Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы представляем протокол для измерения участия kDM1A в клетках человека или животного, тканях или образцах крови, обработанных ингибиторами KDM1A. Протокол использует хемозонд маркировки свободного фермента KDM1A и прямой количественной оценки целевого занятия с использованием химиозонда на основе иммуноанализов и могут быть использованы в доклинических и клинических исследованиях.
Оценка целевого взаимодействия, определяемого как взаимодействие препарата с разработанным для него белком, является основным требованием для интерпретации биологической активности любого соединения при разработке лекарств или в фундаментальных исследовательских проектах. В эпигенетике целевое взаимодействие чаще всего оценивается путем анализа прокси-маркеров вместо измерения соединения с целью. Ниже по течению биологических считывания, которые были проанализированы включают гистон знак модуляции или изменения экспрессии генов. KDM1A является лизин деметилаза, которая удаляет метиловые группы из моно- и диметилированного H3K4, модификация, связанная с глушинием экспрессии генов. Модуляция прокси-маркеров зависит от типа клеток и функции генетического состава исследуемых клеток, что может сделать интерпретацию и сравнение кросс-кейса довольно трудным. Для обхода этих проблем представлен универсальный протокол для оценки эффектов дози и динамики прямого целевого взаимодействия КДМ1А. Анализ описано использует KDM1A хемозонд для захвата и количественно раскованный фермент, может быть широко применяется к клеткам или образцам тканей без необходимости генетической модификации, имеет отличное окно обнаружения, и может быть использован как для фундаментальных исследований и анализ клинических образцов.
Лизин специфическая деметилаза 1 (KDM1A)1 является деметилазой, участвующих в контроле транскрипции генов. Этот белок стал кандидатом фармакологических целевой2 в онкологии; в том числе острый миелоидный лейкоз3 (AML), Синдром миелодисплазии (MDS)4, миелофиброз (MF)5,6, Малый рак легких (SCLC)7; при серповидно-клеточной болезни (SCD)8,9, и при заболеваниях центральной нервной системы, включая болезнь Альцгеймера (Ад), рассеянный склероз (Ms); и в агрессии10.
Большинство ингибирующих соединений KDM1A в клиническом развитии являются производными циклопропиламина и ингибируют белок ковалентным связыванием с его лавина аденин динуклеотид (FAD) кофактор11. Ингибирование KDM1A вызывает изменения экспрессии генов, но эти изменения сильно различаются по тканям, типам клеток или случаям заболевания. Ингибиция KDM1A также изменяет признаки гистона12, но эти изменения, как правило, производятся локально на определенном участке в геноме, и снова, высоко ткани и клеток конкретных.
Протокол был разработан для непосредственного измерения целевого участия KDM1A в биологических образцах и был оптимизирован для использования с ингибиторами производных циклопропиламина. Анализ основан на технологии ELISA и анализирует, параллельно, Total и Free (т.е. не связанный ингибитором) KDM1A в родном белковом экстракте из биологического образца в твердой фазе анализа. В качестве первого шага, биологический образец лизируется в присутствии биотинилапопром KDM1A селективного хемозонда OG-88113,14, полученных из селективного ингибитора KDM1A ORY-1001 (iadademstat), мощный ингибитор KDM1A в клинических развитие для лечения онкологических заболеваний. Химиозонд имеет IC50 для KDM1A 120 нм и включает в себя ФАД связывающий муаети, связанный с биотинилатированным полиэтиленовым гликолем (PEG).-хвост. Химиозонд исключительно связывается с свободным KDM1A, но не с ингибитором KDM1A в образце. После привязки хемозонда, KDM1A, содержащие комплексы в образце, фиксируются на микротитерных пластинах с стрептавидиновой поверхностью с покрытием для определения свободного KDM1A, или на пластинах, покрытых моноклональным анти-KDM1A захвата антитела для определения общего KDM1A. После мытья, обе пластины инкубируются антителами обнаружения к KDM1A, промывают снова и инкубируются вторичным HRP-конъюгированным антикроликом IgG антитела для обнаружения с помощью люминесцентного субстрата и количественной оценки путем измерения относительного световые единицы (RLU) в люминометре(рисунок 1).
Рисунок 1. Схема ELISA Enzyme связана химиозонд иммуноабсорбент анализа для KDM1A целевого участия: A) Определение общего KDM1A с использованием бутерброда ELISA и B) Определение бесплатного KDM1A с использованием химиозонда ELISA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Стандартная кривая включена в обе пластины ELISA для проверки линейности каждого анализа. Определение целевого участия KDM1A в каждой выборке затем рассчитывается как относительная стоимость предварительной дозы или образца, обработанного транспортным средством.
Образцы крови были получены из Института investigacion Biom'dica Sant Pau Biobank в соответствии с испанским законодательством (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) и одобрения местных комитетов по этике. Исследования с тканями животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных (Директива Совета Европейских сообществ 86/609/EEC), установленных Этическим комитетом по экспериментам на животных ПРААЛ-ПКБ.
1. Подготовка биологических образцов для проведения асссе.
ВНИМАНИЕ: Этот протокол включает в себя манипуляции биологических образцов, которые могут быть подвергнуты профессиональной безопасности и здоровья администрации (OSHA) Крови Борн патогенов стандарт (29 CFR 1910.1030), Директива 2000/54/EC Европейского парламента и Совет от 18 сентября 2000 года или эквивалентные правила. Кроме того, биологические образцы могут содержать следы биологически активных исследуемых химических соединений, а протокол может предусматривать дальнейшие манипуляции такими соединениями. Просмотрите лист данных о безопасности (СДС) соединений, используемых до начала эксперимента, и строго соблюдайте все применимые меры безопасности, установленные в исследовательском центре, включая использование надлежащего средств индивидуальной защиты (СИЗ). Носите надлежащую защитную одежду и используйте надлежащее экранирование в ходе эксперимента. Отбрасывайте остатки в соответствующих контейнерах для отходов (биологические/цитоттоксичные отходы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол начинается с клеток или образцов субъектов, обработанных ингибитором KDM1A и их необработанных или транспортного средства / плацебо обработанных элементовуправления 3.
2. Подготовка решения
3. Родная экстракция белка
4. Количественная оценка родного белка с использованием Брэдфордского анализа
5. Люминесцентные ELISA для total и свободного определения KDM1A
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите температуру в лаборатории постоянной на уровне 23-24 градусов по Цельсию (RT).
СТАНДАРТНАЯ СЕРИЯ | Стандартное рабочее решение KDM1A (Зл) | |
(pg KDM1A/well) | PBS (КЛ) | |
2500 за C- | 800 | - |
2500 г. | 800 | - |
1750 год | 560 г. | 240 г. |
1250 г. | 400 | 400 |
750 г. | 240 г. | 560 г. |
250 г. | 80 | 720 г. |
25 | 8 | 792 год |
0.00 | 0.00 | 800 |
Примечание: | ||
(1) Объем подготовлен каждого разбавления достаточно, чтобы работать в тройной 2 пластины асссе. | ||
(2) Рекомендуемый диапазон составляет от 2,5 до 5000 пг / хорошо | ||
Для отрицательного контроля C-, без антитела обнаружения KDM1A |
Таблица 1: Стандартная подготовка. Для подготовки стандартной серии белка KDM1A, pipette указанные объемы KDM1A Стандартный рабочий раствор и PBS в восемь правильно помечены 1,5 мл микроцентрифуговых труб.
Таблица 2: Глубокий дизайн плиты. Стандарты (синий) и образцы (желтый) от шага 5.4.2. были пипсированы в отраженные позиции Deep Well Plate для облегчения загрузки в пластины ELISA по направлению синих (стандартных) и желтых (образцов) стрелок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Таблица 3: Дизайн плиты ELISA. Пластина асссея включает стандартную кривую с уменьшением количества рекомбинантной цели KDM1A (синим цветом); биологические образцы (S) желтым цветом; и соответствующие отрицательные элементы управления (содержат образцы, но не первичное обнаружение антитела) в белом, которые будут загружены на пластины ELISA из Deep Well Plate. Пустой (0 в стандартной кривой) содержит все реагенты захвата и обнаружения, но не образец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
6. Расчет целевого участия
Линейность определения Total и Free KDM1A.
Стандартная серия была подготовлена, как описано в шаге 5.3.2., используя от 0 до 2500 пг полнометражного человеческого рекомбинантного фермента KDM1A. Значения RLU Total и Free rKDM1A были оценены для провер...
Представленный здесь протокол был разработан для непосредственного измерения целевого взаимодействия KDM1A с помощью нового хемозонда KDM1A, основанного на ELISA. Метод был проверен на культивированных человеческих клеточных линий и ex vivo образцов из человека, крысы и мыши и бабуина (в том чи?...
Автор Тамара Маес является исполнительным директором и акционером, а авторы Кристина Маскаре и Ракель Руис Родригес являются сотрудниками Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. разрабатывает ингибиторы KDM1A и имеет патенты, охватывающие соединения и методы, используемые в этой статье.
Это исследование было профинансировано Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, и частично поддерживается CIIP-20152001 и RETOS программы сотрудничества RTC-2015-3332-1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
Streptavidin | Promega | #Z704A | |
Syringe | BD | #303172 | |
Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены