticorpo KDM1A monoclonal da captação para determinar o KDM1A total. Após a lavagem, ambas as placas são incubadas com um anticorpo de detecção KDM1A, lavadas novamente, e incubadas com um anticorpo de IgG anticoelho conjugado HRP secundário para detecção usando um substrato luminescente e quantificação por medição relativa de luz (RLU) num luminômetro (Figura 1).

Figura 1. Esquema de ELISA enzima lig o ensaio immunoabsorvente do chemoprobe para o acoplamento do alvo KDM1A: A) determinação do total KDM1A usando o sanduíche ELISA e B) determinação do KDM1A livre usando o quimioprobe Elisa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma curva padrão é incluída em ambas as placas ELISA para verificar a linearidade de cada ensaio. A determinação do engajamento alvo de KDM1A em cada amostra é então calculada como um valor relativo para a amostra pré-dose ou tratada pelo veículo.

Protocolo

Amostras de sangue foram obtidas do Instituto de Investigación biomédica Sant Pau biobank de acordo com a legislação espanhola (Real Decreto de biobancos 1716/2011) e aprovação dos comitês de ética locais. Estudos com tecidos animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório (diretiva do Conselho das Comunidades Europeias 86/609/CEE), instituído pelo Comitê de ética para experimentação animal no PRAAL-PCB.

1. preparação de amostras biológicas para o ensaio.

PRECAUÇÃO: Este protocolo envolve a manipulação de amostras biológicas que podem ser submetidas à norma de patógenos de sangue (29 CFR 1910,1030), da administração de segurança e saúde ocupacional (OSHA), da Directiva 2000/54/CE do Parlamento Europeu e do Conselho de 18 de setembro de 2000 ou regulamentos equivalentes. Além disso, as amostras biológicas podem conter traços de compostos químicos experimentais biologicamente ativos e o protocolo pode envolver uma maior manipulação desses compostos. Reveja a ficha de dados de segurança (SDS) dos compostos utilizados antes do início do experimento e respeite rigorosamente todas as medidas de segurança aplicáveis estabelecidas no centro de investigação, incluindo a utilização de equipamento de protecção individual (EPI) adequado. Use vestuário de proteção adequado e usar blindagem adequada durante o curso do experimento. Descarte resíduos nos recipientes de resíduos apropriados (resíduos biológicos/citotóxicos).

Nota: Este protocolo começa com células ou amostras de indivíduos tratados com um inibidor da KDM1A e os seus controlos não tratados ou de veículo/placebo³.

1. Células tratadas com o inibidor do veículo ou KDM1A in vitro
   1. Para as células cultivadas em suspensão, como culturas de 10 mL, transfira as suspensões em tubos cônicos limpos de 15 mL e prossiga para 1.1.3.
   2. Para as células aderentes (cultivadas em 75 cm² frascos), retire o meio do balão e lave brevemente usando 4 ml de PBS. Retire as células de seus vasos usando 1,5 mL de 0,5% Trypsin-EDTA durante 2-5 min (as condições de trypsinization podem variar, siga as recomendações do provedor para a linha celular), adicione 4 mL de PBS e transfira as células em tubos cônicos limpos de 15 mL.
   3. Insira os tubos em uma centrífuga de bancada e colete as células por centrifugação por 5 min a 400 x g a 4 ° c. Retire o sobrenadante, ressuscitou a pelota em 1 mL de PBS dispensado usando uma micropipeta e transfira a suspensão em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   4. Insira as amostras numa centrífuga de microtubos e Centrifugue-as durante 5 min a 400 x g a 4 ° c. Retire a PBS por aspiração com uma micropipeta e mantenha as pelotas no gelo e prossiga para a etapa 2; ou congelar as pelotas em gelo seco e armazená-los em-80 ° c até a etapa 3.
2. Amostras de indivíduos ou animais tratados com um inibidor do veículo/placebo ou KDM1A
   1. Tecidos: corte o tecido em pequeno, ≈ 1 cm³ peças usando um bisturi. Congele as partes dos tecidos no líquido N₂ em um recipiente do Dewar e armazene-os em-80 ° c até a etapa 3.
   2. Células mononucleares do sangue polymorphic (PBMCs): diluir 10 mL de sangue fresco (processo máximo 2 h após a retirada de sangue) coletado em tubos de K₂-EDTA com 2 volumes de PBS em um tubo cônico de 50 ml. Isole os PBMCs do sangue usando tubos de separação de PBMC comercialmente obtidos de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha as pelotas no gelo e prossiga para o passo 3,2; ou congelar as pelotas em gelo seco e armazená-los em-80 ° c até a etapa 3.
      Nota: um pellet de células molhadas de 20 a 50 μL contém ≈ 1 x 10⁷ células, dependendo do tamanho da célula. Um pellet de PBMC molhado obtido a partir de 10 mL de sangue humano saudável tem um volume de ≈ 20 μL e contém ≈ 1 x 10⁷ PBMCs. os tecidos ou as pelotas da pilha podem ser armazenados em-80 º c por até 6 meses.

2. preparação da solução

1. Prepare 2 μM OG-881 solução de trabalho: Tome uma alíquota de uso único de 10 μL da solução de estoque de sonda biotinilada de 20 mM OG-881 para fora do refrigerador de 4 ° c e deixe-a à temperatura ambiente (RT) por 10 min. Prepare a solução de trabalho de 2 μM por diluição serial do solut de estoque OG-881 íon em PBS, usando uma micropipeta com pontas de filtro e mudando a ponta entre as etapas diferentes da diluição.
2. Prepare o inibidor da protease 10x: dissolva 1 pastilha em 1 mL de PBS em um tubo de microcentrífuga.
3. Prepare o volume desejado de 1x tampão de lise celular com 25 nM OG-881 quimiosonda. Para cada mL, misturar 100 μL comercialmente obteve 10x tampão de lise celular, 150 μL de inibidor de protease 10x, 12,5 μL de 2 μM OG-881 e 737,5 μL de água destilada dupla tipo 1.
4. Opcionalmente, prepare o volume desejado de 1x tampão de lise celular, mas com 25 nM ORY-1001 em vez de OG-881 como na etapa 2,3. Podem ser utilizados inibidores menos potentes, mas podem necessitar de concentrações mais elevadas, para utilização no controlo positivo com inibição de 100% (ver passo 3,5).
   Nota: Tome as medidas apropriadas para evitar qualquer contaminação não intencional de soluções ou amostras com as soluções de ações do inibidor OG-881 ou KDM1A. Para calcular o volume desejado de 1x tampão de lise celular com 25 nM OG-881, suponha que 400 μL é exigido por 40 mg de tecido pulverizado, ou 200 μL por pellet molhado de 10⁷ células.

3. extração de proteínas nativas

1. Dos tecidos:
   1. Pulverize e Homogeneize um cubo de ≈ 1 cm³ do tecido congelado com um almofariz e um pilão refrigerados no gelo seco. Aliquot as amostras em frascos de uso único contendo ≈ 40 mg de pó de tecido, evite descongelar em todos os momentos. Prossiga para o passo 3.1.2. para processamento imediato ou armazenar a-80 ° c.
   2. Ressuscitem 40 mg de tecido pulverizado em 400 μL de tampão de lise celular 1x com 25 nM OG-881, vortex por 10 s, e force a amostra pelo menos cinco vezes através de uma agulha de seringa sem corte de 18 gauge até que a lise do tecido seja alcançada e uma luz turva amarela à suspensão laranja seja Obtido. Evite a formação de bolhas.
   3. Continue para a etapa 3,3
2. A partir de pelotas de células (PBMCs e linhas celulares):
   1. Ressuscitem um pellet de ≈ 1 x 10⁷ células em 200 μL de tampão de lise de células 1x contendo 25 nm OG-881. Vórtice as amostras brevemente e mantê-los no gelo por 5 min.
   2. SONICATE as amostras em um sonicador usando 3 pulsos de 20 s cada em 45 kHz; Coloque-os no gelo por 20 s entre pulsos.
      Nota: assim que as amostras biológicas tiverem sido ressuscipended no tampão de lise celular 1x, mantenha-os no gelo durante o resto do processo.
3. Mantenha as amostras no gelo por um adicional de 5 min, vórtice brevemente e Centrifugue as amostras por 10 min a 14 000 x g em uma centrífuga pré-resfriada a 4 ° c.
4. Usando uma micropipeta de 1 mL, transfira os sobrenadantes em tubos de microcentrífuga 1,5 mL frescos e deixe-os no gelo durante 2 h. Avance para o passo 4.
5. Opcionalmente, um controle positivo para simular 100% de engajamento de destino pode ser preparado da seguinte maneira:
   1. Ressuscitem a pelota da pilha ou o tecido pulverizado de um veículo ou uma amostra não tratada (da pré-dose) no volume exigido do amortecedor da lise da pilha 1x com 25 nanômetro ORY-1001 e processo como esboçado em etapa 3,1 a 3,3.
   2. Transfira os sobrenadantes do controle positivo em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL frescos e deixe-os no gelo para 1 h. ORY-1001 inibem deliberadamente KDM1A e ligação do chemoprobe do bloco.
   3. Adicionar 5 μL de solução de trabalho de 2 μM OG-881 ao sobrenadante de controlo positivo (volume para controlo positivo gerado a partir de uma amostra de tecido de 40 mg) ou 2,5 μL de solução de trabalho de 2 μM OG-881 (volume para controlo positivo gerado a partir de uma amostra de 10⁷células) para obter a mesma concentração OG-881 que as outras amostras e deixar no gelo durante 2 h. continue para o passo 4.

4. quantificação da proteína nativa utilizando o ensaio de Bradford

1. Diluir o reagente de ensaio de proteína Bradford comercialmente adquirido 5 vezes com H₂O tipo 1 água destilada dupla. Calcule o volume do reagente necessário para a quantidade total de amostras e normas (1 mL por amostra ou padrão + 5 mL de volume em excesso).
2. Para a curva padrão da albumina de soro bovino (BSA), prepare um tubo do microcentrifugador com 1 mL diluída solução do ensaio da proteína de Bradford (em branco) e sete tubos do microcentrifugador com 995 μL da solução diluída do ensaio da proteína de Bradford. Adicione 5 μL de cada um dos padrões de BSA (concentração variando de 125 a 2.000 μg/mL) a cada um dos 7 tubos de microcentrífuga e misture-os suavemente invertendo os tubos várias vezes. Incubar por 5 min em RT.
3. Transfira as normas diluídas para os cubos e leia o OD das amostras em branco e a albumina sérica bovina padrão em um espectrofotômetro a 280 nm.
4. Para as amostras biológicas, prepare um tubo de microcentrífuga com 1 mL diluída solução de ensaio de proteína Bradford (em branco) e como muitos tubos de microcentrífuga com 999 μL do reagente de ensaio de proteína Bradford diluído como amostras que precisam ser quantificadas. Usando uma micropipeta P2 automática, adicione 1 μL de extrato de proteína nativa preparado na etapa 3 para cada tubo de microcentrífuga e misture suavemente invertendo os tubos várias vezes. Incubar as amostras 5 min em RT.
5. Transfira os volumes para os cubos e leia o OD das amostras em um espectrofotômetro a 280 nm.
6. Preferencialmente, prossiga imediatamente para a etapa 5. Alternativamente, armazene os extratos nativos da proteína em-80 ° c até a etapa 5. Evite congelar ciclos degelo.

5. luminescente ELISAs para total e livre KDM1A determinação

Nota: Mantenha a temperatura do laboratório constante a 23-24 ° c (RT).

1. Revestimento de placas do de microtitulação com anticorpo da captação KDM1A ou streptavidin
   1. Total KDM1A ELISA: para cada placa, prepare 10 mL de anticorpo de captura KDM1A para uma concentração final de 2 μg/mL em PBS. Transfira 100 μL para cada poço da chapa.
   2. KDM1A ELISA livre: para cada placa, prepare 10 mL de estreptavidina a 10 μg/mL em PBS. Transfira 100 μL para cada poço da chapa.
   3. Top-sele as placas totais e livres de KDM1A ELISA com película adesiva e incubar as placas durante a noite em 4 ° c no refrigerador.
2. Lavar e bloquear as placas
   1. Leve as placas para fora da geladeira e deixe-os equilibrados por cerca de 45 min em RT antes de usar.
   2. Prepare 1.000 mL tampão de lavagem (0,1% Tween em PBS) e 50 mL tampão de bloqueio (1% BSA em PBS) por placa.
   3. Lave as placas 3 vezes com tampão de lavagem. Neste e em etapas subseqüentes, bata a placa em toalhas de papel após cada etapa de lavagem para remover a solução residual.
   4. Adicionar 200 μL de tampão de bloqueio por poço a ambas as placas, vedação superior ambas as placas com uma película adesiva e incubar 2 h em RT.
3. Preparação biológica da amostra
   1. Diluir os extratos de proteínas nativas obtidos no final da etapa 3 para a concentração apropriada usando PBS. A concentração recomendada variará em função do nível de expressão de KDM1A na amostra biológica. Os exemplos de escalas apropriadas são (1) pelotas da pilha: 0,5-10 μg por o poço. (2) PBMCs: 5-30 μg por poço. (3) tecido pulverizado (cérebro, pulmão, pele): 20-100 μg por poço. Mantenha as amostras no gelo durante a preparação. Quando possível, execute análises técnicas da amostra do triplicado.
   2. Prepare uma curva padrão usando o rKDM1A humano:
      1. Para preparar a solução de trabalho padrão KDM1A, Pipet o volume apropriado de rKDM1A para uma concentração final de 25 PG/μL, adicione 75 μL de 2 μM OG-881, e termine com 1 x PBS a um volume total de 6 mL em um tubo do falcão de 15 mL. Mantenha a solução de trabalho padrão KDM1A no gelo durante 1 h e misture a solução suavemente invertendo o tubo Falcon de 15 mL várias vezes a cada 20 min.
      2. Prepare a série de diluição padrão KDM1A em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de acordo com a tabela 1 (preparação padrão), em volume suficiente para a análise triplicada de 2 96 placas de microtitulação bem.

SÉRIE PADRÃO	KDM1A solução de trabalho padrão (μL)
(PG KDM1A/bem)		PBS (μL)
2500 para C-*	800	-
2500	800	-
1750	560	240
1250	400	400
750	240	560
250	80	720
25	8	792
0	0	800
Nota:
(1) o volume preparado de cada diluição é suficiente para ser executado em triplicado 2 placas de ensaio.
(2) a faixa recomendada é entre 2,5 e 5.000 PG/bem
* Para o controle negativo C-, sem anticorpo da deteção de KDM1A

Tabela 1: preparação padrão. Para preparar a série padrão de proteína KDM1A, pipeta os volumes indicados de KDM1A solução de trabalho padrão e PBS em oito tubos de microcentrífuga de 1,5 mL devidamente rotulados.

Tabela 2: projeto profundo da placa do poço. Padrões (azul) e amostras (amarelo) a partir do passo 5.4.2. foram pipetadas nas posições refletidas da placa de poço profundo para facilitar o carregamento nas placas ELISA seguindo a direção das setas azul (padrão) e amarela (amostras). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela 3: projeto da placa de Elisa. A placa do ensaio inclui a curva padrão com quantidades de diminuição do alvo KDM1A de recombinação (no azul); as amostras biológicas (S) em amarelo; e os controles negativos correspondentes (contêm as amostras mas não o anticorpo preliminar da deteção) no branco, a ser carregados nas placas de ELISA da placa do poço profundo. O espaço em branco (0 na curva padrão) contém todos os reagentes de captura e detecção, mas nenhuma amostra. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

4. Elisa
   1. (Continuação do passo 5.2.4.) Após 2 h de incubação, descarte o tampão de bloqueio e lave as placas com tampão de lavagem.
   2. Transfira as amostras adequadamente diluídas (extratos de proteínas nativas e a curva padrão da etapa 5,3.) para um bloco de armazenamento refrigerado 96 profundo, seguindo a distribuição da placa mostrada na tabela 2 (design de placa de poço profundo).
   3. Mantenha este bloco no gelo até Pipetar 100 μL de amostra/poço nas placas ELISA total e livre, seguindo a distribuição da chapa mostrada na tabela 3 (ELISA Plate Design).
   4. Incubar por 1 h em RT, descarte as amostras e lave as placas 5 vezes com tampão de lavagem.
   5. Prepare 20 mL de anticorpo anti-KDM1A de detecção de coelhos a 0,125 μg/mL em tampão de bloqueio, adicione 100 μL por poço em cada placa do ensaio, excepto em poços correspondentes aos controlos negativos C-. Top-selar a placa e incubar 1 h em RT.
   6. Descarte a solução de anticorpos de detecção e lave as placas 6 vezes com tampão de lavagem.
   7. Prepare 25 ml de anticorpo secundário de cabra anti-coelho HRP para uma diluição 1:5000 em tampão de bloqueio, adicionar 100 μl por poço para as placas de de microtitulação; e incubar 1 h na RT.
5. Detecção quimioluminescente
   1. 30 min antes do final do Step 5.4.7. e condições de luz suave, misture partes iguais de luminol-Enhancer e solução de peróxido (10,5 mL: 10,5 mL, para 2 placas) em um frasco de âmbar e deixá-lo em RT.
      Nota: Mantenha a solução de trabalho luminol numa garrafa de âmbar e evite a exposição prolongada a qualquer luz intensa. A exposição a curto prazo à iluminação laboratorial típica não prejudicará a solução de trabalho.
   2. Pelo menos 20 minutos antes de medir a luminescência, ligue o leitor de microplacas a 25 ° c e configure leituras para 1.000 MS tempo de integração e 150 ms resolver tempo. As configurações de parâmetros podem exigir otimização em função do instrumento.
   3. Após 1 h de incubação em Step 5.4.7., descarte a solução de anticorpos secundários e lave as placas 6 vezes com tampão de lavagem.
   4. Pipetar 100 μL por poço da solução de trabalho luminol (substrato quimioluminescente) preparada na etapa 5.5.1. Pipeta muito lentamente e evite a formação de bolhas. Use um temporizador para controlar o tempo entre a adição da adição da solução e a medida da luminescência das placas e mantenha este tempo constante para conseguir uma boa reprodutibilidade inter do ensaio.
   5. Top-selar as placas e centrifugar a 500 x g em RT para 45 s em um centrifugador da placa para eliminar todas as bolhas restantes. Incubar as placas por 1 min em um agitador de chapa a 100 RPM.
   6. Insira a placa dentro do leitor e deixe-a por 3 min para estabilizar a temperatura a 25 ° c (sem película adesiva). Comece sempre com a placa de ELISA livre.
   7. Leia as unidades de luminescência relativa (RLU) de cada ensaio de Placa ELISA (livre e total de KDM1A).
   8. Salve e copie os valores brutos de RLU dos arquivos de Excel de dados brutos para análise posterior dos resultados.

6. cálculo do engajamento alvo

1. Em um software de planilha, calcule os valores RLU Free e RLU total de amostras S_X e amostras de referência ref (não tratada, veículo ou pré-dose amostra) de sua técnica replicar dados brutos conforme detalhado abaixo:
   1. Insira os dados RAW rlui total e RAW rlui individuais de espaços em branco, curva padrão, controles negativos C-e amostras biológicas (S_X e ref) na folha de dados de análise (por exemplo, Excel). Também, incorpore os montantes (no PG) de KDM1A da curva padrão no datasheet.
   2. Calcule o RLU médio cru, os desvios padrão σ_RLU, e o coeficiente da variação CV_RLU dos dados crus totais e crus livres individuais de rlui para cada DataPoint técnico da réplica.
   3. Aplique a eliminação de outlier (exemplo para triplicates): para cada rlui cru individual e cru RLU do ponto de dados livre de um ponto de DataPoint técnico do triplicado, aplique critérios de Grubbs quando o CV para o triplicado > 0,15, e rejeite o único valor cru do RLU do suspeito Quando
      ,
      por meio de Z = 1,148 para n = 3 e 90% de intervalo de confiança (IC).
   4. Se a eliminação de outlier foi aplicada, re-calcular o RAW média RLU, desvio padrão σ RLU e CV_RLU do não-rejeitado (NR) RAW Rlui total e RAW rlui Free valores para cada DataPoint.
   5. Aplique a correção de plano de fundo: Calcule os valores médios RLU Free e RLU total para cada amostra padrão e cada amostra S_X e referência de exemplo ref como:
      
      
2. Represente graficamente os dados da seguinte forma:
   1. Plotar os valores RLU_Free e RLU_total (eixo Y) em relação à sua identificação de exemplo (eixo X) em um gráfico de barras.
   2. Também plotar os valores de RLU (eixo Y) dos padrões em um gráfico de dispersão em relação à sua quantidade de PG de proteína rKDM1A (eixo X) para medições gratuitas e totais, bem como as linhas de tendência lineares correspondentes e calcular o r² (o quadrado do linear coeficiente de correlação).
3. Calcule o engajamento de destino (TE); ou seja, a percentagem de KDM1A associada ao inibidor da KDM1A em cada amostra S_X em relação a uma amostra de referência ref (não tratada, veículo ou pré-dose) da seguinte forma:
   1. Calcule a razão R da média RLU livre para total de valores para o SX e REF amostras como:
      
      
   2. Em seguida, calcule o engajamento de destino (TE) da amostra S_X como:
      
      Opcional: (1) se experimentos de repetição biológica N foram conduzidos, cada um com n repetições técnicas; primeiro Calcule o TE_SX para os conjuntos de replicação técnica. Posteriormente, calcule os valores médios de TE, SD e CV para o conjunto de replicantes biológicos.
4. Rever se os critérios de aceitação do ensaio são cumpridos: Verifique se (1) o fundo do ensaio é aceitável e a média em branco < 0, 5 x 10⁷ RLU; (2) a autoluminescência da amostra está ausente e os RLUs dos controles negativos C-estão abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ = média em branco + 10x DP); (3) a curva padrão rKDM1A é linear e R2 ≥ 0,98; (4) as amostras biológicas têm valores de RLU que caem na faixa dinâmica e linear do ensaio, ou seja, entre LLOQ e 2.500 PG/poço.
   Nota: passos 6,1. a 6,4. pode ser prontamente automatizado em uma folha de dados de cálculo.
5. Exporte os dados de TE para uma fonte aberta ou software de estatística obtido comercialmente de escolha para a representação gráfica dos valores de TE e avaliações estatísticas adicionais.

Resultados

A linearidade da determinação KDM1A total e livre.

Uma série padrão foi preparada conforme descrito na etapa 5.3.2., usando 0 a 2500 PG de enzima recombinante humana KDM1A de comprimento total. Os valores de RLU de rKDM1A total e livre foram avaliados para verificar a linearidade (Figura 2a e 2B). Os dados são representados como média a partir de 3 experimento...

Discussão

O protocolo apresentado aqui foi desenvolvido para medir diretamente o engajamento alvo de KDM1A usando um romance KDM1A com base na captura de quimiosonda ELISA. O método foi validado em linhagens de células humanas cultivadas e amostras ex vivo de humano, rato e rato e babuíno (incluindo PBMCs, pulmão, cérebro, pele, tumores), mas pode ser prontamente aplicada a outras espécies em que o anticorpo KDM1A resumos alvo e catalítico Centro são conservadas. Como OG-881 é um quimioprobe baseado na atividade, a qualid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Trypsin-EDTA (1X)	Thermo Scientific	#25300-062
10 X Protease Inhibitor Tablets	Roche	#11836153001
96 deep well storage block	VWR	#734-1679
96 well ELISA plates	Nunc	#436110
Adhesive black Film	Perkin Elmer	#6050173
Adhesive transparent Film	VWR	#60941-062
Biotinylated KDM1A probe OG-881	Oryzon Genomics S.A.	NA
Bovine Serum Albumin	Sigma	# 3117057001
Bovine Serum Albumin Standard	Thermo Scientific	#23208)
Bradford Protein Assay	BioRad	#500-0001
Cell lysis buffer 10X	Cell Signaling	#9803
Centrifuge for 96- well plates	Hettich	Rotina 420R
Flask	Thermo Scientific	#156499
Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A	Active Motif	#31426
Graphpad Prism 5 Project	GraphPad Software	NA
Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)	Thermo Scientific	#37074
Micro Centrifuge	Eppendorf	5415 R
Microplate reader Infinite 200-Tecan	Tecan	Infinite 200
Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)	Abcam	#ab53269
Needle G18 gauge blunt	BD	#303129
ORY-1001 (iadademstat)	Oryzon Genomics S.A.	NA
PBMC separation tubes 10 ml	Greiner bio-one	#163288
PBMC separation tubes 50 ml	Greiner bio-one	#227288
PBS 1x	Sigma	#D8537
Plate shaker	Heidolph Instruments	Rotamax 120
Polysorbate 20	Sigma	#P7949
Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)	Cell Signaling	#672184BF-100
Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	#31458
Spectrophotometer cuvette 1.5	Deltalab	#302100
Spectrophotometer for cuvette	GE Healthcare	GeneQuant 1300
Streptavidin	Promega	#Z704A
Syringe	BD	#303172
Type 1 ultrapure water	Millipore	Milli-Q Advantage A10
Ultrasonic cleaner	VWR	USC200T