Modèle de Rabat Ostéomyocutané Hétérootopique modifié dans le rat pour la recherche d’allotransplantation composite vascularisée translationnelle

Résumé

L’allogreffe composite vascularisée offre des bienfaits qui altèrent la vie aux receveurs de greffe, mais les causes biologiques du rejet du greffon et de la vasculopathie demeurent mal comprises. Le modèle chirurgical des rongeurs présenté ici offre un modèle de transplantation reproductible, cliniquement pertinent, permettant aux chercheurs d’évaluer les événements de rejet et les stratégies thérapeutiques potentielles pour prévenir leur apparition.

Résumé

L’allotransplantation composite vascularisée (VCA) est un domaine relativement nouveau dans la chirurgie reconstructive. Les réalisations cliniques dans le VCA humain comprennent les greffes de la main et du visage et, plus récemment, la paroi abdominale, l’utérus et les greffes urogénitales. Les résultats fonctionnels ont dépassé les attentes initiales, et la plupart des bénéficiaires bénéficient d’une meilleure qualité de vie. Cependant, comme l’expérience clinique s’accumule, le rejet chronique et les complications de l’immunosuppression doivent être abordées. Dans de nombreux cas où les greffés ont échoué, la pathologie causal a été la vasculopathie ischémique. Les mécanismes biologiques du rejet aigu et chronique associés à l’evt, en particulier la vasculopathie ischémique, sont des domaines importants de la recherche. Cependant, en raison du très petit nombre de patients VCA, l’évaluation des mécanismes proposés est mieux abordée dans un modèle expérimental. Plusieurs groupes ont utilisé des modèles animaux pour répondre à certaines des questions non résolues pertinentes dans le rejet VCA et la vasculopathie. Plusieurs conceptions de modèles impliquant une variété d’espèces sont décrites dans la littérature. Nous présentons ici un modèle reproductible du volet ostéomyocutané du membre postérieur de VCA hétérootopique dans le rat qui peut être utilisé pour la recherche translationnelle de VCA. Ce modèle permet l’évaluation en série de la greffe, y compris les biopsies et les différentes modalités d’imagerie, tout en conservant un faible niveau de morbidité.

Introduction

La chirurgie reconstructive pour la perte de tissu catastrophique causée par l’amputation, les blessures par explosion, les tumeurs malignes et les malformations congénitales est limitée par la disponibilité des tissus du patient et la morbidité additionnelle provoquée sur le site du donneur. Dans certains cas, comme les victimes de brûlures ou les amputés quadrilatéraux, les tissus viables pour la reconstruction ne sont pas disponibles chez le patient. En 1964, la première transplantation de main moderne a été réalisée en Équateur. Bien qu’il s’agissait d’un succès technique, l’immunosuppression disponible à l’époque était insuffisante pour prévenir le rejet, et la greffe a été perdue en moins de 3 semaines¹. En 1998 et 1999, les transplantations de première main à l’ère moderne de l’immunosuppression ont été réalisées à Lyon, France² et Louisville, Kentucky, USA³. Pour la première fois, les chirurgiens reconstructifs pourraient remplacer comme avec. La transplantation faciale a été réalisée pour la première fois en 2005⁴, et un certain nombre d’autres greffes VCA sont maintenant régulièrement exécutées, comme la paroi abdominale⁵, l’utérus et les transplantations urogénitales⁶.

Contrairement à la transplantation d’organes solides, la plupart des techniques de VCA impliquent la présence de la peau de donneur hautement antigénique. L’expérience clinique a déterminé que le rejet aigu de la peau est relativement facile à contrôler, mais peut contribuer au rejet chronique des tissus et des vaisseaux sous-jacents, qui ne répondent pas bien au traitement⁷. Le dysfonctionnement vasculaire associé à une réponse alloimmune est un obstacle plus inquiétant pour le domaine de la VCA⁷. Les macrovasculopathies entraînent des déficits de perfusion, une guérison retardée et des conditions proinflammatoires. La vasculopathie et l’hyperplasie intimique focale du grand vaisseau sont présentes dans les receveurs de greffe de main⁷. En outre, les microvasculopathies peuvent également contribuer aux complications de l’VCA et peut même conduire à des événements de rejet. Bien que les facteurs immunologiques et non-immuns jouent probablement un rôle dans la vasculopathie des receveurs de greffe de la main, les mécanismes spécifiques favorisant la dysfonction distale des vaisseaux dans le VCA ne sont pas connus, en particulier dans le contexte du rejet chronique de bas grade. Ces questions sans réponse nécessitent le développement d’un modèle animal VCA qui permettra l’évaluation en série de la greffe pendant le cours clinique de rejet/d’entretien VCA et de vasculopathie. Un tel modèle offrira un aperçu du rejet et de la vasculopathie face à l’immunosuppression, au défi infectieux et/ou à d’autres lésions traumatiques postopératoires^8,9.

Présenté ici est un modèle de Rabat ostéomyocutané du membre postérieur hétérootopique de l’VCA de rat allogénique. Sur la base des modèles VCA déjà publiés, cette procédure est techniquement facile à réaliser, reproductible dans un grand nombre, et présente une morbidité et une gêne minimes pour l’animal récepteur. Ce modèle a été conçu pour permettre des évaluations cliniques et histopathologiques de l’acceptation VCA par rapport au rejet, et offre la possibilité d’évaluer les mécanismes immunitaires et non-immuns sous-jacents impliqués dans le rejet.

Protocole

Toutes les chirurgies animales ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels de l’Université de Louisville (protocole 18198 approuvé par l’IACUC) et le guide des instituts nationaux de santé (NIH) pour le soin et l’utilisation des Animaux de laboratoire¹⁰. Mâle brun-Norvège de quatre mois (RT1. Aⁿ) et le mâle de 4 mois Lewis (RT1. A^l) les rats ont été utilisés comme donneurs et receveurs de VCA, respectivement.

1. récolte des allogreffes des donateurs

1. Séchez l’animal donneur à l’aide d’un isoflurane vaporisé appliqué dans une chambre.
2. Raser la zone de donneur de greffe (membre postérieur), ainsi que les zones de l’aine et de l’abdomen. Ensuite, traitez avec de la crème dépilatoire afin de réduire la quantité de fuzz laissée par les tondeuses.
3. Anesthésier profondément les animaux donneurs à l’aide de la kétamine intrapéritonéale (60 mg/kg)/xylazine (15 mg/kg)/Acepromazine (2 mg/kg). Administrer une dose initiale de 0,2 mL/100 g de poids corporel et des doses additionnelles de 0,2 mL chaque h. Pour plus de commodité, il est facultatif d’effectuer cette étape avant l’étape 2.
4. Surveillez continuellement les animaux pendant l’anesthésie pour la respiration, la température corporelle, et la profondeur de l’anesthésie, en utilisant le test de réflexe de retrait de pincement.
5. Administrer 30 U de solution d’héparine sous-cutanée (SC) dans la zone de lavage avant la chirurgie pour prévenir la coagulation.
6. Portez un masque, un couvre-chef, une robe d’isolement jetable et des gants jetables.
7. Placez l’animal donneur sur un coussin chauffant. Produisez un champ chirurgical stérile en préparant, en frottant et en drissant la zone chirurgicale, y compris les aspects ventraux et dorsaux de la jambe. Don de gants stériles.
8. Faire une incision cutanée de 3 cm dans la concavité de l’aine à l’aide de la lame de scalpel #15 et refléter le tampon de graisse inguinale latéralement à l’aide de ciseaux à iris.
9. Exposer les vaisseaux fémoraux communs et placer un crochet métallique avec une bande élastique pour rétracter les muscles abdominaux.
10. À l’aide d’un microscope de dissection (40x), disséquer le pédicule proximalement de l’émergence des vaisseaux fémoraux communs sous le ligament inguinale et distalement à la confluence des vaisseaux poplités dans la greffe.
11. En utilisant des microclips et des pinces de bijouteurs bipolaires, ligaturer et divisez les grandes branches artérielles et veineuses, telles que les vaisseaux fémoraux latéraux circonflexe, les vaisseaux épigastriques superficiels, l’artère saphène et les vaisseaux fémoraux caudaux proximaux, pour mobiliser les principaux vaisseaux fémoraux. Cauterize les petites branches à l’aide de pinces bipolaires fines.
12. Faire une incision cutanée à partir du centre de la peau précédente coupée le long du côté ventrale du membre postérieur, à la zone de la cheville, en utilisant des ciseaux à iris.
13. Coupez le muscle gracilis, ainsi que les autres muscles adducteur en dessous, de façon verticale pour exposer et ligature les vaisseaux géniculaires proximaux médial, les petits vaisseaux profonds ramification, et le nerf sciatique.
    Remarque: À ce stade, sur une table chirurgicale distincte, l’autre chirurgien doit intuber et anesthésier (2,5% – 3% isoflurane) l’animal récepteur; Cela permet aux chirurgiens de préparer le site chirurgical du receveur à temps pour le placement du greffon et de minimiser le temps ischémique du greffon.
14. Sur l’animal donneur, faire des incisions de la peau circonférentielle au niveau du genou et de la cheville. Désarticuler le genou et la cheville, enlever les muscles et les tissus étrangers et faire une incision cutanée verticale sur le côté dorsal du membre postérieur pour libérer la greffe. À ce stade, le greffon (composé de fibule et de tibia, recouvert de muscles apparentés et d’une île de la peau nourrie par ses perforatrices) est relié uniquement par le pédicule.
15. Placer les petits pinces aussi proximalement que possible sur l’artère fémorale et la veine, et couper le pédicule aussi proximalement que possible, près du ligament inguinale.
16. Pour rincer la greffe de sang, injecter de la solution saline hépariné (30 U/mL) dans l’artère fémorale à l’aide d’une canule émoussée de 27 G de rinçage.
    Remarque: La dilatation de l’artère avant le rinçage de l’héparine permet un accès facile à l’insertion de la canule. Au cours de la chasse, surveiller attentivement l’écoulement de la veine fémorale. Une fois que le liquide dégagé quitte la veine fémorale, arrêtez la chasse d’eau.
17. Enveloppez la greffe isolée dans une gaze tiède imbibée de solution saline et transportez-la immédiatement à la table de l’animal receveur. À ce moment, le site chirurgical du receveur devrait déjà être préparé pour l’anastomose vasculaire.
18. Après la récolte du greffon, euthanasier immédiatement le rat donneur par pneumothorax.

2. chirurgie de transplantation de receveur

1. Après l’induction de la sédation par l’isoflurane vaporisé appliqué dans une chambre, anesthésiez profondément l’animal récepteur via un tube endotrachéal contrôlé par le ventilateur et 2,5% – 3% d’isoflurane.
   Remarque: À ce stade, le rat donneur est encore anesthésié.
2. Surveillez continuellement la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire, la température corporelle et la profondeur de l’anesthésie de l’animal récepteur, en utilisant le test de réflexe de sevrage par pincement des orteils.
3. Afin d’éviter la déshydratation et l’hypoglycémie, injecter 2 mL de solution de Ringer lactée et 2,5% de dextrose par voie sous-cutanée au début et 2 mL à la fin de la chirurgie.
4. Rasez la zone de l’aine, puis traitez avec de la crème dépilatoire afin de réduire la quantité de fuzz laissée par les Clippers.
5. Portez un masque, un couvre-chef, une robe d’isolement jetable et des gants stériles.
6. Placez l’animal sur un coussin chauffant. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir les abrasions de la cornée pendant l’anesthésie. Produisez un champ chirurgical stérile en préparant, en frottant et en drayant la zone chirurgicale.
7. Faire une incision cutanée de 3 cm dans la concavité de l’aine à l’aide de la lame de scalpel #15 et refléter le tampon de graisse inguinale latéralement à l’aide de ciseaux à iris.
8. Exposer les vaisseaux fémoraux communs et placer un crochet métallique avec une bande élastique pour rétracter les muscles abdominaux.
9. Ligate et diviser les branches de Murphy.
10. En utilisant des sutures interrompues en nylon 10-0, les vaisseaux de donneur s’anastomosent aux vaisseaux récepteurs par la technique veineuse de bout en bout et la technique artérielle de bout en extrémité. Relâchez graduellement les pinces de l’artère puis de la veine. Surveillez les sites anastomotiques pour les saignements et ajoutez des sutures supplémentaires si nécessaire.
11. Évaluer visuellement l’anastomose vasculaire afin d’assurer une reperfusion efficace de la greffe.
12. Encart la greffe dans la poche inguinale et l’orienter à l’envers, avec l’articulation de la cheville supérieure et l’articulation du genou inférieure.
13. En utilisant des sutures de rentrant, fixez la greffe aux muscles adjacents. Fermez la peau par l’intermédiaire d’une peau de matelas horizontale interrompue absorbable 4-0 sutures.
14. Enlevez l’animal du receveur de l’anesthésie et sevtez-le de l’aérateur. Placez l’animal sur un coussin chauffant pour le support thermique.
    Remarque: La durée de fonctionnement globale est comprise entre 3 et 4 h, selon l’expérience du chirurgien et la connaissance de l’intervention chirurgicale.
15. Administrer le méloxicam (1 mg/kg) sous-cutanée pour la suppression de la douleur et surveiller jusqu’à ce que l’animal soit entièrement récupéré et mobile.

3. surveillance du destinataire VCA

1. Loger les rats receveurs individuellement et les surveiller quotidiennement pour des signes cliniques de douleur, de déshydratation, de perte de poids, et une diminution de l’activité en plus d’une défaillance chirurgicale (pour les premières 48 – 72 h) ou le rejet. Administrer le méloxicam par voie sous-cutanée (1 mg/kg) par jour pendant les 3 premiers jours pour la suppression de la douleur.
2. En fonction du point de terminaison de la recherche, choisissez un médicament immunosuppresseur à administrer.

4. histologie

1. Sous anesthésie à l’isoflurane inhalée (2,5% – 3%), obtenir la peau sérielle et les biopsies musculaires sous-jacentes de la greffe du donneur aux points de temps souhaités. La peau doit être nettoyée et drapée avant d’obtenir une biopsie, et un champ et une technique stériles doivent être exécutés.
2. Fermez la plaie avec un à deux points, en utilisant des sutures 4-0 absorbables. Retournez l’animal à sa cage et laissez-le se rétablir de l’anesthésie.
3. Fixer les tissus biopsiés dans des tubes distincts dans 10% de formol.
4. Au point de temps terminal et sous anesthésie isoflurane inhalée (2,5% – 3%), prendre une plus grande biopsie cutanée qui s’étend sur la bordure du donneur/receveur. Localisez soigneusement la paire de laisse de navire sur le site des anastomoses; le site approprié sera apparent en raison des sutures. Prélever les échantillons de vaisseaux souhaités de l’artère et/ou de la veine. Fixer tous les échantillons séparément dans 10% de formol. Après la collecte des échantillons de tissus, et tandis que l’animal est encore sous anesthésie isoflurane, immédiatement euthanasier l’animal par pneumothorax.
5. À l’aide d’un processeur tissulaire (ou d’une autre technique d’incorporation préférée), incorporer chaque biopsie dans son propre bloc. Pour les échantillons cutanés, orientez le tissu de façon à ce que toutes les couches épidermiques et cutanées puissent être observées en une seule tranche. Pour les échantillons de vaisseaux, orienter les vaisseaux de sorte que les coupes transversales puissent être obtenues.
6. À l’aide d’un microtome, coupez des sections de 6 μM d’épaisseur et appliquez-les aux lames pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E).
7. Tache pour H & E en utilisant un protocole standard.
8. Obtenez des images représentatives de tous les échantillons de tissus souhaités à l’aide de techniques de microscopie fond clair.

Résultats

Le modèle de Rabat ostéomyocutané du membre postérieur hétérootopique du rat VCA permet une survie à long terme de l’allogreffe sous immunosuppression. Le modèle est fiable, reproductible et simple à réaliser. Le rabat est bien caché dans la zone de l’aine et constitue une morbidité et un inconfort minimes pour l’animal. La présentation cutanée est une manifestation clinique de la survie et du rejet de l’allogreffe (figure 1). La conception des volets permet une surveil...

Discussion

Dans l’élaboration de ce modèle d’EVC, plusieurs questions clés ont été examinées. Premièrement, il était important d’inclure l’OS intact (tibia et péroné), la moelle osseuse et la peau dans la greffe. Bien que les greffes cliniques de mains de donneurs adultes ne transfèrent pas de quantités significatives de moelle hématopoïétique active, les études du rôle de la niche de la moelle osseuse sont mieux reflétées à l’aide d’un OS intact, vascularisé plutôt que d’un os long coupé, ce qu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50