É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Method Article
Aqui, apresentamos um protocolo para medir KDM1A engajamento alvo em uma célula humana ou animal, tecido ou amostras de sangue tratadas com inibidores da KDM1A. O protocolo emprega a marcação do chemoprobe da enzima livre de KDM1A e a quantificação direta da ocupação do alvo usando immunoensaios quimioprobe-baseados e pode ser usada em estudos pré-clínicos e clínicos.
A avaliação do engajamento alvo, definida como a interação de um fármaco com a proteína para a qual foi projetada, é um requisito básico para a interpretação da atividade biológica de qualquer composto no desenvolvimento de fármacos ou em projetos de pesquisa básica. No Epigenetics, o acoplamento do alvo é avaliado o mais frequentemente pela análise de marcadores do proxy em vez de medir a União do composto ao alvo. Os leituras biológicos a jusante que foram analisados incluem a modulação da marca do histona ou as mudanças da expressão de Gene. KDM1A é uma desmetililase de lisina que remove grupos metilo de mono e H3K4 dimetilizados, uma modificação associada ao silenciamento da expressão gênica. A modulação dos marcadores do proxy é dependente do tipo e da função da pilha da make-up genética das pilhas investigadas, que pode fazer a interpretação e a comparação do Cruz-caso completamente difícil. Para contornar estes problemas, um protocolo versátil é apresentado para avaliar os efeitos da dose e a dinâmica do acoplamento direto do alvo de KDM1A. O ensaio descrito faz uso de uma quimiosonda KDM1A para capturar e quantificar a enzima desinibida, pode ser amplamente aplicada a células ou amostras de tecido sem a necessidade de modificação genética, tem uma excelente janela de detecção, e pode ser usado tanto para pesquisa básica e análise de amostras clínicas.
O demetilase específico 1 de lysine (KDM1A)1 é um demetilase envolvido no controle da transcrição do gene. Esta proteína emergiu como um alvo farmacológico candidato2 em Oncologia; incluindo leucemia mielóide aguda3 (AML), síndrome de mielodisplasia (MDS)4, mielofibrose (MF)5,6, câncer de pulmão de pequenas células (SCLC)7; em doença falciforme (SCD)8,9, e em doenças do sistema nervoso central, incluindo a doença de Alzheimer (AD), esclerose múltipla (MS); e na agressão10.
A maioria dos compostos inibidores da KDM1A no desenvolvimento clínico são derivados da ciclopropilamina e inibem a proteína por ligação covalente ao seu cofator11de flavina-dinucleotídeo (FAD). A inibição da KDM1A induz alterações na expressão gênica, mas essas alterações variam enormemente nos tecidos, tipos de células ou casos de doença. A inibição da KDM1A também altera as marcas de histona12, mas essas mudanças são geralmente produzidas localmente em um local específico no genoma, e são novamente, altamente tecido e células específicas.
O protocolo foi desenvolvido para medir diretamente o engajamento alvo de KDM1A em amostras biológicas e foi otimizado para o uso com inibidores derivados da ciclopropilamina. O ensaio é baseado na tecnologia ELISA e analisa, em paralelo, total e livre (ou seja, não acoplado por inibidor) KDM1A em um extrato de proteína nativa de uma amostra biológica em um ensaio de fase sólida. Como primeiro passo, a amostra biológica é lisada na presença da quimiosonda seletiva biotinilada KDM1A og-88113,14, derivada do inibidor seletivo KDM1A Ory-1001 (iadademstat), um potente inibidor da KDM1A em clínica desenvolvimento para o tratamento da doença oncológica. O chemoprobe tem um IC50 para KDM1A de 120 nanômetro e inclui um metade obrigatório do FAD lig a um polietileno biotinylated glicol (PEG)-cauda. A quimiosonda liga-se exclusivamente à KDM1A livre, mas não à KDM1A associada ao inibidor na amostra. Após a ligação do chemoprobe, os KDM1A que contêm complexos na amostra são capturados em placas do de microtitulação com a superfície revestida estreptavidina para determinar o KDM1A livre, ou em placas revestidas com um anticorpo KDM1A monoclonal da captação para determinar o KDM1A total. Após a lavagem, ambas as placas são incubadas com um anticorpo de detecção KDM1A, lavadas novamente, e incubadas com um anticorpo de IgG anticoelho conjugado HRP secundário para detecção usando um substrato luminescente e quantificação por medição relativa de luz (RLU) num luminômetro (Figura 1).
Figura 1. Esquema de ELISA enzima lig o ensaio immunoabsorvente do chemoprobe para o acoplamento do alvo KDM1A: A) determinação do total KDM1A usando o sanduíche ELISA e B) determinação do KDM1A livre usando o quimioprobe Elisa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Uma curva padrão é incluída em ambas as placas ELISA para verificar a linearidade de cada ensaio. A determinação do engajamento alvo de KDM1A em cada amostra é então calculada como um valor relativo para a amostra pré-dose ou tratada pelo veículo.
Amostras de sangue foram obtidas do Instituto de Investigación biomédica Sant Pau biobank de acordo com a legislação espanhola (Real Decreto de biobancos 1716/2011) e aprovação dos comitês de ética locais. Estudos com tecidos animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório (diretiva do Conselho das Comunidades Europeias 86/609/CEE), instituído pelo Comitê de ética para experimentação animal no PRAAL-PCB.
1. preparação de amostras biológicas para o ensaio.
PRECAUÇÃO: Este protocolo envolve a manipulação de amostras biológicas que podem ser submetidas à norma de patógenos de sangue (29 CFR 1910,1030), da administração de segurança e saúde ocupacional (OSHA), da Directiva 2000/54/CE do Parlamento Europeu e do Conselho de 18 de setembro de 2000 ou regulamentos equivalentes. Além disso, as amostras biológicas podem conter traços de compostos químicos experimentais biologicamente ativos e o protocolo pode envolver uma maior manipulação desses compostos. Reveja a ficha de dados de segurança (SDS) dos compostos utilizados antes do início do experimento e respeite rigorosamente todas as medidas de segurança aplicáveis estabelecidas no centro de investigação, incluindo a utilização de equipamento de protecção individual (EPI) adequado. Use vestuário de proteção adequado e usar blindagem adequada durante o curso do experimento. Descarte resíduos nos recipientes de resíduos apropriados (resíduos biológicos/citotóxicos).
Nota: Este protocolo começa com células ou amostras de indivíduos tratados com um inibidor da KDM1A e os seus controlos não tratados ou de veículo/placebo3.
2. preparação da solução
3. extração de proteínas nativas
4. quantificação da proteína nativa utilizando o ensaio de Bradford
5. luminescente ELISAs para total e livre KDM1A determinação
Nota: Mantenha a temperatura do laboratório constante a 23-24 ° c (RT).
SÉRIE PADRÃO | KDM1A solução de trabalho padrão (μL) | |
(PG KDM1A/bem) | PBS (μL) | |
2500 para C-* | 800 | - |
2500 | 800 | - |
1750 | 560 | 240 |
1250 | 400 | 400 |
750 | 240 | 560 |
250 | 80 | 720 |
25 | 8 | 792 |
0 | 0 | 800 |
Nota: | ||
(1) o volume preparado de cada diluição é suficiente para ser executado em triplicado 2 placas de ensaio. | ||
(2) a faixa recomendada é entre 2,5 e 5.000 PG/bem | ||
* Para o controle negativo C-, sem anticorpo da deteção de KDM1A |
Tabela 1: preparação padrão. Para preparar a série padrão de proteína KDM1A, pipeta os volumes indicados de KDM1A solução de trabalho padrão e PBS em oito tubos de microcentrífuga de 1,5 mL devidamente rotulados.
Tabela 2: projeto profundo da placa do poço. Padrões (azul) e amostras (amarelo) a partir do passo 5.4.2. foram pipetadas nas posições refletidas da placa de poço profundo para facilitar o carregamento nas placas ELISA seguindo a direção das setas azul (padrão) e amarela (amostras). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela 3: projeto da placa de Elisa. A placa do ensaio inclui a curva padrão com quantidades de diminuição do alvo KDM1A de recombinação (no azul); as amostras biológicas (S) em amarelo; e os controles negativos correspondentes (contêm as amostras mas não o anticorpo preliminar da deteção) no branco, a ser carregados nas placas de ELISA da placa do poço profundo. O espaço em branco (0 na curva padrão) contém todos os reagentes de captura e detecção, mas nenhuma amostra. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
6. cálculo do engajamento alvo
A linearidade da determinação KDM1A total e livre.
Uma série padrão foi preparada conforme descrito na etapa 5.3.2., usando 0 a 2500 PG de enzima recombinante humana KDM1A de comprimento total. Os valores de RLU de rKDM1A total e livre foram avaliados para verificar a linearidade (Figura 2a e 2B). Os dados são representados como média a partir de 3 experimento...
O protocolo apresentado aqui foi desenvolvido para medir diretamente o engajamento alvo de KDM1A usando um romance KDM1A com base na captura de quimiosonda ELISA. O método foi validado em linhagens de células humanas cultivadas e amostras ex vivo de humano, rato e rato e babuíno (incluindo PBMCs, pulmão, cérebro, pele, tumores), mas pode ser prontamente aplicada a outras espécies em que o anticorpo KDM1A resumos alvo e catalítico Centro são conservadas. Como OG-881 é um quimioprobe baseado na atividade, a qualid...
A autora Tamara Maes é diretora executiva e acionista, e os autores Cristina Mascaró e Raquel Ruiz Rodriguez são funcionários da ORYZON Genomics S.A. ORYZON Genomics S.A. desenvolve inibidores da KDM1A e detém patentes abrangendo compostos e métodos utilizados Neste artigo.
Este estudo foi financiado pela ORYZON Genomics. S.A., Hoffman-la Roche, e parcialmente apoiada pelo programa de colaboração CIIP-20152001 e RETOS RTC-2015-3332-1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
Streptavidin | Promega | #Z704A | |
Syringe | BD | #303172 | |
Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados