JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

المداواة ميرنا لديها إمكانات كبيرة في تنظيم تطور السرطان. أثبت هنا النهج التحليلية تستخدم لتحديد النشاط لعلاج ميرنا اندماجي في وقف دورة الخلية والأوعية.

Abstract

سرطان الرئة (LC) هو السبب الرئيسي للوفيات المتصلة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. مماثلة لغيرها من الخلايا السرطانية، سمات أساسية للخلايا LC هو الانتشار غير المنظم وانقسام الخلية. تثبيط الانتشار بوقف تقدم دورة الخلية قد ثبت أن يكون نهجاً واعداً لعلاج السرطان، بما في ذلك قانون العمل.

المداواة ميرنا قد برزت بوصفها المنظمين الجينات بوستترانسكريبشونال هام ومتزايد وتجري الآن دراسة لاستخدامها في علاج السرطان. أننا استخدمت في الأعمال الأخيرة، ميرناس اثنين، مير-143 ومير-506، لتنظيم دورة الخلية التقدم. تم transfected الخلايا السرطانية (NSCLC) الرئة الخلية غير الصغيرة A549، تم تحليل التعديلات التعبير الجيني، وأخيراً وقد تم تحليل نشاط أبوبتوتيك بسبب العلاج. تم الكشف عن دوونريجوليشن من cyclin تعتمد على مؤنزم (كدكس) (أي، CDK1، CDK4 و CDK6)، وتوقف دورة الخلية في التحولات المرحلة G1/S و G2/M. وأظهر تحليل مسار نشاط الأوعية المحتملة للعلاج، مما يمنح هذا النهج مع نشاط متعدد الأوجه. هنا، يتم وصف المنهجيات المستخدمة لتحديد النشاط ميرنا فيما يتعلق بتثبيط دورة الخلية، وتنظيم دورات تعريفية للمبرمج، وآثار العلاج على خلايا بطانية بتثبيط تولد الأوعية. من المؤمل أن الأساليب المعروضة هنا سيدعم البحوث في المستقبل على المداواة ميرنا والنشاط المقابلة وأن بيانات تمثيلية سيرشد الباحثين الآخرين خلال التحليلات التجريبية.

Introduction

دورة الخلية هو مزيج من الأحداث التنظيمية المتعددة التي تسمح بالازدواجية في انتشار الحمض النووي والخلية عن طريق عملية الانقسامية1. تعتمد على cyclin مؤنزم (كدكس) تنظيم وتعزيز دورة الخلية2. فيما بينها، قد CDK الانقسامية (CDK1) والطور البيني كدكس (CDK2 و CDK4 و CDK6) دوراً محوريا في تطور دورة الخلية3. هو فوسفوريلاتيد البروتين الشبكية (الميزانية العادية) بمجمع CDK4/CDK6 للسماح بتقدم دورة الخلية4، وتفعيل CDK1 أمر ضروري لنجاح انقسام الخلية5. تم تطوير العديد CDK مثبطات وتقييمها في التجارب السريرية على مدى العقود القليلة الماضية، مما يشير إلى إمكانية استهداف كدكس في علاج السرطان. في الواقع، تمت الموافقة على ثلاثة CDK مثبطات لعلاج سرطان الثدي مؤخرا6،،من78،،من910. وهكذا، كدكس، وعلى وجه الخصوص، CDK1 و CDK4/6، ذات أهمية كبيرة في تنظيم تطور سرطان الخلية.

ميرناس (ميرس) يتم الكشف الصغيرة، غير الترميز والمنظمين بوستترانسكريبشونال التعبير الجيني، وتنظيم ما يقرب من 30 في المائة من جميع الجينات البشرية11. يستند نشاطها القمع متعدية أو تدهور رسول الكشف (مرناس)12. توضيحية لأهميتها البيولوجية، تم تحديد أكثر من 5,000 ميرناس ويمكن تنظيم جزيء ميرنا وحيدة متعددة الجينات11،13. الأهم من ذلك، ارتبط تعبير ميرنا من أمراض مختلفة، وحالات المرض، بما في ذلك السرطان13. في الواقع، قد اتسمت ميرناس كما النمطان أو المكثفات الورم، قادرة على تعزيز أو قمع الورم التنمية والتقدم14،15. ويمكن تنظيم التعبير النسبي عن ميرناس في الأنسجة المريضة تطور المرض؛ وهكذا، تسليم خارجية ميرناس إمكانات علاجية.

سرطان الرئة السبب الرئيسي للوفيات الناجمة عن السرطان وأكثر من 60 في المائة من جميع الأورام الخبيثة في الرئة غير الصغيرة خلايا الرئة السرطان16،17، مع معدل البقاء على قيد الحياة 5 سنوات أقل من 20%18. تم تقييم استخدام مير-143-3 ف وف مير-506-3 مؤخرا لاستهداف دورة الخلية في خلايا سرطان الرئة11. مير-143 ومير-506 متواليات التي التكامل بين CDK1 و CDK4/CDK6، وتم تحليل آثار هذه ميرس اثنان على خلايا A549. تفاصيل تجريبية تعرض وتناقش في هذه الورقة. تم تقييم التعبير الجيني، وتقدم دورة الخلية، والمبرمج استخدام تصاميم تجريبية مختلفة وتيميبوينتس عقب تعداء. كنا في الوقت الحقيقي الأساليب الكمية بكر (RT-qPCR) جنبا إلى جنب مع تحليل ميكرواري لقياس التعبير الجيني محددة، واستخدمت الجيل التالي تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد الجينات العالمية التقلبات11. ويحدد طريقة الأخيرة الوفرة النسبية لنسخة كل مورثة مع حساسية عالية وإمكانية تكرار نتائج، بينما آلاف جينات يمكن أن تحلل من تحليل تجريبي واحد. بالإضافة إلى ذلك، أنجز تحليل أبوبتوتيك بسبب العلاج ميرنا ويرد هنا. المعلوماتية الحيوية استكمال تحليل المسار. المقدمة هنا هي البروتوكولات المستخدمة لتحليل العلاجية المحتملة من اندماجي مير-143 ومير-506.

والغرض الرئيسي من هذا البروتوكول تحديد آثار ميرناس في الخلايا، مع تركيز على دورة الخلية. مجموعة متنوعة التقنيات المقدمة هنا تمتد من تحليل التعبير الجيني قبل الترجمة (باستخدام qPCR) لوضع ورواية تقنيات لتحليل الجينات على مستوى البروتين، مثل تحليل ميكرواري. ونأمل أن هذا التقرير مفيد للباحثين المهتمين بالعمل مع ميرناس. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم منهجية لتحليل تدفق سيتوميتريك دورة الخلية والمبرمج للخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-مير-143 و 506 مير تعداء

تحذير: استخدام قفازات مطاط والنظارات الواقية، ومعطف مختبر أثناء إجراء التجارب الموصوفة. وعند الاقتضاء، استخدام مجلس الوزراء السلامة الأحيائية مع مروحة مجلس الوزراء، دون عرقلة الخطوط الجوية أو مثيرة للقلق في تدفق الهواء الصفحي. دوماً تعيين حماية زجاج النافذة إلى الارتفاع المناسب، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

  1. خلايا NSCLC A549 البذور في T25 سم2 قارورة/6/96 صفيحة في وسائط الإعلام دميم/F12K وتستكمل مع 10 ٪، FBS و 1% البنسلين-ستربتوميسين (ثقافة وسائل الإعلام) في غطاء زراعة الأنسجة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في حاضنة زراعة الأنسجة.
  2. تعليق يقلد مير-143 و/أو مير-506، أو يتبارى siRNA مع وكيل ترانسفيكتينج (2.4 ميكروغرام من مير كانت مختلطة مع 14 ميليلتر من عامل ترانسفيكتينج؛ انظر الجدول للمواد) في 500 ميليلتر من تعداء وسائل الإعلام و 1.5 مل من المصل وخالية من المضادات الحيوية دميم/F12K وسائل الإعلام في ميرنا النهائي تركيز 100 نانومتر. قد تتطلب مقدار ميرنا الأمثل في خلايا مختلفة وتركيزات. وتشمل النهج المناسبة تعداء الخلايا مع زيادة تركيزات ميرنا (أي، 50-200 نانومتر) وتقييم downregulation التعبير للجينات للفائدة.
  3. قم بإزالة وسائط الثقافة من قارورة/لوحة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x.
  4. إضافة مجمعات عامل ميرنا/التدافع-ترانسفيكتينج واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 6 (حجم قارورة يحدد حجم حاضنات وأضاف).
  5. استبدال وسائط الإعلام مع 4 مل وسائط الثقافة واحتضان خلايا ح 24 أو 48 ساعة.
  6. حصاد transfected الخلايا من تريبسينيزيشن، بإضافة 1 مل من التربسين-يدتا في كل قارورة2 سم T25 واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وأضف 3 مل وسائط الثقافة لحصاد الخلايا. وضع محتويات كل قارورة في أنبوب منفصل، ملحوظة 15 مل. ويعمل في غطاء زراعة الأنسجة.
  7. الطرد المركزي في 751 x ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
    ملاحظة: الحذر مطلوب أثناء إزالة طافية، كما الانفعالات الأنبوب قد يسبب فقدان الخلايا.
  8. إضافة 2 مل 1 x برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 751 x غ.
  9. كرر الخطوتين 7 و 8 مرة واحدة لإزالة أي آثار لوسائل الإعلام والمادة طافية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، أنابيب عينة يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية أو يمكن استخدامها فورا.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. تنظيف مساحة العمل بالرش مع كحول الأيزوبروبيل 70% والحل رناسي إزالة التلوث.
  2. ينبغي إجراء استخراج الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي مناسبة باستخدام كيت (انظر الجدول للمواد).
  3. إزالة الأنابيب من-80 درجة مئوية والسماح لها بالذوبان. إضافة 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل وماصة صعودا وهبوطاً لكسر غشاء الخلية.
  4. إضافة وحدة تخزين متساوية من الإيثانول فائقة نقية 100%.
  5. تخلط جيدا وتوضع في فصل عمود.
  6. الطرد المركزي بين 11 16 x ز 30 ثانية وإزالة التدفق من خلال.
  7. إضافة 400 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت والطرد المركزي لإزالة المخزن المؤقت.
  8. إضافة 5 ميليلتر من الدناز أنا مع ميليلتر 75 من هضم الحمض النووي المخزن المؤقت في كل عينة واحتضان لمدة 15 دقيقة.
  9. تغسل العينة مع 400 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الإعدادية المخزن المؤقت.
  10. أغسل x 2 مع الحمض النووي الريبي يغسل المخزن المؤقت.
  11. إضافة خالية نوكلاس المياه إلى العمود، الطرد المركزي، ثم جمع الجيش الملكي النيبالي.
  12. قياس تركيز الحمض النووي الريبي الإجمالي مع جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية.

3-RT-قبكر

  1. قبل RT-قبكر، توليف كدنا. بعد تقدير تركيز الحمض النووي الريبي، ضع 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي بحجم نهائي 20 ميليلتر في رد فعل على إعداد كدنا في أنبوب PCR. تعمل دائماً على مقاعد البدلاء نظيفة.
  2. يتم تضمين كافة المكونات الضرورية الأخرى في الجدول 1.
المكوناتالكمية (ميليلتر)/نموذج (20 ميليلتر)
5 X cDNA ماستر ميكس4
دنتبس2
هيكساميرس عشوائي1
RT محسن1
ميكس إنزيم الصفحة اليسرى1
الدناز ورناسي المياه مجاناًالكمية المطلوبة بعد إضافة الحمض النووي الريبي لجعل 20 ميليلتر

الجدول 1: المواد لتوليف كدنا من عينات الحمض النووي الريبي. مطلوب كميات من المكونات الخاصة بكل منها لإعداد مزيج رئيسي لنموذج واحد لتوليف كدنا.

  1. احتضان في cycler حرارية مع ظروف الحرارة التالية: 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 4 درجة مئوية حتى جمع العينات.
  2. استخدام فورا في العادية PCR أو قبكر، أو تخزين كدنا في-20 درجة مئوية.
  3. إعداد الحلول إلى الأمام وعكس التمهيدي مع خالية من الدناز/رناسي الماء بتركيز 10 ميكرون من حل التمهيدي الأسهم.
  4. إعداد يمزج رئيسي منفصل لكل الجينات ليتم اكتشافها، وفقا لعدد العينات. لكل عينة كدنا (qPCR جيدا)، أعد كمية رد الفعل وفقا الجدول 2.
المكوناتالكمية (ميليلتر)/نموذج (20 ميليلتر)
مزيج الرئيسي سيبر10
التمهيدي إلى الأمام-10 ميكرومتر2
عكس التمهيدي-10 ميكرومتر2
الدناز ورناسي المياه مجاناً3
عينة كدنا3

الجدول 2: مواد الكمي PCR الوقت الحقيقي من عينات كدنا. مطلوب كمية من المكونات لإعداد مزيج رئيسي لنموذج واحد قبكر.

  1. ضع كل عينة في الآبار الخاصة بكل منها.
  2. تصميم تخطيط نموذج للوحة 96 qPCR جيدا. لكل نموذج وتحليل الجينات، القيام رد فعل في تريبليكاتيس، أو في التكرارات في الأقل.
  3. ختم 96 لوحة جيدا مع غلاف لاصق بصريا واضحة.
  4. سريع-سبين لوحة للسماح لخليط التفاعل للوصول إلى الجزء السفلي من كل بئر.
  5. قم بتشغيل قبكر RT وفقا للتدرج الحراري التالية:
    1) 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
    2) 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
    3) 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية
    4) أخذ قراءة
    5) 60 درجة مئوية لمدة دقيقة 1.5
    6) كرر الخطوة 3 مرات 39
  6. تشغيل التدرج الحراري التالي استمرارا لما ورد أعلاه لتحديد منحنى الانصهار الذي يشير إلى التضخيم منتج واحد.
    7) 65 درجة مئوية لمدة دقيقة 0.31
    0.5 درجة مئوية/دورة
    9) قراءة لوحة
    10) كرر الخطوة 8 مرات 60 حتى وصلت إلى 95 درجة مئوية
    11) 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة

4-[اغروس] هلام التفريد لتأكيد وحيدة الجين التضخيم

  1. إعداد 1% [اغروس] هلام في المخزن المؤقت x TBE 1.
  2. إضافة اثيديوم بروميد (أتبر) في جل الحار (~ 50 درجة مئوية) حتى بلوغ نهائي تركيز حوالي 0.2-0.5 ميكروغرام/مل. أتبر يربط مع الحمض النووي، ويسمح بتصور تحت ضوء في تصوير جل الأشعة فوق البنفسجية.
  3. صب جل الحارة في علبة جل الموردة مع مربع هلام التفريد. إرفاق مشط قدم محكم لآبار موحدة.
  4. السماح الهلام للراحة وباردة بدرجة حرارة الغرفة (RT) ~ 30 دقيقة.
  5. عندما وطدت الهلام، هو وضع جل وصينية في مربع هلام.
  6. ملء مربع هلام مع المخزن المؤقت x TBE 1 حتى تغطي تماما الهلام.
  7. قياس تركيز الحمض النووي من بكر عملية التضخيم باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
  8. تأخذ ~ 15 نانوغرام من الحمض النووي في أنبوب بكر صغير، إضافة 5 ميليلتر من الصبغ، وإضافة الكمية المطلوبة من المياه خالية من نوكلياسي لتحقيق إجمالي 15 ميليلتر.
  9. تحميل سلم الحمض النووي وعينات في الآبار.
  10. تشغيل الهلام في 100 الخامس حتى يصبح السطر صبغ حوالي 75%-80% أسفل الجل.
    ملاحظة: تأكد من الهلام يمتد من سلبية إلى الإيجابية تهمة.
  11. إزالة الهلام ووضعه في تصوير جل لتصور الحمض النووي.

5-دورة الخلية تحليل

  1. البذور 5 × 105 خلايا لكل عينة في قارورة2 سم T25 وأداء من تعداء وفقا للبروتوكول، المذكورة في القسم 1، الخطوات من 1 إلى 5.
  2. بعد 24 ساعة و 48 ساعة، ثم حصاد الخلايا من تريبسينيزيشن.
  3. نقل تعليق خلية في أنابيب معقمة 15 مل وتسميتها بشكل صحيح.
  4. الطرد المركزي عينات في 751 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
  5. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج، ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي في 751 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  6. كرر الخطوة الغسيل مع برنامج تلفزيوني x 1 إزالة الوسائط المتبقية.
  7. ريسوسبيند وكسر بيليه بإضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج قبل بيبيتينج.
  8. إصلاح الخلايا بإضافة 2 مل إيثانول المثلج 70% دروبويسي للأنبوب بينما فورتيكسينج برفق.
  9. احتضان أنابيب لمدة 30 دقيقة على RT ووضع الأنابيب في 4 درجات مئوية عن ح 1.
  10. إزالة أنابيب من 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 751 x ز لمدة 5 دقائق.
  11. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج، ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي في 751 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  12. إضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 1 مع يوديد propidium (50 ميكروغرام/مل) وريبونوكليسي (200 ميكروغرام/مل)
  13. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت مع حماية العينات من الضوء.
  14. الحصول على البيانات المتعلقة بتدفق سيتوميتير. استخدم الأمام مقابل الجانب مبعثر (FSC مقابل SSC) لتحديد السكان الرئيسية للخلايا، باستثناء الحطام في الركن الأيسر السفلي من منتدى التعاون الأمني مقابل SSC كثافة الأرض وخلية المجموعات في الجزء العلوي لأعلى--الجانب الأيمن من الأرض كثافة منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب.
  15. تحليل البيانات لتحديد هوية السكان خلية كل مرحلة من مراحل دورة الخلية مع البرامج المناسبة.

6-المبرمج بالانزيم

  1. البذور 5 × 105 خلايا لكل عينة في قارورة2 سم T25 وأداء من تعداء وفقا للبروتوكول، المذكورة في القسم 1، الخطوات من 1 إلى 5.
  2. بعد 24 ساعة و 48 ساعة، حصاد الخلايا من تريبسينيزيشن.
  3. نقل تعليق خلية في أنابيب معقمة 15 مل وتسميتها بشكل صحيح.
  4. الطرد المركزي في 751 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
  5. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج، ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي في 751 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  6. كرر الخطوة الغسيل مع برنامج تلفزيوني x 1 إزالة الوسائط المتبقية.
  7. تمييع 10 × Annexin V ملزم العازلة ل x 1 مع المثلج dH2o.
  8. إضافة 1 مل 1 × ملزمة Annexin V المخزن المؤقت لكل أنبوبة العينة وريسوسبيند برفق.
  9. مكان 96 ميليلتر من تعليق خلية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  10. إضافة 1 ميليلتر من المتقارن فيتك V أننيكسين و 12.5 ميليلتر من يوديد propidium (PI) إلى الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية.
  11. احتضان تعليق خلية لمدة 10 دقائق على الجليد في الظلام.
  12. إضافة 250 ميليلتر المثلج 1 x Annexin V ملزم المخزن المؤقت لكل أنبوبة العينة تمييع.
  13. تحليل العينات مع تدفق cytometer فورا.

7-البروتين التعبير بالضد ميكرواري دورة الخلية

  1. البذور 5 × 105 خلايا لكل عينة في قوارير2 سم T25 وأداء من تعداء وفقا للبروتوكول، المذكورة في القسم 1، الخطوات من 1 إلى 5.
  2. وبعد 24 ساعة و 48 ساعة، حصاد الخلايا من تريبسينيزيشن.
  3. نقل تعليق خلية لأنابيب 15 مل وتسميتها وفقا لذلك.
  4. الطرد المركزي في 751 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
  5. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج، ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي في 751 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  6. كرر الخطوة الغسيل مع 1 x PBS.
  7. إضافة 150 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت تستكمل مع مثبطات البروتياز. بيبيت صعودا وهبوطاً برفق لعرقلة أغشية الخلية.
  8. لمنع أي تدخل المخزن المؤقت تحلل، تؤدي إلى تبادل المخزن مؤقت ليحل محل المخزن المؤقت تحلل مع المخزن المؤقت وضع العلامات، واستخدام المذيبات أعمدة تبادل الشركة المصنعة.
  9. تحديد كمية البروتين المجموع مع مقايسة اتفاق التعاون الأساسي.
  10. أخذ 70 ميكروغرام من البروتين عينة وإضافة المخزن المؤقت وضع العلامات لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 75 ميليلتر.
  11. إضافة 100 ميليلتر من dimethylformamide (DMF) 1 ملغ من البيوتين كاشف (البيوتين/DMF).
  12. إضافة 3 ميليلتر من البيوتين/DMF لكل عينة البروتين (بيوتينيلاتيد البروتين عينة) واحتضانها ح 2 في الرايت
  13. أضف 35 ميليلتر الكاشف توقف ومزيج من فورتيكسينج.
  14. احتضان عينات RT لمدة 30 دقيقة.
  15. إزالة الشرائح ميكرواري من الثلاجة بحيث أنهم الحارة إلى RT ح 1 قبل الاستخدام.
  16. تنفيذ حظر للربط غير محددة بواسطة تفرخ الشرائح مع الحل الحليب الجاف 3% (في كاشف الحظر التي توفرها الشركة المصنعة) في طبق بتري مع الرج المستمر لمدة 45 دقيقة في الرايت
  17. يغسل الشرائح مع الماء2س ddH (ما لم يذكر خلاف ذلك، الغسيل يأخذ مكان مع ddH2س).
  18. كرر الخطوة الغسيل ~ 10 x لإزالة الحل حظر من الأسطح الشريحة. هذا أمر مهم لتحقيق خلفية موحدة ومنخفضة.
  19. إزالة الماء الزائد من السطوح الشريحة والمضي قدما إلى الخطوة التالية دون السماح للشرائح الجافة.
  20. تحضير حل اقتران بإذابة الحليب الجاف 3% في كاشف اقتران.
  21. إضافة 6 مل الحل اقتران والكمية الكاملة من العينة البروتين بيوتينيلاتيد المعدة مسبقاً من الخطوة 7.12.
  22. مكان شريحة واحدة في بئر واحدة في دائرة اقتران المقدمة من المورد وإضافة ~ 6 مل بروتين اقتران ميكس إليها.
    ملاحظة: تأكد من أن الشريحة هو مغمورة تماما في اقتران الحل مزيج البروتين.
  23. تغطية قاعة اقتران واحتضانها ح 2 في الرايت مع التحريك المستمر في شاكر مداري.
  24. نقل الشرائح إلى طبق بتري وإضافة 30 مل 1 × الغسيل المخزن المؤقت. وضع طبق بتري في شاكر المداري ويهز لمدة 10 دقائق، وتجاهل الحل.
  25. كرر الخطوة 7.24 2 x.
  26. شطف الشرائح مع ddH2س المياه على نطاق واسع كما هو موضح في الخطوات 7.17 و 7.18 والمضي قدما إلى الخطوة التالية مباشرة لتجنب التجفيف.
  27. إضافة 30 ميليلتر من Cy3-ستريبتافيدين (0.5 ملغ/مل) في 30 مل من الكشف عن المخزن المؤقت.
  28. ضع الشريحة في طبق بتري وإضافة 30 مل من الكشف عن المخزن المؤقت الذي يحتوي على Cy3-ستريبتافيدين.
  29. احتضان في شاكر مدارية لمدة 20 دقيقة مع الرج المستمر محمية من الضوء.
    ملاحظة: قبرصي-3 صبغة فلورسنت. تغطي برقائق الألومنيوم أو تعمل في ظل ظروف مظلمة للحفاظ على كثافة الأسفار.
  30. نفذ الخطوات 7.24-7.26 والسماح للشريحة الجاف باستخدام دفق الهواء لطيف أو وضع الشريحة في أنبوب 50 مل المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 1300 س ز لمدة 5-10 دقائق.
  31. ضع الشريحة في حامل الشريحة وتغطي برقائق الألومنيوم.
  32. تفحص الشريحة في ماسح ميكرواري مع الأطوال الموجية الإثارة والانبعاثات المناسبة. وفي حالة Cy3، ذروة الطول الموجي الإثارة في ذروة ~ 550 نانومتر والانبعاثات في ~ 570 نانومتر.
  33. تحليل البيانات (انظر الجدول للمواد) للبرمجيات المستخدمة).

8. تسلسل الحمض النووي الريبي

  1. البذور 5 × 105 خلايا لكل عينة في قوارير2 سم T25 وأداء من تعداء وفقا للبروتوكول، المذكورة في القسم 1، الخطوات من 1 إلى 5.
  2. بعد 24 ساعة و 48 ساعة، حصاد الخلايا من تريبسينيزيشن.
  3. نقل تعليق خلية لأنابيب 15 مل وتسميتها وفقا لذلك.
  4. استخراج الحمض النووي الريبي وفقا للمادة 2، الخطوات من 1 إلى 6.
  5. التحقق من نوعية الجيش الملكي النيبالي، فضلا عن تركيز مع بيواناليزير. سلامة الحمض النووي الريبي نقاط (رين) أعلاه ثمانية والاقتضاء رسوم بيانية ضرورية للتأكد من نوعية الجيش الملكي النيبالي.
  6. من مجموع الجيش الملكي النيبالي، استخدم ~ 2 ميكروغرام من العينة للحمض النووي الريبي التسلسل (الرنا رسول من مجموع الحمض النووي الريبي)
  7. تسلسل باستخدام التسلسل الجيل المقبل من11.
  8. تشغيل نوعية التشذيب وخريطة مزودة جينوم مرجع من فستق الملفات التي تم إنشاؤها من الجيش الملكي النيبالي تسلسل الجهاز11.
  9. تحميل ملفات فستق وقراءة أولية البيانات العد لبنوك الجينات، اتباع الإرشادات < الموقع https://www.ncbi.nlm.nih.gov/>.
    ملاحظة: انظر رقم الانضمام SRP133420 للنتائج السابقة.

9-أنبوب تشكيل الإنزيم

  1. تقييم إمكانات الأوعية الوريد السري البشرية ميرنا transfected خلايا بطانية (هوفيكس) ح 36 تعداء بعد، كما هو موضح في القسم 1، الخطوات 1-5، باستخدام الخلايا هوفيك بدلاً من خلايا A549.
  2. تجويع هوفيكس مع M199 المجاعة وسائل الإعلام ح 4 في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  3. قم بإزالة عامل النمو انخفاض الغشاء مصفوفة من-80 درجة مئوية ومخزن في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها، مما يتيح ذوبان تدريجي لتجنب تشكيل فقاعة والبلمره.
  4. بعناية وبطء معطف الآبار 96 لوحة جيدا مع مل 0.04 انخفاض عامل نمو الغشاء مصفوفة، تجنب تكوين فقاعة. تنفيذ الإجراء برمته تحت غطاء الاندفاق الصفحي.
  5. سد الآبار المجاورة للوحة جيدا 96 مع 0.1 مل من برنامج تلفزيوني الحفاظ على الرطوبة، والحفاظ على درجة الحرارة.
  6. احتضان 96 لوحة جيدا في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل حتى يتحقق بلمرة لاستخراج غشاء الطابق السفلي. عدم احتضانها لأكثر من ح 1.
  7. تريبسينيزي هوفيكس ترانسفيكتيد من كل مجموعة وريسوسبيند في المتوسط M199 بتركيز 1 × 105 خلايا/مل.
  8. إضافة 0.1 مل من كل تعليق خلية إلى الآبار التي تحتوي على مصفوفة مبلمرة الغشاء في لوحة جيدا 96.
  9. احتضان 96 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 وبينما يجري التحضير لعوامل النمو. ويجري أيضا إعداد عوامل النمو تحت غطاء محرك السيارة الاندفاق الصفحي.
  10. إعادة تشكيل عوامل النمو (VEGF) في 2 × تركيز المطلوب النهائي (4 نانوغرام/مليلتر تركيز 2 نانوغرام/مليلتر تركيز النهائي)، وإضافة 0.1 مل من التي تحتوي على عامل النمو المتوسطة المجاعة M199 على رأس 0.1 مل من M199 المجاعة المتوسطة مع الخلايا. للتعامل مع فيجف غير الآبار، إضافة 0.1 مل من M199 المجاعة متوسطة على رأس 0.1 مل من M199 المجاعة المتوسطة مع الخلايا.
  11. احتضان 96 لوحة جيدا ح 6 في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  12. في نهاية فترة الحضانة، الحصول على صور لكل بئر مع 4 x التكبير، واستخدام مجهر برايتفيلد متصل بكاميرا رقمية.
  13. صور عملية مع البرمجيات مزودة بالمكونات في "محلل تولد الأوعية"19. استخدام المعلمات الثلاث، عدد العقد، وعدد من الوصلات، وتنبت مجموع طولها، لمقارنة آثار العلاج ميرنا على تولد الأوعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحليل التعبير الجيني استخدام التفريد RT-قبكر وجل

أظهر تحليل التعبير الجيني التفاضلي استخدام الرايت qPCR downregulation كبيرة من الجينات المستهدفة CDK1 و CDK4 CDK6. وعرضت CDK1 و CDK4/6 أن تكون أداة مفيدة G2/M وانتقالات G1/S، على التوالي. تحليل أداء يسمح ب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ميرناس يمكن أن تعمل كالعلاجات الموجهة لعلاج السرطان، وإذ تسلم بالتقلبات مستويات التعبير في المريضة مقابل أنسجة طبيعية. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد ميرناس التي يحتمل أن تكون وقف تقدم دورة الخلية خلال مراحل متعددة. وقد حددت أن مير-143 و 506 مير وقف دورة الخلية من الخلايا السرطانية، والبروتوكول?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب يود أن يعترف جون كاسكيي في جامعة ولاية لويزيانا لمساعدته على تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي، والمركز الطبي جنوب غرب جامعة تكساس، "مكديرموت مركز القادم جيل تسلسل الأساسية" للمسار القيام بتحليل البيانات وتسلسل الحمض النووي الريبي. كان يؤيد هذا البحث بكلية الصيدلة وجامعة لويزيانا مونرو بدء التمويل والوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) من خلال المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم منح 5 P20 GM103424--15، 3 P20 GM103424-15S1.

Acknowledgements

يتم تعريف لا تضارب في المصالح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
-80 °C FreezerVWRVWR40086A
96 well plateCELLTREAT Scientific 50-607-511
96-well Microwell Plates  Thermo Scientific12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer CellsATCCATCC CCL-185
AgaroseVWR0710-25G
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNAAmbionAM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 ReactionsFull Moon BioKAS02
Bright field microscope  Microscoptics IV-900
Bright field microscope  New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 SlidesFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceSteps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time SystemBioRadCFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging SystemBioRadChemidoc Touch Imaging System
CO2 IncubatorThermo ScientificHERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixTrevigen3433-010-01
Digital CameraAmScope FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-GlutamineVWRVWRL0100-0500
DNAse IZymo ResearchE1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)BD Biosciences356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack SetsEppendrof05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagentsBP2818500
Ethidium bromideAlfa acarL07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, CorningCorning45000-354
FACS Calibur FlowcytometerBecton Dickinson
Fetal Bovine Serum - PremiumAntlanta BiologicalsS11150
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher Scientific10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap CapsFisherbrand Basix02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubatorThermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis systemBenchtop lab systemBT102
hsa-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)Thermo ScientificPHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)Individual donorsIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenResults: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10-977-015
Lipofectamine 2000 Invitrogen11-668-027
Loading dye 10Xward's science+470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)Sigma AldrichM4530
Microscope Digital CameraAmScope MU130
Modfit LTVerity SoftwareStep 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Power UP sybr green master mixApplied BiosystemsA25780
Propidium IodideMP Biochemicals LLCIC19545825
Proscanarray HT Microarray scannerPerkin elmerASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive coverApplied Biosystems4360954
Quick-RNA KitsZymo ResearchR1055
Ribonuclease A from Bovine pancreasSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerStep 7.33: Microarray analysis software
ShakerThermo Scientific2314
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15mlVWR470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50mlVWR470225-004
TBS Buffer, 20x liquidVWR10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchineThermo ScientificST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchineEppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated FlasksThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted PlatesThermo ScientificAB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)Thermo ScientificAB1453B
Ultra Low Range DNA LadderInvitrogen10597012
VWR standard solid door laboratory refrigeratorVWR

References

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090(2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769(2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495(2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543(2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078(2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved