トランスレーショナル血管化複合体他家移植研究のためのラットにおける修正 Heterotopic 後肢 Osteomyocutaneous フラップモデル

要約

血管化複合同種移植片は、移植患者に生命を変える利点を提供するが、移植片拒絶および vasculopathy の生物学的原因はあまり理解されないままである。ここに提示されたげっ歯類外科手術モデルは、再現性のある、臨床的に関連する移植モデルを提供し、研究者がその発生を防ぐために拒絶事象および潜在的な治療戦略を評価することを可能にする。

要約

血管化コンポジット他家移植 (VCA) は、再建手術で比較的新しい分野です。人間の VCA で臨床的な成果には、手と顔の移植と、より最近では、腹壁、子宮、および泌尿生殖器移植が含まれます。機能的な成果は当初の期待を上回り、ほとんどの受信者は生活の質の向上を享受しています。しかし、臨床経験が蓄積するにつれて、免疫抑制からの慢性拒絶および合併症が対処されなければならない。移植片が失敗した多くの場合、その原因となる病理は虚血性 vasculopathy であった。VCA、特に虚血性 vasculopathy に関連した急性および慢性拒絶反応の生物学的メカニズムは、研究の重要な領域である。しかし、VCA 患者の数が非常に少ないため、実験モデルでは提案されたメカニズムの評価の方が適切です。複数のグループは、VCA 拒否と vasculopathy の関連する未解決の質問のいくつかに対処するために動物モデルを使用しています。様々な種を含むいくつかのモデルデザインが文献に記載されている。ここでは、トランスレーショナル VCA 研究に利用できる、ラットの VCA heterotopic 後肢 osteomyocutaneous フラップの再現性のあるモデルを紹介します。このモデルは罹患率の低いレベルを維持している間、バイオプシーおよび異なったイメージ投射様相を含む接木の連続的な評価を、可能にする。

概要

切断、ブラスト傷害、悪性腫瘍、および先天性欠損症による壊滅的な組織損失のための再建手術は、患者からの組織の利用可能性およびドナー部位で生じる追加の罹患率によって制限される。いくつかのケースでは、熱傷犠牲者または四辺形切断者など、再建のための生存可能な組織は、患者から入手できない。1964年、エクアドルで初めての近代的な手の移植が行われました。これは技術的な成功でしたが、現時点で利用可能な免疫抑制は拒絶を防ぐには不十分であり、移植片は3週間未満で失われました。1998および1999では、免疫抑制の現代における最初の手移植は、リヨン、フランス²とルイビル、ケンタッキー州、USA³で行われました。初めて、再建外科医は同じように置き換えることができます。顔面移植は 2005⁴で最初に行われ、多くの他の VCA 移植片が、腹壁⁵、子宮、および泌尿生殖器移植⁶のような現在日常的に行われている。

固形臓器移植とは異なり、ほとんどの VCA 技術は、高抗原性ドナー皮膚の存在を伴います。臨床経験は、皮膚の急性拒絶反応が比較的容易に制御されることを決定したが、治療⁷によく反応しない基礎組織および血管の慢性拒絶に寄与し得る。同種免疫応答に関連付けられている血管機能障害は、VCA⁷のフィールドのためのより不吉な障害物です。Macrovasculopathies は、灌流障害、治癒の遅延、および炎症誘発性の状態につながります。両方のコンフルエント積極的な大血管 vasculopathy および焦点 intimal 過形成は、手移植レシピエント⁷において生じる。さらに、microvasculopathies は、おそらく VCA 合併症にも貢献し、拒絶イベントにつながる可能性もあります。免疫と非免疫系の両方の要因は、おそらく、手の移植のレシピエントの vasculopathy において役割を果たすが、VCA における遠位血管機能不全を促進する特定のメカニズムは、特に低悪性度、慢性拒絶反応の文脈においては知られていない。これらの未回答の質問は、VCA 拒否/メンテナンスと vasculopathy の臨床コース中に移植片の連続評価を可能にする動物 VCA モデルの開発を要します。このようなモデルは、免疫抑制、感染性チャレンジ、および/または他の術後外傷性損傷^8,9に直面して拒絶および vasculopathy に関する洞察を提供する。

ここで紹介したのは同種ラット VCA heterotopic 後肢 osteomyocutaneous フラップモデルです。以前に公開された VCA モデルに基づいて、この手順は技術的に簡単に実行でき、多数で再現性があり、レシピエント動物に最低の罹患率と不快感を呈する。このモデルは、VCA 承認と拒否の臨床的および病理組織学的評価を可能にするように設計されており、拒絶に関与する根底にある免疫および非免疫系のメカニズムを評価する機会を提供します。

プロトコル

すべての動物の手術は、ルイビル大学の機関動物ケアと使用委員会 (IACUC-承認されたプロトコル 18198) とのケアと使用のための国立衛生研究所 (NIH) のガイドによって承認されるプロトコルに従って実施しました実験動物¹⁰.生後4ヶ月のオスブラウン-ノルウェー (RT1.Aⁿ) と4ヶ月の男性ルイス (RT1.^L) ラットは、それぞれ、VCA ドナーと受信者として使用された。

1. ドナー同種移植片収穫

1. イソフルランを通して塗布された気化したものを用いてドナー動物を鎮静する。
2. 移植片ドナー領域 (後肢) だけでなく、鼠径部と腹部領域を剃る。その後、バリカンで残っているファズの量を減らすために脱毛クリームで処理します。
3. 腹腔内 (IP) ケタミン (60 mg/kg)/xylazine (麻酔/kg)/acepromazine (2mg/kg) を用いてドナー動物を深く投与する。0.2 mL/100 g の体重と 0.2 mL の追加用量の投与をすべての h.便宜上、手順2の前にこの手順を実行することはオプションです。
4. 呼吸、体温、麻酔の深さのために麻酔下で継続的に動物を監視し、つま先のピンチ離脱反射テストを使用します。
5. 血液凝固を防ぐために、手術前に首筋領域で 30 U のヘパリン溶液を皮下投与する (SC)。
6. マスク、ヘッドカバー、使い捨ての隔離ガウン、使い捨て手袋を着用してください。
7. ドナー動物の仰向けを加熱パッドに置きます。足の腹部と背の両方の側面を含む外科領域を準備し、スクラブし、ドレープすることによって無菌手術場を生成する。無菌手袋をしてください。
8. メスブレード #15 を用いて鼠径部くぼみに3cm の皮膚切開を行い、鼠径部の脂肪パッドを横方向に虹彩はさみを使用して反射させる。
9. 共通の大腿骨の容器を露出し、腹部筋肉を撤回するために伸縮性があるバンドが付いているワイヤーホックを置きなさい。
10. 解剖顕微鏡 (40 倍) を使用して、鼠径靱帯の下の一般的な大腿血管の出現から椎弓根近位を解剖し、膝窩の血管の合流を移植片に遠位。
11. Microclips およびバイポーラ宝石の鉗子を使用して、結紮とそのような横曲折性大腿骨血管、表面上尾窩血管、伏在動脈、および近位尾大腿血管などの大きな動脈および静脈枝を分割し、動員する主要な大腿骨の容器。包む準備は細い両極鉗子を使用してあらゆる小さい枝を利用する。
12. 前の皮膚の中心から皮膚の切開を後肢の腹側に沿って切断し、足首領域に、虹彩はさみを使用した。
13. Gracilis の筋肉だけでなく、その下の他の内転筋の筋肉をカット, 垂直方向に露出し、隣接する genicular 血管の内側を結紮します, 深部分枝小血管, および坐骨神経.
    注:この時点で、別の手術台で、他の外科医は、intubate および麻酔 (2.5%-3% イソフルラン) レシピエント動物を必要とする。これは外科医が接木の配置の間に受信者の外科場所を準備し、接木の虚血性時間を最小にすることを可能にする。
14. ドナー動物には、膝と足首のレベルで円周の皮膚切開を行います。膝と足首を Disarticulate、余分な筋肉や組織を取り除き、後肢の背側に垂直の皮膚切開を行い、移植片を遊離させる。この時点で、移植片 (腓骨および脛骨で構成され、その穿孔によって養われる関連筋肉および皮膚島で覆われる) は、椎弓根によってのみ接続される。
15. 大腿動脈と静脈に可能な限り小さなクランプを近位、鼠径靱帯の近くで、椎弓根を可能な限り近位に切断します。
16. 血液の移植片をフラッシュするために、27 G フラッシング鈍いカニューレを使用して大腿動脈にヘパリン処理生理食塩水 (30 U/mL) を注入する。
    注:ヘパリンフラッシュの前に動脈を拡張することは、カニューレの挿入のための容易なアクセスを可能にする。フラッシュの間に、大腿静脈からの流出を注意深く監視してください。透明な流体が大腿静脈から出たら、フラッシュを停止します。
17. 暖かい生理食塩水に浸したガーゼで孤立した移植片を包み、レシピエント動物のテーブルにすぐに運びます。このとき、レシピエント手術部位はすでに血管吻合のために準備されなければならない。
18. 移植片を収穫した後、直ちに euthanize を介してドナーラットを再度採取する。

2. レシピエント移植手術

1. チャンバを通して適用される気化イソフルランを用いた鎮静誘導に続いて、人工呼吸器制御の気管内チューブを介してレシピエント動物を深く麻酔し、2.5% 〜 3% イソフルラン。
   注:この段階では、ドナーラットは依然として麻酔される。
2. 心拍数、呼吸数、体温、およびレシピエント動物の麻酔の深さを連続的に監視し、つま先のピンチ離脱反射試験を使用する。
3. 脱水症状と低血糖を予防するために、手術終了時に lactated リンガー溶液 2 mL と 2.5% デキストロースの皮下注射を行います。
4. 鼠径部を剃り、脱毛クリームで治療して、バリカンで残っているファズの量を減らします。
5. マスク、ヘッドカバー、使い捨ての隔離ガウン、無菌手袋を着用してください。
6. 動物は、加熱パッドに仰向けに置きます。麻酔中に角膜の擦り傷を防ぐために眼科用軟膏を塗布する。外科区域を準備し、洗い、そしてドレープすることによって生殖不能の外科分野を作り出す。
7. メスブレード #15 を用いて鼠径部くぼみに3cm の皮膚切開を行い、鼠径部の脂肪パッドを横方向に虹彩はさみを使用して反射させる。
8. 共通の大腿骨の容器を露出し、腹部筋肉を撤回するために伸縮性があるバンドが付いているワイヤーホックを置きなさい。
9. マーフィーの枝を結紮て割る
10. 10-0 のナイロンの中断された縫合糸を使用して、anastomose は静脈のエンドツーサイド技術および幹線エンドツーエンドの技術によってレシピエントの容器にドナーの容器を提供する。徐々に動脈からクランプを解放し、その後静脈.出血のための吻合サイトを監視し、必要に応じて縫合糸を追加します。
11. 効果的な移植片再灌流を保証するために、血管吻合を視覚的に評価します。
12. 鼠径部のポケットに移植片をはめ込みと逆さまに、足首関節の優れたと膝関節の劣って向きます。
13. タック縫合を使用して、隣接する筋肉に移植片を固定します。中断された水平マットレス皮膚吸収性4-0 縫合糸を介して皮膚を閉じる。
14. レシピエント動物を麻酔から取り出し、それを人工呼吸器から引き離す。熱支持のための加熱パッドの上に動物を置きます。
    注:全体の操作時間は3から 4 h の間に、外科医の経験および外科プロシージャの知人によってある。
15. 疼痛抑制のための皮下 (1 mg/kg) を投与し、動物が完全に回復し、移動するまで監視します。

3. VCA 受信者モニタリング

1. レシピエントラットを単独で収容し、疼痛、脱水、体重減少、および外科的不全 (最初の48〜72時間) または拒絶に加えて活性の低下の臨床的徴候について毎日それらを監視する。疼痛抑制のための最初の3日間のメロキシカムの皮下 (1mg/kg) を毎日管理します。
2. 研究の終点に基づいて、投与する免疫抑制薬を選択します。

4. 組織学

1. 吸入イソフルラン麻酔下 (2.5% – 3%) で、所望の時点でドナー移植片から連続皮膚および基礎筋生検を得る。皮膚は、生検を得る前にスクラブしてドレープする必要があり、無菌のフィールドとテクニックを実行する必要があります。
2. 吸収性4-0 縫合糸を使用して、1〜2つのステッチで創傷を閉じます。動物をケージに戻し、麻酔から回復させます。
3. 10% ホルマリンで別々のチューブに生検組織を固定します。
4. 終末時点および吸入イソフルラン麻酔下 (2.5% – 3%) で、ドナー/レシピエントの境界にまたがるより大きな皮膚生検をとる。慎重に吻合のサイトで船のリーシュのペアを見つけます。縫合糸のために適切な部位が明らかになる。動脈および/または静脈から所望の血管サンプルを取る。10% ホルマリンで個別にすべてのサンプルを固定します。組織サンプルの収集後、および動物がまだイソフルラン麻酔下にある間、すぐに気胸を介して動物を euthanize。
5. 組織プロセッサ (または他の好ましい埋め込み技術) を使用して、パラフィン-それぞれの生検を独自のブロックに埋め込む。皮膚サンプルについては、すべての表皮層および真皮レイヤーが単一のスライスに見えるように組織を配向させる。容器サンプルの場合は、断面が得られるように容器の向きを合わせる。
6. ミクロトームを使用し、6μ m 厚の切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン (H & E) 染色のスライドに塗布する。
7. 標準プロトコルを使用した H & E 用の染色。
8. 明視野の顕微鏡検査の技術を使用してすべての望ましいティッシュのサンプルの代表イメージを得なさい。

結果

ラット VCA heterotopic 後肢 osteomyocutaneous フラップモデルは、免疫抑制の下で長期的な移植片生存を可能にします。このモデルは信頼性が高く、再現性があり、簡単に実行できます。フラップは、鼠径部によく隠されており、動物には最低の罹患率と不快感を構成しています。皮膚の提示は、同種移植片の生存および拒絶反応の臨床症状である (図 1)。折り返しの設計は総?...

ディスカッション

VCA のこのモデルの開発では、いくつかの重要な問題を検討しました。まず、移植片中に無傷の骨 (脛骨および腓骨)、骨髄、および皮膚を含むことが重要であった。成人ドナーからの臨床的な手の移植は、積極的に造血骨髄のかなりの量を転送しませんが, 骨髄ニッチの役割の研究は、より良いミラーリングされた長い骨ではなく、無傷の血管化骨を使用して, 結果露出した骨髄の線維症。さ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50