Translasyonel vaskülarize kompozit allotransplantasyon araştırmaları için Rat 'ta değiştirilmiş heterotopik Hindekstremite Osteomokutanöz Flap modeli

Özet

Vascularized kompozit allogreft, nakil alıcılarına yaşam değiştiren avantajlar sunar, ancak greft reddi ve vaskas patasının biyolojik nedenleri kötü anlaşılmalıdır. Burada sunulan kemirgen cerrahi modeli reproducible, klinik olarak ilgili transplantasyon modeli sunar ve araştırmacılar reddedilme olaylarını ve olası terapötik stratejileri kendi oluşumunu önlemek için değerlendirmelerine izin verir.

Özet

Vascularized kompozit allotransplantasyon (VCA) Rekonstrüktif ameliyatta nispeten yeni bir alandır. İnsan VCA 'da klinik başarıları el ve yüz nakli ve daha yeni, abdominal duvar, rahim ve ürogenital nakli içerir. Fonksiyonel sonuçlar ilk beklentilerini aştı ve çoğu alıcı daha iyi bir yaşam kalitesine sahiptir. Ancak, klinik deneyim biriktiğinde, kronik ret ve bağışıklık bastırma komplikasyonları ele alınmalıdır. Greftler başarısız olduğu birçok durumda, nedensel patolojinin iskemik vazkas patolojisi olmuştur. VCA ile ilişkili akut ve kronik reddedilmenin biyolojik mekanizmaları, özellikle iskemik vaskas Patrik, araştırma önemli alanlardır. Ancak, çok az sayıda VCA hastası nedeniyle, önerilen mekanizmaların değerlendirilmesi deneysel bir modelde daha iyi ele alınmaktadır. Birden fazla grup, VCA reddi ve vaskas Patinde ilgili çözülmemiş soruların bazılarını ele almak için hayvan modellerini kullandı. Çeşitli türler içeren birçok model tasarımları literatürde açıklanmıştır. Burada translasyonel VCA araştırmaları için kullanılabilecek sıçan içinde VCA heterotopik hindekstremite osteomyokutanöz flep tekrarlanabilir bir model sunuyoruz. Bu model, biyopsiler ve farklı görüntüleme yöntemleri de dahil olmak üzere greftin seri değerlendirilmesini sağlar ve düşük morbidite seviyesini korur.

Giriş

Amputasyon, patlama yaralanmaları, maligniteler ve konjenital kusurların felaket doku kaybı için Rekonstrüktif Cerrahi, hastanın dokusunun mevcudiyeti ve donör bölgesinde kaynaklanan ek morbidite ile sınırlıdır. Bazı durumlarda, yanık kurbanları veya dörtgen amputeler gibi, yeniden yapılanma için uygulanabilir doku hasta tarafından kullanılamaz. 1964 yılında Ekvador 'da ilk modern el nakli gerçekleştirildi. Bu teknik bir başarı olmakla beraber, bağışıklık bastırma zamanı reddedilmeyi önlemek için yetersiz kaldı ve greft 3 hafta¹' den az bir sürede kayboldu. 1998 ve 1999 yılında, modern immünorpresyon çağında ilk el nakli Lyon, Fransa² ve Louisville, Kentucky, ABD³' te yapıldı. İlk kez, Rekonstrüktif cerrahlar gibi yerine olabilir. Yüz transplantasyonu ilk olarak 2005⁴' te yapılmıştır ve artık abdominal duvar⁵, uterus ve ürogenital nakli⁶gibi bir dizi diğer VCA greftleri rutin olarak gerçekleştirilir.

Katı organ nakli aksine, çoğu VCA teknikleri yüksek antijenik donör cilt varlığını içerir. Klinik deneyim, cildin akut reddedilmesinin kontrol edilmesi nispeten kolay olduğunu belirledi, ancak altta yatan dokuların ve damarların kronik reddedilmesine katkıda bulunabilir ve bu da tedavi⁷' ye iyi yanıt vermez. Bir alloimmün tepki ile ilişkili vasküler disfonksiyon VCA⁷alanı için daha uğursuz bir engeldir. Makrovaskas patarları perfüzyon açıkları, gecikmiş şifa ve proinflamatuar koşullara yol açar. Hem confluent agresif büyük damar vas-pati ve odak intimal hiperplazisi el nakli alıcılar oluşur⁷. Ayrıca, microvas-pathies büyük olasılıkla VCA komplikasyonları için de katkıda bulunur ve hatta reddetme olaylara yol açabilir. Hem bağışıklık hem de bağışıklık olmayan faktörler, el nakli alıcılarının vaskas Patinde rol oynayırken, VCA 'da distal damar fonksiyon bozukluğu teşvik eden belirli mekanizmalar, özellikle düşük dereceli, kronik reddetme bağlamında bilinmemektedir. Bu cevaplanmamış sorular, VCA ret/bakım ve vaskas patlantının klinik kursu sırasında greftin seri değerlendirilmesi için izin verecek bir hayvan VCA modelinin gelişimini gerektirecektir. Böyle bir model, bağışıklık bastırma, bulaşıcı meydan okuma ve/veya diğer postoperatif travmatik yaralanma karşısında reddi ve vaskas patının içine Öngörüler sunacak^8,9.

Burada sunulan bir allogeneik sıçan VCA heterotopik hindekstremite Osteomiyokutanöz flep modeli. Önceden yayımlanan VCA modellerinde temel alınarak, bu prosedür Teknik olarak, çok sayıda tekrarlanabilir, gerçekleştirmek için kolay ve en az morbidite ve rahatsızlık alıcı hayvan sergiler. Bu model, VCA kabulünün reddedilme ile ilgili klinik ve histopatolojik değerlendirmelerine izin verecek şekilde tasarlanmıştır ve reddedilmede yer alan bağışıklık ve immün olmayan mekanizmaları değerlendirmek için bir fırsat sağlar.

Protokol

Tüm hayvan ameliyatları Louisville Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC onaylı protokol 18198) ve bakım ve kullanımı Için Ulusal Sağlık Enstitüsü (NıH) Kılavuzu tarafından onaylanmış protokollere uygun olarak yapılmıştır Laboratuar hayvanları¹⁰. Dört aylık yaşlı erkek Brown-Norway (RT1. Aⁿ) ve 4 aylık erkek LEWIS (Rt1. A^l) fareler, sırasıyla VCA donör ve alıcılar olarak kullanılmıştır.

1. bağış allograft hasat

1. Bir oda üzerinden uygulanan buharlaşmış Isoflurane kullanarak donör hayvan sedate.
2. Greft donör alanı (hindekstremite) yanı sıra kasık ve karın alanları tıraş. Bunun ardından, makaslar tarafından sol Fuzz miktarını azaltmak için dondurmacı krem ile tedavi.
3. İntraperitoneal (IP) ketamin (60 mg/kg)/xylazine (15 mg/kg)/Acepromazine (2 mg/kg) kullanarak donör hayvanları derinden anestezize. Bir başlangıç dozu yönetmek 0,2 mL/100 g vücut ağırlığı ve ek dozlarda 0,2 mL her h. Kolaylık sağlamak için, adım 2 ' den önce bu adımı gerçekleştirmek isteğe bağlıdır.
4. Solunum, vücut sıcaklığı ve anestezi derinliği için anestezi altındayken hayvanları sürekli olarak izleyin, ayak tutam çekme refleks testini kullanarak.
5. Pıhtılaşma önlemek için ameliyattan önce skruff alanında 30 U heparin solüsyonu subkutan (SC) yönetin.
6. Bir maske, baş kapak, tek kullanımlık yalıtım elbisesi ve tek kullanımlık eldivenler takın.
7. Bir ısıtma yastığı üzerine donör hayvan sırtüstü yerleştirin. Bacak hem ventral hem de dorsal yönleri de dahil olmak üzere cerrahi alan, prepping, ovma ve draping tarafından steril bir cerrahi alan üretmek. Steril eldiven yok.
8. Neşter Blade #15 kullanarak kasık konboşluğunda 3 cm cilt kesi yapın ve iris makas kullanarak yanal inguinal yağ Pad yansıtmak.
9. Ortak femoral damarlarını açığa çıkarın ve karın kaslarını geri çekmek için elastik bir bandla bir tel kanca yerleştirin.
10. Bir Diseksiyon mikroskobu (40X) kullanarak, inguinal bağ altında ortak femoral damarların ortaya çıkması ve distale greft içine popliteal damarların konfluence pedül karşı.
11. Mikro klipler ve bipolar kuyumlar ' forseps kullanarak, indirgeme uzman ve büyük arter ve venöz dalları bölmek, lateral sirkumfleks femoral damarların gibi, yüzeysel kaudal epigastrik damarların, safen arter, ve proksimal kaudal femoral damarlarda, seferber ana femoral damarlarda. İnce Bipolar forseps kullanarak herhangi bir küçük dalları cauterize.
12. Önceki derinin merkezinden bir cilt kesi yapın, kuluzun ventral tarafı boyunca kesilmiş, ayak bileği alanına, İris makas kullanarak.
13. Gracilis kas kesme, yanı sıra diğer adduktor kasları altında, dikey bir moda ortaya çıkarmak ve medial proksimel Geniküler damarlarını, derin dallanma küçük damarların ve siyatik sinir indirgeme uzman.
    Not: Bu noktada, ayrı bir cerrahi masada, diğer cerrah entüat ve anesteziye (% 2.5-3% İsoflurane) alıcı hayvan; Bu da cerrahların, alıcı cerrahi alanını greft yerleşimi için zamanında hazırlamasını ve greftin iskemik süresini en aza indirmesine olanak tanır.
14. Donör hayvan üzerinde, diz ve ayak bileği seviyesinde çevresel cilt kesikler olun. Diz ve ayak bileği disarticulate, yabancı kas ve doku kaldırmak ve greftini boşaltmak için hindekstremite dorsal tarafında dikey bir cilt kesi yapmak. Bu noktada, greft (fibula ve Tibia oluşan, ilgili kaslar ve cilt Adası ile kaplı onun perforators tarafından beslenmiş) sadece pedikül bağlıdır.
15. Küçük kelepçeleri femoral arter ve ven üzerinde mümkün olduğunca tutarlı bir şekilde yerleştirin ve kasık ligament yakın, mümkün olduğunca proktibik olarak kesilebilir.
16. Kan grefti temizlemek için, bir 27 G kızarma künt kanül kullanarak femoral arter içine heparinize tuzlu (30 U/ml) enjekte.
    Not: Heparin Flush öncesinde arter Dilating kanül ekleme için kolay erişim sağlar. Floş sırasında, femoral ven dışarı akış yakından izleyin. Bir kez temiz sıvı femoral ven çıkar, floş durdurun.
17. İzole greft sıcak tuzlu ıslatılmış gazlı bezle sarın ve hemen alıcının hayvan masasına taşıma. Şu anda, alıcı cerrahi site zaten vasküler anastomoz için hazırlıklı olmalıdır.
18. Greft hasat sonrası, hemen pnömotoraks yoluyla donör sıçan ötenize.

2. alıcı transplantasyon cerrahisi

1. Bir oda üzerinden uygulanan buharlaşmış isofluran kullanarak sedasyon indüksiyonu takiben, derin bir ventilatör kontrollü Endotrakeal tüp ve% 2,5-% 3 Isoflurane aracılığıyla alıcı hayvan anestezize.
   Not: Bu aşamada, donör sıçan hala anestezize edilir.
2. Sürekli kalp hızını izlemek, solunum hızı, vücut sıcaklığı, ve alıcı hayvanın anestezi derinliği, ayak tutam çekme refleks testi kullanarak.
3. Dehidrasyon ve hipoglisemi önlemek için, 2 mL laktik ringer çözeltisi enjekte ve% 2,5 Dekstroz başlangıçta subkutan ve başka 2 mL cerrahi sonunda.
4. Kasık alanı tıraş, sonra makaslar tarafından sol Fuzz miktarını azaltmak için dondurmacı krem ile tedavi.
5. Bir maske, baş kapak, tek kullanımlık yalıtım elbisesi ve steril eldiven takın.
6. Bir ısıtma yastığı üzerinde hayvan sırtüstü yerleştirin. Anestezi sırasında kornea aşınmalarını önlemek için oftalmik merhem uygulayın. Cerrahi bölgeyi hazırlayarak, ovalayarak ve drapeden steril bir cerrahi alan üret.
7. Neşter Blade #15 kullanarak kasık konboşlukta 3 cm cilt kesi yapın ve iris makas kullanarak yanal inguinal yağ Pad yansıtmak.
8. Ortak femoral damarlarını açığa çıkarın ve karın kaslarını geri çekmek için elastik bir bandla bir tel kanca yerleştirin.
9. Ligate ve Böl Murphy dalları.
10. 10-0 kullanarak naylon kesilmiş sütürler, anastomoze donör damarlara venöz uçtan uca tekniği ve arter uçtan uca tekniği ile alıcı gemiler. Kademeli olarak atardamardan ve sonra ven kelepçeleri bırakın. Kanama için anastomotik siteleri izleyin ve gerekirse ek sütürler ekleyin.
11. Etkili greft reperfüzyon sağlamak için vasküler anastomozu görsel olarak değerlendir.
12. İnguinal cebine greft inset ve baş aşağı yönlendirmek, ayak bileği ortak üstün ve diz eklem inferior ile.
13. Sütürler kullanarak, greftleri bitişik kaslara sabitleyin. Kesilmiş yatay yatak cilt emici 4-0 sütürler ile cilt kapatın.
14. Alıcı hayvanı anesteziden çıkartın ve ventilatörden çıkarın. Termal destek için bir ısıtma yastığı üzerine hayvan yerleştirin.
    Not: Genel çalışma süresi, cerrahın deneyimine ve Cerrahi prosedüre aşina olana bağlı olarak 3 ila 4 saat arasındadır.
15. Hayvan tamamen kurtarılana ve mobil olana kadar ağrı bastırma ve monitör için Meloksikam (1 mg/kg) subkutan yönetin.

3. VCA alıcı Izleme

1. Ev alıcısı fareler tek başına ve ağrı, dehidrasyon, kilo kaybı klinik belirtileri için günlük onları izlemek ve cerrahi yetmezliğine ek olarak (ilk 48-72 h) veya reddetme için düşük aktivite. Ağrı bastırma için ilk 3 gün boyunca günlük olarak Meloksikam subkutan (1 mg/kg) yönetin.
2. Araştırma uç noktasına dayanarak, uygulanacak bir immünosupresif ilaç seçin.

4. Histoloji

1. İnhale isofluran anestezi altında (% 2.5-% 3), istenilen zaman noktalarında seri cilt ve temel kas biyopsisini donör greftinden elde edersiniz. Cilt temizlendi ve biyopsi almadan önce drapeli ve steril bir alan ve teknik yapılmalıdır.
2. Yarayı bir ila iki dikiş ile kapatın, Emilebilen 4-0 sütürler kullanarak. Hayvanı kafesine geri döndür ve anesteziden kurtarmasına izin ver.
3. % 10 formalin içinde ayrı tüplerde biyopsi dokularda düzeltin.
4. Terminal zaman noktasında ve inhale isofluran anestezi altında (% 2.5 – 3%), donör/alıcı sınırına yayılan daha büyük bir cilt biyopsisi alın. Anastomozlar yerinde damar tasma çifti dikkatle bulun; uygun site sütürler nedeniyle belirgin olacaktır. Arter ve/veya ven istenen gemi örnekleri alın. % 10 formalin içinde tüm örnekleri ayrı olarak düzeltin. Doku örnekleri toplama sonra, ve hayvan hala Isoflurane anestezi altında iken, hemen pnömotoraks yoluyla hayvan ötenize.
5. Bir doku işlemcisi (veya diğer tercih edilen gömme tekniği) kullanarak, parafin-her biyopsi kendi bloğuna katıştırır. Cilt örnekleri için, tüm Epidermal ve dermal katmanları tek bir dilim görülebilir böylece doku yönlendirmek. Gemi örnekleri için, gemiler çapraz bölümler elde edilebilir şekilde yönlendirmek.
6. Bir mikrotome kullanarak, 6 μm kalınlığında kesimleri keser ve onları Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama için slaytlara uygulayın.
7. Standart bir protokol kullanarak H & E için leke.
8. Aydınlık alan mikroskopi tekniklerini kullanarak istenen tüm doku örneklerinin temsili görüntülerini edinin.

Sonuçlar

Sıçan VCA heterotopik hindekstremite Osteomiyokutanöz flep modeli, bağışıklık baskısı altında uzun süreli allogreft hayatta kalma sağlar. Model güvenilir, tekrarlanabilir ve gerçekleştirmek için basittir. Flep iyi kasık bölgesinde gizlidir ve hayvan için minimal morbidite ve rahatsızlık oluşturmaktadır. Cilt sunumu allogsal 'ın hayatta kalmasının ve reddedilmesinin klinik bir göstergesidir (Şekil 1). Flep tasarımı brüt klinik izleme sağlar ve lazer Doppler gi...

Tartışmalar

Bu model VCA geliştirirken, çeşitli önemli sorunlar kabul edildi. İlk olarak, kemikte bozulmamış kemik (tibia ve fibula), kemik iliği ve cilt dahil etmek önemliydi. Yetişkin bağış klinik el nakli aktif hematopoetik iliği önemli miktarlarda aktarmaz iken, kemik iliği niş rolünün çalışmaları daha iyi bir kesilmiş uzun kemik yerine, bir bozulmamış, vaskülarize kemik kullanılarak yansıtılır, hangi sonuçları gösterilen iliği fibrozis. Dahası, kapalı kemik Osteomiyokutanöz flep tasarımı ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50