المعدلة المغايرة الأوستيوميوكوتانيوس رفرف النموذج في الفئران لنقل الاوعيه الدموية المركبة المركب البحوث

Summary

الطعم المركب الاوعيه الدموية يقدم فوائد تغيير الحياة لمتلقي الزراعة ، ولكن الأسباب البيولوجية لرفض الكسب غير المزروع واعتلال الاوعيه الدموية لا تزال غير مفهومه بشكل سيئ. يقدم نموذج القوارض الجراحي المعروض هنا نموذجا قابلا للتكرار وذي صله سريريا للزرع ، مما يسمح للباحثين بتقييم احداث الرفض والاستراتيجيات العلاجية المحتملة لمنع حدوثها.

Abstract

زراعه الاوعيه المركبة الوعائية (VCA) هو حقل جديد نسبيا في الجراحة الترميمية. وتشمل الإنجازات السريرية في VCA البشرية زرع اليد والوجه ، وفي الاونه الاخيره ، جدار البطن ، والرحم ، وزرع الأعضاء التناسلية البولية. وقد تجاوزت النتائج الوظيفية التوقعات الاوليه ، ويتمتع معظم المستفيدين بتحسين نوعيه الحياة. ومع ذلك ، كما تتراكم التجربة السريرية ، يجب معالجه الرفض المزمن والمضاعفات من كبت المناعة. في كثير من الحالات حيث فشلت الطعوم ، وكان المرض المسبب اعتلال الاوعيه الدموية الدماغية. أليات البيولوجية للرفض الحاد والمزمن المرتبطة ب VCA ، وخاصه اعتلال الاوعيه الدموية الدماغية ، هي مجالات مهمة للبحوث. ومع ذلك ، ونظرا للعدد القليل جدا من مرضي VCA ، فان تقييم أليات المقترحة يتم تناوله بشكل أفضل في نموذج تجريبي. وقد استخدمت مجموعات متعددة نماذج حيوانيه لمعالجه بعض الاسئله ذات الصلة التي لم تحل في الرفض VCA واعتلال الاوعيه الدموية. ويرد في الأدبيات وصف للعديد من التصاميم النموذجية التي تشمل مجموعه متنوعة من الأنواع. هنا نقدم نموذجا استنساخه من VCA أوستيوميوكوتانيوس رفرف المؤخر في الفئران التي يمكن استخدامها للبحوث VCA متعديه. هذا النموذج يسمح للتقييم التسلسلي لكسب الطعم ، بما في ذلك الخزعات وطرائق التصوير المختلفة ، مع الحفاظ علي مستوي منخفض من الاعتلال.

Introduction

الجراحة الترميمية لفقدان الانسجه الكارثية من البتر ، وإصابات الانفجار ، والأورام الخبيثة ، والعيوب الخلقية محدوده بتوافر الانسجه من المريض والاعتلال الإضافي الذي يحدث في موقع المتبرع. وفي بعض الحالات ، مثل ضحايا الحروق أو المبتورين الرباعيين ، لا تتوفر الانسجه القابلة للاستمرار لأعاده البناء من المريض. في 1964 ، تم اجراء أول عمليه زراعه يدوية حديثه في الإكوادور. في حين ان هذا كان نجاحا تقنيا ، كان كبت المناعة المتاحة في ذلك الوقت غير كافيه لمنع الرفض ، وفقدت الكسب غير المناسب في اقل من 3 أسابيع¹. في 1998 و 1999 ، تم اجراء عمليات زرع اليد الاولي في العصر الحديث من كبت المناعة في ليون ، فرنسا² ولويزفيل ، كنتاكي ، الولايات الامريكيه³. للمرة الاولي يمكن للجراحين الترميميين ان يستبدلوا مثلهم أجريت عمليه زرع الوجه لأول مره في 2005⁴، ويتم الآن اجراء عدد من الطعوم vca الأخرى بشكل روتيني ، مثل جدار البطن⁵، الرحم ، وزرع الأعضاء التناسلية البولية⁶.

وعلي عكس زرع الأعضاء الصلبة ، فان معظم تقنيات VCA تنطوي علي وجود بشره المتبرعين التي لا مثيل لها للغاية. وقد قررت التجربة السريرية ان الرفض الحاد للجلد من السهل نسبيا للسيطرة ولكن قد تسهم في الرفض المزمن للانسجه الاساسيه والاوعيه الدموية ، والتي لا تستجيب بشكل جيد للعلاج⁷. خلل الاوعيه الدموية المرتبطة بالاستجابة المناعية هو عقبه أكثر المشؤومة لمجال VCA⁷. يؤدي الاعتلال الوعائي الكلي إلى نقص التروية ، والشفاء المتاخر ، والظروف التهابيه. كل من متموج العدوانية كبير وعاء الاوعيه الدموية وفرط تنسج البؤرية تحدث في المتلقيين زرع اليد⁷. بالاضافه إلى ذلك ، من المرجح ان تساهم الاوعيه المجهرية في مضاعفات VCA أيضا وقد تؤدي إلى احداث الرفض. في حين ان العوامل المناعية وغير المناعية علي الأرجح تلعب دورا في اعتلال الاوعيه الدموية من المتلقيين زرع اليد ، واليات المحددة التي تروج لضعف الاوعيه البعيدة في VCA ليست معروفه ، ولا سيما في سياق الرفض المزمن المنخفض الدرجة. هذه الاسئله التي لم يتم الرد عليها تستلزم تطوير نموذج VCA الحيوانية التي من شانها ان تسمح للتقييم التسلسلي لكسب الطعم خلال الدورة السريرية لرفض VCA/الصيانة واعتلال الاوعيه الدموية. مثل هذا النموذج سوف تقدم رؤى في الرفض واعتلال الاوعيه الدموية في مواجهه كبت المناعة, التحدي المعدية, و/أو غيرها من الإصابات الرضية بعد الجراحة^8,9.

المعروض هنا هو الفئران المخلوطة VCA مغاير أوستيوميوكوتانيوس رفرف المؤخر نموذج. استنادا إلى نماذج VCA المنشورة سابقا ، هذا الاجراء من السهل تقنيا لأداء ، استنساخها في عدد كبير ، ويسلك الحد الأدنى من الاعتلال وعدم الراحة للحيوان المتلقي. تم تصميم هذا النموذج للسماح التقييمات السريرية والمرضية للقبول VCA مقابل الرفض ، ويوفر فرصه لتقييم أليات المناعية وغير المناعية الكامنة المشاركة في الرفض.

Protocol

وأجريت جميع العمليات الجراحية الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه لويزفيل (IACUC-البروتوكول المعتمد 18198) والمعاهد الوطنية للصحة (المعهد القومي للصحة) دليل لرعاية واستخدام المختبر الحيوانية¹⁰. ذكر براون-النرويج البالغ من العمر أربعه أشهر (RT1. Aⁿ) و 4 شهرا من العمر الذكور لويس (RT1. (ا) استخدمت الجرذان باعتبارها من المتبرعين والمتلقيين علي التوالي.

1. حصاد المتبرع بالطعم

1. Sedate الحيوانية المانحة باستخدام الايزوفلوان المبخر تطبيقها من خلال غرفه.
2. حلق المنطقة المانحة غير المزروعة بالطعم (المؤخر) ، فضلا عن مناطق الفخذ والبطن. بعد ذلك ، علاج مع كريم مزيل الماكياج من أجل الحد من كميه زغب التي تركتها المقص.
3. التخدير العميق للحيوانات المتبرعة باستخدام الكيتامين داخل الصفاق (60 ملغم/كغ)/اكسيليازين (15 ملغم/كغ)/اسيبروزين (2 ملغم/كغ). أداره جرعه أوليه من 0.2 مل/100 غرام من وزن الجسم وجرعات اضافيه من 0.2 مل كل h. للراحة ، هو اختياري لتنفيذ هذه الخطوة قبل الخطوة 2.
4. مراقبه الكائنات باستمرار اثناء التخدير للتنفس ، ودرجه حرارة الجسم ، وعمق التخدير ، وذلك باستخدام اصبع القدم اختبار منعكس الانسحاب.
5. أداره 30 U من محلول الهيبارين جلد (SC) في منطقه التوفف قبل الجراحة لمنع تخثر.
6. ارتداء قناع ، غطاء الراس ، ثوب العزلة القابل للتصرف ، والقفازات القابل للتصرف.
7. وضع ضعيف الحيوانية المانحة علي وساده التدفئة. إنتاج حقل جراحي معقم عن طريق الاستعداد ، والتنظيف ، واللف بالمنطقة الجراحية بما في ذلك الجوانب البطنية والظهرية للساق. دون قفازات معقمه.
8. اجراء شق الجلد 3 سم في الإيجاز الفخذ باستخدام شفره مشرط #15 وتعكس لوحه الدهون الاربيه أفقيا باستخدام مقص القزحية.
9. فضح الاوعيه الفخذية المشتركة ووضع هوك سلك مع شريط مطاطي لسحب عضلات البطن.
10. باستخدام مجهر تشريح (40x) ، تشريح القمل القريب من ظهور الاوعيه الفخذية المشتركة تحت الرباط الاربي وبشكل منتفخ إلى التقاء الاوعيه الدموية في الطعم.
11. باستخدام المشابك المجهرية وملقط المجوهرات ثنائي القطب ، يعرق ويقسم الفروع الشريانية والوريدية الكبيرة ، مثل الاوعيه الفخذية الجانبية الدائرية ، والاوعيه الدموية الشرسوفي السطحية ، والشريان السهينيوس ، والاوعيه الفخذية القريبة الفخذ ، لتعبئة الاوعيه الفخذية الرئيسية. كوي اي فروع صغيره باستخدام ملقط ثنائي القطب غرامه.
12. جعل شق الجلد من وسط الجلد السابق قطع علي طول الجانب البطني من الطرف السفلي ، إلى منطقه الكاحل ، وذلك باستخدام مقص القزحية.
13. قطع العضلات المقربة ، وكذلك العضلات الأخرى تحته ، بطريقه عموديه لفضح وربط الاوعيه الوسطي الإنسي القريبة ، والاوعيه الصغيرة المتفرعة العميقة ، والعصب الوركي.
    ملاحظه: عند هذه النقطة ، علي طاوله جراحيه منفصلة ، يجب علي الجراح الآخر ان يستشعر وتخدير (2.5 ٪-3 ٪ ايزوفلواني) الحيوانية المتلقية. وهذا يسمح للجراحين لاعداد موقع الجراحية المتلقي في الوقت المناسب لوضع الكسب غير المزروع وتقليل الوقت الدماغية الكسب غير المناسب.
14. علي الحيوانية المانحة ، وجعل شقوق الجلد المحيط الهي علي مستوي الركبة والكاحل. فك الركبة والكاحل ، وأزاله العضلات الدخيلة والانسجه ، واجراء شق الجلد العمودي علي الجانب الظهري من الطرف السفلي لتحرير الطعم. عند هذه النقطة ، يتم توصيل الطعم (تتالف من القصبات والساق ، مغطاه العضلات ذات الصلة والجلد الجزيرة التي تغذيها الثقوب لها) فقط من قبل عنله.
15. ضع المشابك الصغيرة كاقرب ما يمكن علي الشريان والوريد الفخذي ، واقطع القمل كاقرب ما يمكن ، بالقرب من الرباط الاربي.
16. لمسح الطعم من الدم ، حقن المحلول الملحي heparinized (30 U/mL) في الشريان الفخذي باستخدام 27 غراما من التنظيف الحاد cannula.
    ملاحظه: ان التوسع في الشريان قبل تدفق الهيبارين يسمح بسهوله الوصول لإدخال الكانولا. خلال تدفق ، تراقب عن كثب التدفق من الوريد الفخذي. عندما يخرج السائل الصافي من الوريد الفخذي ، أوقف التدفق.
17. التفاف الطعم المعزول في الشاش الدافئة المالحة غارقه ونقلها علي الفور إلى طاوله الحيوانية المتلقي. في هذا الوقت ، يجب ان يكون الموقع الجراحي المتلقي بالفعل علي استعداد لاناستمام الاوعيه الدموية.
18. بعد حصاد الكسب غير المزروع ، موت ببطء فورا الفئران المتبرعة عن طريق استرواح الصدر.

2. جراحه زرع المستلم

1. بعد الاستقراء التخدير باستخدام الايزوفلوان المبخر المطبقة من خلال غرفه ، تخدير عميق الحيوانية المتلقية عن طريق أنبوب الرغامي التي تسيطر عليها التنفس الاصطناعي و 2.5 ٪-3 ٪ ايزوفلواني.
   ملاحظه: وفي هذه المرحلة ، لا يزال الفار المتبرع بالتخدير.
2. مراقبه باستمرار معدل ضربات القلب ، ومعدل التنفس ، ودرجه حرارة الجسم ، وعمق التخدير من الحيوانية المتلقية ، وذلك باستخدام اصبع القدم اختبار منعكس الانسحاب.
3. من أجل منع الجفاف ونقص السكر في الماء ، حقن 2 مل من الحل اللاكتيتي الرنين و 2.5 ٪ سكر العنب جلد في البداية واخر 2 مل في نهاية العملية الجراحية.
4. حلق منطقه الفخذ ، ثم علاج مع كريم مزيل الشعر من أجل الحد من كميه زغب التي تركها المقص.
5. ارتداء قناع ، غطاء الراس ، ثوب العزلة القابل للتصرف ، وقفازات معقمه.
6. وضع ضعيف الحيوانية علي وساده التدفئة. تطبيق مرهم العيون لمنع سحجات القرنية اثناء التخدير. إنتاج حقل جراحي معقم عن طريق الاستعداد ، والتنظيف ، وثني المنطقة الجراحية.
7. اجراء شق الجلد 3 سم في تقعر الفخذ باستخدام شفره مشرط #15 وتعكس لوحه الدهون الاربيه أفقيا باستخدام مقص القزحية.
8. فضح الاوعيه الفخذية المشتركة ووضع هوك سلك مع شريط مطاطي لسحب عضلات البطن.
9. وتقسيم الفروع مورفي.
10. باستخدام 10-0 النايلون انقطاع الغرز ، والسفن المانحة anastomose إلى السفن المتلقية عن طريق الوريدية من طرف إلى جانب تقنيه والشرايين نهاية إلى نهاية تقنيه. حرر المشابك تدريجيا من الشريان ثم الوريد. راقب المواقع التي يتم فيها النزيف وأضف خيوط اضافيه إذا لزم الأمر.
11. تقييم بصريا الاوعيه الدموية الوعائية من أجل ضمان فعاليه ضخ الطعم.
12. أقحم الطعم في الجيب الاربي وتوجيهها راسا علي عقب ، مع مفصل الكاحل متفوقة ومفصل الركبة السفلي.
13. باستخدام خيوط الشد ، تامين الطعم للعضلات المجاورة. إغلاق الجلد عن طريق الأفقي توقف الجلد فراش قابل للامتصاص 4-0 الغرز.
14. أزاله الحيوانية المتلقي من التخدير و فطم تشغيله من جهاز التنفس الاصطناعي. وضع الحيوانية علي وساده التدفئة للحصول علي الدعم الحراري.
    ملاحظه: العملية العامة الوقت بين 3 إلى 4 ساعة ، اعتمادا علي تجربه الجراح والتعارف مع العملية الجراحية.
15. أداره ميلوكسيكام (1 مغ/كغ) جلد لقمع الم ورصد حتى يتم استرداد الحيوانية تماما والمحمول.

3. الرصد المتلقي VCA

1. منزل الفئران المتلقي منفردة ومراقبتها يوميا لعلامات سريريه من الم ، والجفاف ، وفقدان الوزن ، وانخفاض النشاط بالاضافه إلى الفشل الجراحي (لأول 48-72 ح) أو الرفض. أداره ميلوكسيكام جلد (1 مغ/كغ) يوميا لأول 3 أيام لقمع الم.
2. استنادا إلى نقطه النهاية البحث ، واختيار الدواء المثبط للمناعة ان تدار.

4. الانسجه

1. تحت التخدير الايزوفلواني المستنشق (2.5 ٪-3 ٪) ، والحصول علي الجلد التسلسلي والخزعات العضلات الكامنة من الكسب غير المرغوب فيه المتبرع في النقاط الزمنيه المطلوبة. يجب ان تكون البشرة نقيه وملفوفه قبل الحصول علي خزعة ، وينبغي ان يؤدي الحقل والتقنية المعقمة.
2. إغلاق الجرح مع واحد إلى اثنين من غرز ، وذلك باستخدام الغرز 4-0 قابل للامتصاص. أعاده الحيوانية إلى قفصها والسماح لها للتعافي من التخدير.
3. إصلاح الانسجه البيولوجية في أنابيب منفصلة في 10 ٪ formalin.
4. في النقطة الزمنيه الطرفية وتحت التخدير الايزوفلواني المستنشق (2.5 ٪-3 ٪) ، تاخذ خزعة الجلد أكبر التي تمتد علي الحدود المانحة/المتلقي. تحديد موقع الزوج بعناية في السفينة المقود في موقع اناستاوسيس; الموقع المناسب سيكون واضحا بسبب الغرز. خذ عينات السفينة المطلوبة من الشريان و/أو الوريد. إصلاح كافة العينات بشكل منفصل في 10% formalin. بعد جمع عينات الانسجه ، وفي حين ان الحيوانية لا يزال تحت التخدير ايزوفلواني ، موت ببطء علي الفور الحيوانية عن طريق استرواح الصدر.
5. باستخدام معالج الانسجه (أو تقنيه التضمين المفضلة الأخرى) ، يقوم البارافين بتضمين كل خزعة في الكتلة الخاصة به. لعينات الجلد ، وتوجيه الانسجه بحيث يمكن رؤية جميع طبقات البشرة والجلد في شريحة واحده. لعينات السفينة ، وتوجيه السفن بحيث يمكن الحصول علي المقاطع المتقاطعة.
6. باستخدام ميكروتومي ، وقطع 6 ميكرون سميكه المقاطع وتطبيقها علي الشرائح لالهييوكسيلين و ايوسين (ح & ه) تلطيخ.
7. وصمه عار ل H & E باستخدام بروتوكول قياسي.
8. الحصول علي صور تمثيليه لجميع عينات الانسجه المطلوبة باستخدام تقنيات المجهر المجهري.

النتائج

الفئران VCA متغاير الأطراف أوستيوميوكوتانيوس رفرف نموذج يسمح للبقاء علي المدى الطويل لكسب الطعم الطعوم تحت كبت المناعة. النموذج هو موثوق بها ، واستنساخها ، وبسيطه لأداء. ومخباه جيدا رفرف في منطقه الفخذ ويشكل الحد الأدنى من الاعتلال وعدم الراحة للحيوان. العرض التقديمي الجلد هو مظهر السريري...

Discussion

في تطوير هذا النموذج من VCA ، تم النظر في العديد من القضايا الرئيسية. أولا ، كان من المهم ان تشمل العظام سليمه (الساق والقصبات) ، نخاع العظم ، والجلد في الطعم. في حين ان عمليات زرع اليد السريرية من المتبرعين الكبار لا تنقل كميات كبيره من نخاع الدم بنشاط ، فان الدراسات الخاصة بدور مشكاة نخاع الع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50