Modificato Eterotopic Hindarto Osteomyocutaneo flap modello nel ratto per traslazionale vascolarizzazione composito Allotransplantazione ricerca

Riepilogo

L'alloinnesto in composito vascolarizzato offre benefici che alterano la vita ai riceventi trapianti, ma le cause biologiche del rigetto del trapianto e della vascolopatia restano poco comprese. Il modello chirurgico del roditore presentato qui offre un modello di trapianto riproducibile e clinicamente rilevante, permettendo ai ricercatori di valutare gli eventi di rigetto e le potenziali strategie terapeutiche per prevenirne l'insorgenza.

Abstract

L'allotrandisplazione composita vascolarizzata (VCA) è un campo relativamente nuovo nella chirurgia ricostruttiva. Risultati clinici in VCA umano includono trapianti di mano e viso e, più recentemente, parete addominale, utero, e trapianti urogenitali. I risultati funzionali hanno superato le aspettative iniziali e la maggior parte dei destinatari godono di una migliore qualità della vita. Tuttavia, poiché l'esperienza clinica si accumula, deve essere affrontato il rigetto cronico e le complicazioni derivanti dall'immunosoppressione. In molti casi in cui gli innesti sono falliti, la patologia causativa è stata la vascolopatia ischemica. I meccanismi biologici del rigetto acuto e cronico associato con VCA, in particolare vascolopatia ischemica, sono importanti aree di ricerca. Tuttavia, a causa del numero molto ridotto di pazienti VCA, la valutazione dei meccanismi proposti è meglio affrontata in un modello sperimentale. Più gruppi hanno utilizzato modelli animali per affrontare alcune delle domande irrisolte pertinenti nel rigetto VCA e vascolopatia. Diversi modelli di modelli che coinvolgono una varietà di specie sono descritti in letteratura. Qui presentiamo un modello riproducibile di flap di osteomiocutanea dell'arto posteriore eterotopico VCA nel ratto che può essere utilizzato per la ricerca traslazionale VCA. Questo modello consente la valutazione seriale dell'innesto, comprese le biopsie e le diverse modalità di imaging, mantenendo un basso livello di morbilità.

Introduzione

La chirurgia ricostruttiva per la perdita di tessuto catastrofico da amputazione, ferite da esplosione, neoplasie maligne e difetti congeniti è limitata dalla disponibilità di tessuto dal paziente e dalla morbilità aggiuntiva causata dal sito donatore. In alcuni casi, come le vittime di ustioni o amputati quadrilatero, tessuto vitale per la ricostruzione non è disponibile dal paziente. In 1964, il primo trapianto di mano moderna è stato eseguito in Ecuador. Mentre questo è stato un successo tecnico, l'immunosoppressione disponibile al momento era insufficiente per prevenire il rigetto, e l'innesto è stato perso in meno di 3 settimane¹. In 1998 e 1999, i trapianti di prima mano nell'era moderna dell'immunosoppressione sono stati eseguiti a Lione, Francia² e Louisville, Kentucky, USA³. Per la prima volta, i chirurghi ricostruttivi potrebbero sostituirsi con simili. Il trapianto di viso è stato eseguito per la prima volta in 2005 e⁴, e un certo numero di altri innesti VCA sono ora regolarmente eseguiti, come ad esempio la parete addominale⁵, uterine, e trapianti urogenitali⁶.

A differenza del trapianto di organi solidi, la maggior parte delle tecniche VCA coinvolge la presenza della pelle del donatore altamente antigenico. L'esperienza clinica ha determinato che il rigetto acuto della pelle è relativamente facile da controllare, ma può contribuire al rigetto cronico dei tessuti e delle navi sottostanti, che non rispondono bene al trattamento⁷. La disfunzione vascolare associata ad una risposta alloimmunitaria è un ostacolo più minaccioso per il campo di VCA⁷. Le macrovascolopatie portano a deficit di perfusione, guarigione ritardata e condizioni proinfiammatorie. Sia la vascolopatia di grande vaso aggressiva confluente che l'iperplasia focale intimale si verificano nei riceventi di trapianto a mano⁷. Inoltre, microvascolopatie probabilmente contribuiscono a complicazioni VCA e possono anche portare a eventi di rigetto. Mentre entrambi i fattori immuni e non immuni probabilmente giocano un ruolo nella vascolopatia dei destinatari del trapianto di mano, i meccanismi specifici che promuovono la disfunzione del vaso distale in VCA non sono noti, in particolare nel contesto del rigetto cronico di bassa qualità. Queste domande senza risposta richiedono lo sviluppo di un modello di VCA animale che permetterà la valutazione seriale del trapianto durante il decorso clinico di rigetto/mantenimento VCA e vascolopatia. Tale modello offrirà approfondimenti sul rigetto e sulla vascolopatia di fronte all'immunosoppressione, alla sfida infettiva e/o ad altre lesioni traumatiche post-operatorie^8,9.

Qui presentato è un ratto allogenico VCA eterotopic hindarto modello di lembo osteomiocutaneo. Sulla base dei modelli VCA precedentemente pubblicati, questa procedura è tecnicamente facile da eseguire, riproducibile in un numero elevato e presenta una morbilità e un disagio minimi per l'animale ricevente. Questo modello è stato progettato per consentire valutazioni cliniche e istopatologiche dell'accettazione VCA contro il rigetto, e offre l'opportunità di valutare i meccanismi immunitari e non immunitari sottostanti coinvolti nel rigetto.

Protocollo

Tutte le operazioni di chirurgia animale sono state eseguite in conformità con i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Louisville (protocollo approvato IACUC 18198) e la guida nazionale istituti di salute (NIH) per la cura e l'uso di Animali da laboratorio¹⁰. 4-mese-vecchio maschio Brown-Norway (RT1. Aⁿ) e 4-mese-vecchio maschio Lewis (RT1. A^l) i ratti sono stati usati rispettivamente come donatori VCA e riceventi.

1. raccolta dell'Alloinnesto del donatore

1. Sedate l'animale donatore utilizzando l'isoflurano vaporizzato applicato attraverso una camera.
2. Radersi l'area del donatore dell'innesto (arto posteriore), così come le aree dell'inguina e dell'addome. In seguito, trattare con crema depilatoria al fine di ridurre la quantità di Fuzz lasciati dai Clippers.
3. Anestetizzare profondamente gli animali donatori usando la chetamina intraperitoneale (IP) (60 mg/kg)/Xylazine (15 mg/kg)/acepromazina (2 mg/kg). Somministrare una dose iniziale di 0,2 mL/100 g di peso corporeo e dosi aggiuntive di 0,2 mL ogni h. Per comodità, è facoltativo eseguire questo passaggio prima del passaggio 2.
4. Monitorare continuamente gli animali durante l'anestesia per la respirazione, la temperatura corporea e la profondità di anestesia, utilizzando il test reflex di ritiro della punta.
5. Somministrare 30 U di soluzione di eparina per via sottocutanea (SC) nell'area di Scruff prima dell'intervento chirurgico per prevenire la coagulazione.
6. Indossa una maschera, un copritesta, un abito monouso di isolamento e guanti monouso.
7. Collocare l'animale donatore supina su un tampone riscaldante. Produrre un campo chirurgico sterile prepreparando, strofinando e drappendo l'area chirurgica, compresi gli aspetti sia ventrale che dorsale della gamba. Indossa i guanti sterili.
8. Fare un 3 cm incisione della pelle nella concavità inguine utilizzando lama bisturi #15 e riflettere il pad grasso inguinale lateralmente utilizzando forbici Iris.
9. Esporre i vasi femorali comuni e posizionare un gancio di filo con una fascia elastica per ritrarre i muscoli addominali.
10. Utilizzando un microscopio dissezione (40x), sezionare il pedofilo prossimamente dall'emergere dei comuni vasi femorali sotto il legamento inguinale e distalmente alla confluenza dei vasi poplitei nel trapianto.
11. Utilizzando microclip e pinze di gioiellieri bipolari, legare e dividere i grandi rami arteriosi e venoso, come i vasi femorali accento circonflesso laterali, vasi epigastrici superficiali caudali, l'arteria safena, e prossimale vasi femorali caudali, per mobilitare le principali navi femorali. Cauterizzare eventuali piccoli rami utilizzando pinze bipolari fini.
12. Fare un'incisione della pelle dal centro della pelle precedente tagliato lungo il lato ventrale dell'arto posteriore, alla zona della caviglia, utilizzando le forbici Iris.
13. Tagliare il muscolo gracilis, così come gli altri muscoli adduttori sotto di esso, in modo verticale per esporre e ligare i vasi genicolari prossimali mediali, vasi di piccole ramificazione profonde, e il nervo sciatico.
    Nota: A questo punto, su un tavolo chirurgico separato, l'altro chirurgo deve intubare e anestetizzare (2,5% – 3% isoflurano) l'animale ricevente; Questo permette ai chirurghi di preparare il sito chirurgico ricevente in tempo per il posizionamento dell'innesto e minimizzare il tempo ischemico del trapianto.
14. Sull'animale donatore, fare incisioni della pelle circonferenziale a livello del ginocchio e della caviglia. Disarticolare il ginocchio e la caviglia, rimuovere i muscoli e i tessuti estranei e fare un'incisione cutanea verticale sul lato dorsale dell'arto posteriore per liberare l'innesto. A questo punto, l'innesto (composto da perone e tibia, ricoperto di muscoli correlati e isola della pelle nutriti dai suoi perforatori) è collegato solo dal pedicolo.
15. Posizionare i piccoli morsetti il più prossimamente possibile sull'arteria femorale e sulla vena, e tagliare il pedicolo il più prossimamente possibile, vicino al legamento inguinale.
16. Per sciacquare l'innesto di sangue, iniettare una soluzione salina eparinizzata (30 U/mL) nell'arteria femorale utilizzando una cannula smussata da 27 G.
    Nota: Dilatare l'arteria prima del filo di eparina consente un facile accesso per l'inserimento della cannula. Durante il risciacquo, monitorare attentamente il deflusso dalla vena femorale. Una volta che il fluido limpido esce dalla vena femorale, fermare lo sciacquone.
17. Avvolgere l'innesto isolato in una garza tiepida e imbevuta di acqua salata e trasporla immediatamente al tavolo dell'animale ricevente. In questo momento, il sito chirurgico ricevente dovrebbe già essere preparato per anastomosi vascolare.
18. Dopo la raccolta del trapianto, immediatamente eutanizzare il ratto donatore via Pneumothorax.

2. chirurgia trapianto ricevente

1. Dopo l'induzione della sedazione utilizzando l'isoflurano vaporizzato applicato attraverso una camera, anestetizzare profondamente l'animale ricevente attraverso un tubo endotracheale controllato dal ventilatore e il 2,5% – 3% isoflurano.
   Nota: In questa fase, il ratto donatore è ancora anestetizzato.
2. Monitorare continuamente la frequenza cardiaca, la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e la profondità di anestesia dell'animale ricevente, utilizzando il test reflex di ritiro della punta.
3. Al fine di prevenire la disidratazione e l'ipoglicemia, iniettare 2 mL di soluzione di Ringer lattato e 2,5% destrosio per via sottocutanea all'inizio e un altro 2 mL alla fine dell'intervento chirurgico.
4. Radersi la zona inguina, quindi trattare con crema depilatoria al fine di ridurre la quantità di Fuzz lasciati dai Clippers.
5. Indossa una maschera, una copertura della testa, un abito monouso di isolamento e guanti sterili.
6. Collocare l'animale supina su un tampone riscaldante. Applicare unguento oftalmico per prevenire le abrasioni corneali durante l'anestesia. Produrre un campo chirurgico sterile prepreparando, strofinando e drappendo l'area chirurgica.
7. Fare un 3 cm incisione della pelle nella concavità inguine utilizzando lama bisturi #15 e riflettere il pad grasso inguinale lateralmente utilizzando forbici Iris.
8. Esporre i vasi femorali comuni e posizionare un gancio di filo con una fascia elastica per ritrarre i muscoli addominali.
9. Legarsi e dividere rami Murphy.
10. Utilizzando 10-0 nylon interrotto suture, anastomose vasi donatori a vasi riceventi attraverso la tecnica end-to-side venosa e tecnica end-to-end arterioso. Rilasciare gradualmente i morsetti dall'arteria e poi la vena. Monitorare i siti anastomotici per sanguinamento e aggiungere ulteriori suture se necessario.
11. Valutare visivamente l'anastomosi vascolare al fine di garantire un'efficace riperfusione del trapianto.
12. Posizionare l'innesto nella tasca inguinale e orientarlo a testa in giù, con l'articolazione superiore della caviglia e l'articolazione del ginocchio inferiore.
13. Usando le suture, fissare l'innesto ai muscoli adiacenti. Chiudere la pelle tramite un materasso orizzontale interrotte assorbibable 4-0 suture.
14. Rimuovere l'animale ricevente dall'anestesia e Svevia il ventilatore. Collocare l'animale su un tampone riscaldante per il supporto termico.
    Nota: Il tempo di funzionamento complessivo è tra 3 a 4 h, a seconda dell'esperienza del chirurgo e conoscenza con la procedura chirurgica.
15. Somministrare meloxicam (1 mg/kg) per via sottocutanea per la soppressione del dolore e il monitor fino a quando l'animale è completamente recuperato e mobile.

3. monitoraggio del destinatario VCA

1. Casa i ratti ricevente singolarmente e monitorarli quotidianamente per i segni clinici di dolore, disidratazione, perdita di peso, e diminuzione dell'attività in aggiunta al fallimento chirurgico (per il primo 48 – 72 h) o rigetto. Somministrare meloxicam per via sottocutanea (1 mg/kg) al giorno per i primi 3 giorni per la soppressione del dolore.
2. Sulla base dell'endpoint di ricerca, scegliere un farmaco immunosoppressore da somministrare.

4. l'istologia

1. In anestesia isoflurano inalata (2,5%-3%), ottenere la pelle seriale e le biopsie muscolari sottostanti dal trapianto del donatore ai punti temporali desiderati. La pelle deve essere strofinata e drappeggiata prima di ottenere una biopsia, e un campo sterile e tecnica dovrebbe essere eseguita.
2. Chiudere la ferita con uno o due punti di sutura, utilizzando 4-0 riassorbibibili. Riportare l'animale alla sua gabbia e permettergli di riprendersi dall'anestesia.
3. Fissare i tessuti biopsia in tubi separati in formalina al 10%.
4. Al punto di tempo terminale e sotto anestesia isoflurano inalato (2,5%-3%), prendere una biopsia cutanea più grande che si estende il donatore/beneficiario confine. Individuare con attenzione la coppia di guinzaglio del vaso nel sito di anastomoses; il sito corretto sarà evidente a causa delle suture. Prelevare i campioni di vaso desiderati dall'arteria e/o dalla vena. Fissare tutti i campioni separatamente nel 10% di formalina. Dopo la raccolta di campioni di tessuto, e mentre l'animale è ancora in anestesia isoflurano, immediatamente eutanizzare l'animale tramite Pneumothorax.
5. Utilizzando un processore tissutale (o altra tecnica di incorporamento preferito), la paraffina incorpora ogni biopsia nel proprio blocco. Per i campioni di pelle, orientare il tessuto in modo che tutti gli strati epidermici e cutanei possano essere osservati in una singola fetta. Per i campioni di imbarcazioni, orientare i vasi in modo che possano essere ottenute sezioni trasversali.
6. Utilizzando un microtomo, tagliare le sezioni spesse 6 μm e applicarle alle diapositive per la colorazione di ematossilina e eosina (H & E).
7. Macchia per H & E utilizzando un protocollo standard.
8. Ottenere immagini rappresentative di tutti i campioni di tessuto desiderati utilizzando tecniche di microscopia campo chiaro.

Risultati

Il modello di lembo eterotopico dell'arto posteriore del ratto VCA consente la sopravvivenza a lungo termine dell'alloinnesto sotto immunosoppressione. Il modello è affidabile, riproducibile e semplice da eseguire. La patta è ben nascosta nella zona dell'inguina e costituisce una minima morbilità e disagio per l'animale. La presentazione cutanea è una manifestazione clinica della sopravvivenza e del rigetto dell'alloinnesto (Figura 1). Il design del flap consente il monitoraggio clinico ...

Discussione

Nello sviluppo di questo modello di VCA, sono state prese in considerazione diverse questioni chiave. In primo luogo, era importante includere osso intatto (tibia e perone), midollo osseo, e la pelle nel trapianto. Mentre i trapianti clinici a mano da donatori adulti non trasferiscono quantità significative di midollo ematopoietico attivo, gli studi del ruolo della nicchia del midollo osseo sono meglio specchiati utilizzando un osso vascolarizzato intatto piuttosto che un osso lungo tagliato, che si traduce in fibrosi d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50