Modelo Osteomyocutaneous Heterotopic modificado da aleta do Hindmembro no rato para a pesquisa de Allotransplante composta Vascularized translacional

Resumo

O allograft composto vascularized oferece benefícios Life-alterando aos receptores da transplantação, mas as causas biológicas da rejeição da corrupção e do vasculopatia permanecem mal compreendidas. O modelo cirúrgico do roedor apresentado aqui apresenta um modelo de transplante reprodutível e clinicamente relevante, permitindo que os pesquisadores avaliem eventos de rejeição e potenciais estratégias terapêuticas para prevenir sua ocorrência.

Resumo

O allotransplante composto vascularized (VCA) é um campo relativamente novo na cirurgia reconstrutiva. As realizações clínicas na VCA humana incluem transplantações da mão e da cara e, mais recentemente, parede abdominal, útero, e transplantes urogenital. Os resultados funcionais excederam as expectativas iniciais, e a maioria dos destinatários desfruta de uma melhor qualidade de vida. Entretanto, como a experiência clínica se acumula, a rejeição crônica e as complicações da imunossupressão devem ser abordadas. Em muitos casos onde os enxertos falharam, a patologia causativa tem sido vasculopatia isquêmica. Os mecanismos biológicos da rejeição aguda e crônica associados à VCA, especialmente vasculopatia isquêmica, são importantes áreas de pesquisa. No entanto, devido ao pequeno número de pacientes com VCA, a avaliação dos mecanismos propostos é melhor abordada em um modelo experimental. Vários grupos usaram modelos animais para abordar algumas das questões não resolvidas relevantes na rejeição de VCA e vasculopatia. Vários modelos de modelos envolvendo uma variedade de espécies são descritos na literatura. Aqui nós apresentamos um modelo reprodutível da aleta osteomyocutaneous do hindtopic do membro de VCA no rato que pode ser utilizada para a pesquisa translacional de VCA. Este modelo permite a avaliação seriada do enxerto, incluindo biópsias e diferentes modalidades de imagem, mantendo um baixo nível de morbidade.

Introdução

A cirurgia reconstrutiva para a perda catastrófica do tecido da amputação, de ferimentos da explosão, de malignidades, e de defeitos congenitais é limitada pela disponibilidade do tecido do paciente e da morbosidade adicional causada no local doador. Em alguns casos, como vítimas de queimadura ou amputados quadrilaterais, o tecido viável para a reconstrução não está disponível do paciente. Em 1964, o primeiro transplante de mão moderno foi realizado no Equador. Quando este era um sucesso técnico, o imunossupressão disponível na altura era insuficiente para impedir a rejeição, e a corrupção foi perdida em menos de 3 semanas¹. Em 1998 e 1999, os transplantes de primeira mão na era moderna de imunossupressão foram realizados em Lyon, França² e Louisville, Kentucky, EUA³. Pela primeira vez, os cirurgiões reconstrutivos poderiam substituir como com como. A transplantação da cara foi executada primeiramente em 2005⁴, e um número outros de corrupções de VCA é executado agora rotineiramente, tal como a parede abdominal⁵, uterine, e os transplantações urogenital⁶.

Ao contrário da transplantação contínua do órgão, a maioria de técnicas de VCA envolvem a presença da pele fornecedora altamente antigénica. A experiência clínica determinou que a rejeição aguda da pele é relativamente fácil de controlar, mas pode contribuir para a rejeição crônica dos tecidos e vasos subjacentes, que não respondem bem ao tratamento⁷. A disfunção vascular associada a uma resposta aloimune é um obstáculo mais ameaçante para o campo da VCA⁷. As macrovasculopatias levam a déficits de perfusão, cicatrização tardia e condições pró-inflamatórias. O grande-vaso agressivo confluente e a hiperplasia intimal focal focais ocorrem em receptores da transplantação da mão⁷. Adicionalmente, os microvasculopathies contribuem provavelmente às complicações de VCA também e podem mesmo conduzir aos eventos da rejeição. Quando os fatores imunes e nonimmune jogarem provavelmente um papel no vasculopatia de receptores da transplantação da mão, os mecanismos específicos que promovem a deficiência orgânica longe do ponto de origem da embarcação em VCA não são sabidos, particular no contexto da rejeição low-grade, crônica. Estas perguntas não respondidas necessitam o desenvolvimento de um modelo animal de VCA que permita a avaliação de série da corrupção durante o curso clínico da rejeição/manutenção e do vasculopathy de VCA. Tal modelo oferecerá insights sobre a rejeição e vasculopatia em face da imunossupressão, desafio infeccioso e/ou outras lesões traumáticas pós-operatórias^8,9.

É apresentado aqui um modelo osteomyocutaneous do retalho do hindtopic heterotópico do rato de aloeneic VCA. Baseado em modelos previamente publicados de VCA, este procedimento é tècnica fácil de executar, reprodutível em um grande número, e exibe a morbosidade e o incómodo mínimos ao animal do receptor. Este modelo foi projetado para permitir avaliações clínicas e histopatológicas da aceitação vs. rejeição de VCA, e fornece uma oportunidade de avaliar os mecanismos imunes e nonimmune subjacentes envolvidos na rejeição.

Protocolo

Todas as cirurgias animais foram realizadas de acordo com os protocolos aprovados pela Comissão de cuidados e uso de animais institucionais da Universidade de Louisville (protocolo aprovado pelo IACUC 18198) e o guia dos institutos nacionais de saúde (NIH) para o cuidado e uso de Animais de laboratório¹⁰. Brown-Noruega masculino quatro-mês-velho (RT1. Aⁿ) e 4-mês-velho masculino Lewis (rt1. A^l) ratos foram utilizados como doador VCA e receptores, respectivamente.

1. colheita do allograft do doador

1. Sedate o animal doador usando isoflurano vaporizado aplicado através de uma câmara.
2. Raspar a área doadora do enxerto (membro posterior), bem como as áreas de virilha e abdômen. Depois disso, trate com creme depilatório, a fim de reduzir a quantidade de fuzz deixados pelos cortadores.
3. Anestesiam profundamente os animais doadores usando cetamina intraperitoneal (IP) (60 mg/kg)/xilazina (15 mg/kg)/acepromazina (2 mg/kg). Administrar uma dose inicial de 0,2 mL/100 g de peso corporal e doses adicionais de 0,2 mL a cada h. Para a conveniência, é opcional executar esta etapa antes da etapa 2.
4. Monitore continuamente os animais enquanto estiver anestesia para respiração, temperatura corporal e profundidade da anestesia, usando o teste de reflexo de retirada da pinça do dedo do pé.
5. Administrar 30 U de solução de heparina por via subcutânea (SC) na área do scruff antes da cirurgia para prevenir a coagulação.
6. Use uma máscara, uma tampa de cabeça, um vestido descartável da isolação, e luvas descartáveis.
7. Coloque o doador supino animal em uma almofada de aquecimento. Produza um campo cirúrgico estéril pregando, esfregando, e drapejando a área cirúrgica que inclui os aspectos ventral e dorsal do pé. Don luvas estéreis.
8. Faça uma incisão da pele de 3 cm na concavidade da virilha usando a lâmina do bisturi #15 e reflita a almofada gorda inguinal lateralmente usando a tesoura da íris.
9. Expor os vasos femorais comuns e colocar um gancho de arame com uma faixa elástica para retrair os músculos abdominais.
10. Usando um microscópio de dissecação (40x), dissecar o pedículo proximalmente da emergência das embarcações femoral comuns o ligamento inguinal e distalmente à confluência de embarcações poplítea no enxerto.
11. Usando microclipes e pinça de joalhas bipolares, ligadura e divida os grandes ramos arteriais e venosos, tais como vasos femorais circunflexos laterais, vasos epigástrica caudais superficiais, a artéria safena e os vasos femoral caudais proximal, para mobilizar principais vasos femorais. Cauterizar quaisquer ramos pequenos usando multa pinça bipolar.
12. Faça uma incisão cutânea do centro da pele anterior cortada ao longo do lado ventral do membro posterior, para a área do tornozelo, usando tesouras de íris.
13. Corte o músculo grácil, bem como os outros músculos adutores embaixo dela, de forma vertical para expor e ligar os vasos geniculares proximal medial, os vasos pequenos de ramificação profunda e o nervo ciático.
    Nota: Neste ponto, em uma mesa cirúrgica separada, o outro cirurgião deve intubar e anestesitizar (2,5% – 3% isoflurano) o animal receptor; Isto permite que os cirurgiões Preparem o local cirúrgico do receptor a tempo para a colocação da corrupção e minimizem o tempo isquêmico da corrupção.
14. No animal doador, faça incisões cutâneas circunferenciais ao nível do joelho e tornozelo. Desarticule o joelho e o tornozelo, remova o músculo e o tecido estranhos, e faça uma incisão vertical da pele no lado dorsal do hindmembro para liberar a corrupção. Neste ponto, o enxerto (composto de fíbula e tíbia, coberto com músculos relacionados e ilha da pele nutrida por seus perfuradores) é conectado apenas pelo pedículo.
15. Coloque as braçadeiras pequenas o mais proximalmente possível na artéria e na veia femoral, e corte o pedículo como proximalmente como possível, perto do ligamento inguinal.
16. Para liberar o enxerto de sangue, injetar soro fisiológico heparinizado (30 U/mL) na artéria femoral usando uma cânula sem corte de 27 G de rubor.
    Nota: Dilatar a artéria antes da liberação da heparina permite fácil acesso para a inserção da cânula. Durante o flush, monitore de perto a saída da veia femoral. Uma vez que o fluido desobstruído sai da veia femoral, pare o flush.
17. Enrole o enxerto isolado em gaze morna e embebido em soro fisiológico e transporte-o imediatamente para a mesa do animal beneficiário. Neste momento, o local cirúrgico do receptor já deve estar preparado para a anastomose vascular.
18. Após a colheita do enxerto, eutanizar imediatamente o rato doador via pneumotórax.

2. cirurgia de transplante de receptores

1. Após a indução de sedação utilizando isoflurano vaporizado aplicado através de uma câmara, anestesiando profundamente o animal receptor através de um tubo endotraqueal controlado por ventilador e 2,5% – 3% de isoflurano.
   Nota: Nesta fase, o rato doador ainda está anestesiado.
2. Monitore continuamente a frequência cardíaca, a frequência respiratória, a temperatura corporal e a profundidade da anestesia do animal receptor, usando o teste de reflexo de retirada da pinça do dedo do pé.
3. Para prevenir a desidratação e a hipoglicemia, Injete 2 mL de solução de Ringer com lactato e 2,5% de dextrose por via subcutânea no início e outros 2 mL no final da cirurgia.
4. Raspar a área da virilha, em seguida, tratar com creme depilatório, a fim de reduzir a quantidade de fuzz deixados pelos cortadores.
5. Use uma máscara, uma tampa de cabeça, um vestido descartável da isolação, e luvas estéreis.
6. Coloque o animal supino em uma almofada de aquecimento. Aplique a pomada ophthalmic para impedir abrasões córneos durante a anestesia. Produza um campo cirúrgico estéril pregando, esfregando, e drapejando a área cirúrgica.
7. Faça uma incisão da pele de 3 cm na concavidade da virilha usando a lâmina do bisturi #15 e reflita a almofada gorda inguinal lateralmente usando a tesoura da íris.
8. Expor os vasos femorais comuns e colocar um gancho de arame com uma faixa elástica para retrair os músculos abdominais.
9. Ligate e dividir ramos de Murphy.
10. Usando 10-0 nylon suturas interrompidas, anasto, vasos de doadores para vasos receptores através de técnica venosa de ponta a ponta e técnica de ponta a extremidade arterial. Solte gradualmente os grampos da artéria e, em seguida, a veia. Monitore os locais anastomotic para sangrar e adicione suturas adicionais se necessário.
11. Avaliar visualmente a anastomose vascular, a fim de assegurar a efetiva reperfusão do enxerto.
12. Inset o enxerto no bolso inguinal e orientá-lo de cabeça para baixo, com a articulação do tornozelo superior e inferior da articulação do joelho.
13. Usando suturas de dobrando, prenda a corrupção aos músculos adjacentes. Feche a pele através da pele horizontal interrompida do colchão 4-0 Suturas absorvíveis.
14. Retire o animal receptor da anestesia e desmame-lo fora do ventilador. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para o suporte térmico.
    Nota: O tempo de operação total é entre 3 a 4 h, dependendo da experiência do cirurgião e familiaridade com o procedimento cirúrgico.
15. Administrar Meloxicam (1 mg/kg) por via subcutânea para a supressão da dor e monitor até que o animal é totalmente recuperado e móvel.

3. monitoração do receptor de VCA

1. Abrigar os ratos receptores isoladamente e monitorá-los diariamente para sinais clínicos de dor, desidratação, perda de peso, e diminuição da atividade, além de falha cirúrgica (para os primeiros 48 – 72 h) ou rejeição. Administrar Meloxicam por via subcutânea (1 mg/kg) diariamente durante os primeiros 3 dias para a supressão da dor.
2. Com base no Endpoint de pesquisa, escolha um fármaco imunossupressor a ser administrado.

4. histologia

1. anestesia inalatória de isoflurano (2,5% – 3%), obter a pele seriada e as biópsias musculares subjacentes do enxerto doador nos momentos desejados. A pele deve ser esfregadela e drapeada antes de obter uma biópsia, e um campo estéril e técnica deve ser realizada.
2. Feche a ferida com um a dois pontos, usando suturas 4-0 absorvíveis. Devolva o animal à sua gaiola e deixe-o recuperar da anestesia.
3. Fixar os tecidos biopsiados em tubos separados em formalina a 10%.
4. No ponto de tempo terminal e anestesia inalatória de isoflurano (2,5% – 3%), tomar uma biópsia de pele maior que abrange a fronteira doador/receptor. Localize cuidadosamente o par de coleira do navio no local das anastomoses; o local apropriado será aparente devido às suturas. Tome as amostras desejadas da embarcação da artéria e/ou da veia. Fixar todas as amostras separadamente em formalina a 10%. Após a coleta de amostras de tecido, e enquanto o animal ainda está anestesia isoflurana, imediatamente eutanizar o animal via pneumotórax.
5. Usando um processador do tecido (ou a outra técnica de incorporação preferida), parafina-incorpore cada biópsia em seu próprio bloco. Para amostras de pele, orientar o tecido de modo que todas as camadas epidérmicas e dérmicas podem ser vistas em uma única fatia. Para as amostras de vasos, orientar os vasos de modo que as secções transversais podem ser obtidas.
6. Usando um micrótomo, corte 6 seções μm-grossas e aplique-as às corrediças para a coloração da hematoxilina e da eosina (H & E).
7. Mancha para H & E usando um protocolo padrão.
8. Obter imagens representativas de todas as amostras de tecido desejadas utilizando técnicas de microscopia de campo.

Resultados

O modelo osteomyocutaneous do retalho do hindtopic do membro de VCA do rato permite a sobrevivência a longo prazo do allograft o immunosuppression. O modelo é confiável, reprodutível e simples de executar. A aleta é bem escondida na área do virilha e constitui a morbosidade e o incómodo mínimos ao animal. A apresentação cutânea é uma manifestação clínica da sobrevida e rejeição do aloenxerto (Figura 1). O projeto da aleta permite a monitoração clínica bruta e cria uma opo...

Discussão

No desenvolvimento deste modelo de VCA, foram consideradas várias questões-chave. Primeiro, foi importante incluir osso intacto (tíbia e fíbula), medula óssea e pele no enxerto. Quando os transplantes clínicos da mão dos doadores adultos não transferirem quantidades significativas de medula ativamente hematopoiéticas, os estudos do papel do Niche da medula são espelhados melhor usando um osso intacto, vascularizado um pouco do que um osso longo cortado, que resulte em fibrose da medula exposta. Além disso, o p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50