Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi

Riepilogo

terapeutica di miRNA hanno un potenziale significativo nella regolazione della progressione del cancro. Ha dimostrato qui approcci analitici utilizzati per l'identificazione dell'attività di un trattamento di combinatoria miRNA nell'arrestare il ciclo cellulare e l'angiogenesi.

Abstract

Il cancro del polmone (LC) è la causa principale delle morti legate al cancro in tutto il mondo. Simile ad altre cellule di cancro, una caratteristica fondamentale delle cellule LC è proliferazione non regolamentata e la divisione cellulare. Inibizione della proliferazione di arrestare la progressione del ciclo cellulare ha dimostrato di essere un promettente approccio per il trattamento del cancro, tra cui LC.

terapeutica di miRNA sono emerse come regolatori di genico post-trascrizionale importante e sempre più stanno studiandi per uso nel trattamento del cancro. In recenti lavori, abbiamo utilizzato due Mirna, miR-143 e miR-506, per regolare la progressione del ciclo cellulare. Transfected le cellule A549 non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC), modificazioni dell'espressione genica sono stati analizzati e attività apoptotica dovuta al trattamento infine è stato analizzato. Downregulation di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) sono stati rilevati (cioè, CDK1, CDK4 e CDK6), e ciclo cellulare fermato presso le transizioni di fase di G1/S e G2/M. Analisi del percorso indicano potenziali attività antiangiogenica del trattamento, che conferisce l'approccio multiforme attività. Qui, le metodologie utilizzate per identificare l'attività di miRNA per quanto riguarda l'inibizione del ciclo cellulare, induzione di apoptosi e gli effetti del trattamento sulle cellule endoteliali tramite inibizione dell'angiogenesi sono descritti. Si spera che i metodi presentati qui sosterrà la ricerca futura su miRNA terapeutica e attività corrispondente e che i dati rappresentativi guiderà altri ricercatori durante analisi sperimentali.

Introduzione

Il ciclo cellulare è una combinazione di più eventi normativi che consentono la duplicazione del DNA e la proliferazione cellulare attraverso il processo mitotico¹. Chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) regolare e promuovere il ciclo cellulare². Tra questi, il CDK mitotica (CDK1) e interfase CDKs (CDK2, CDK4 e CDK6) hanno un ruolo fondamentale nel ciclo cellulare progressione³. Proteina del retinoblastoma (Rb) è fosforilata da CDK4/CDK6 complessi per consentire il ciclo cellulare progressione⁴, e l'attivazione CDK1 è essenziale per la divisione cellulare successo⁵. Numerosi inibitori delle CDK sono stati sviluppati e valutati in studi clinici negli ultimi decenni, che indica il potenziale di targeting CDKs nel trattamento del cancro. Infatti, tre inibitori delle CDK sono stati approvati per il trattamento di cancro al seno recentemente^6,7,8,9,10. Così, CDKs, e in particolare, CDK1 e CDK4/6, sono di grande interesse nella regolazione della progressione del cancro delle cellule.

Mirna (miRs) sono piccole, non-codificazione RNAs e regolatori post-trascrizionale dell'espressione genica, circa il 30% di tutti i geni umani¹¹di regolazione. Loro attività è basata sulla repressione traduzionale o degradazione del RNA messaggero (mRNA)¹². Indicativo del loro significato biologico, sono stati identificati più di 5.000 Mirna e una molecola di miRNA singolo può regolare più geni^11,13. Ancora più importante, espressione dei miRNA è stata associata con diverse malattie e Stati di malattia, compreso cancro¹³. Infatti, i miRNA sono stati caratterizzati come oncogeni o soppressori tumorali, essendo in grado di promuovere o sopprimere tumore sviluppo e progressione di^14,15. L'espressione relativa di Mirna in tessuti malati può regolare la progressione di malattia; così, consegna esogeno di Mirna ha potenziale terapeutico.

Cancro del polmone è la principale causa di decessi per cancro e più grande di 60% di tutti i tumori maligni del polmone non a piccole cellule^16,i cancri del polmone¹⁷, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 20%¹⁸. L'uso di miR-143-3 p e miR-506-3 p recentemente è stata valutata per il targeting i cicli delle cellule nel polmone cancro cellule¹¹. miR-143 e miR-506 hanno sequenze di complementarità CDK1 e CDK4/CDK6, e sono stati analizzati gli effetti di questi due miRs sulle cellule A549. I dati sperimentali sono presentati e discussi in questa carta. Espressione genica, progressione del ciclo cellulare e apoptosi sono stati valutati usando diversi disegni sperimentali e punti temporali dopo trasfezione. Abbiamo usato metodi quantitativi in tempo reale di PCR (RT-qPCR) insieme con l'analisi di microarray per misurare l'espressione di specifici geni, e sequenziamento di RNA di nuova generazione è stato usato per determinare di disregolazione genica globale¹¹. Quest'ultimo metodo identifica l'abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene con alta sensibilità e riproducibilità, mentre migliaia di geni possa essere analizzati da una singola analisi sperimentale. Inoltre, analisi apoptotiche dovuto il trattamento di miRNA è stata eseguita e viene descritto qui. Bioinformatica ha completato l'analisi dei percorsi. Presentato qui sono protocolli utilizzati per l'analisi di terapeutico potenziale della combinatoria miR-143 e miR-506.

Lo scopo principale di questo protocollo è quello di identificare gli effetti dei miRNA nelle cellule, con un focus sul ciclo cellulare. La varietà delle tecniche qui presentate spaziano dalla analisi di espressione genica romanzo e pretraduzione (utilizzando qPCR) di elaborare tecniche per l'analisi del gene a livello proteico, come ad esempio l'analisi di microarray. Si spera che questo rapporto è utile per i ricercatori interessati a lavorare con Mirna. Inoltre, la metodologia per l'analisi cytometric di flusso del ciclo cellulare e apoptosi delle cellule è presentato.

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Protocollo

1. miR-143 e miR-506 transfezione

Attenzione: Utilizzare un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in lattice durante l'esecuzione di esperimenti descritti. Quando richiesto, è possibile utilizzare l'armadio di sicurezza biologica con il ventilatore su, senza bloccare le vie respiratorie o disturbare il flusso d'aria laminare. Impostare sempre la finestra di vetro proteggente all'altezza appropriata, come descritto dal produttore.

1. Le cellule A549 NSCLC seme in una piastra T25 cm² pallone/6/96 ben in DMEM/F12K media completati con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina (terreni di coltura) in una cappa di coltura del tessuto e incubare per una notte a 37 ° C con 5% CO₂ in un incubatore di coltura del tessuto.
2. Sospendere imita miR-143 e/o miR-506 o rimescolare siRNA con agente di transfezione (2,4 µ g di miR sono stati mescolati con 14 µ l di agente trasfettando; Vedi Tabella materiali) in 500 µ l di transfezione media e 1,5 mL di siero e senza antibiotico DMEM/F12K media presso un concentrazione di miRNA finale di 100 nM. quantità di miRNA possono richiedere ottimizzazione su cellule diverse e concentrazioni. Approcci appropriati includono la transfezione delle cellule con l'aumento delle concentrazioni di miRNA (vale a dire, 50-200 nM) e valutazione di espressione downregulation dei geni di interesse.
3. Rimuovere i mezzi di coltura dalla boccetta/piastra e lavare una volta con PBS 1X.
4. MiRNA/scramble-trasfezione complessi agente ed incubare a 37 ° C con 5% CO₂ per 6 h (dimensioni della muffola definisce il volume aggiunto incubazione).
5. Sostituire il supporto con 4 mL di terreno di coltura e incubare le cellule per 24 h e/o 48 h.
6. Vendemmia transfected le cellule a trypsinization, aggiungendo 1 mL di tripsina-EDTA in ciascuna beuta,² cm T25, incubare per 5-10 min a 37 ° C e aggiungere 3 mL di terreno di coltura per raccogliere le cellule. Inserire il contenuto di ciascuna beuta in un tubo separato, contrassegnato da 15 mL. Lavorare in una cappa di coltura del tessuto.
7. Centrifugare a 751 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.
   Nota: Attenzione è richiesta durante la rimozione del surnatante, come agitazione del tubo può causare la perdita delle cellule.
8. Aggiungere 2 mL di 1X PBS e centrifugare per 5 min a 751 x g.
9. Ripetere i passaggi 7 e 8 una volta per rimuovere eventuali tracce di media e surnatante.
   Nota: In questa fase, provette dei campioni possono essere conservati a-80 ° C o possono essere utilizzati immediatamente.

2. estrazione del RNA

1. Pulire l'area di lavoro spruzzando con alcool isopropilico al 70% e soluzione di decontaminazione di RNAsi.
2. Estrazione del RNA deve essere eseguita utilizzando un appropriato RNA kit (Vedi Tabella materiali).
3. Rimuovere i tubi da-80 ° C e lasciarli scongelare. Aggiungere 300 µ l di tampone di lisi e pipetta su e giù per rompere la membrana cellulare.
4. Aggiungere un volume equivalente di etanolo ultra-puro al 100%.
5. Mescolare bene e mettere in colonna di separazione.
6. Centrifugare tra 11 e 16 x g per 30 s e Rimuovi il flusso continuo.
7. Aggiungere 400 µ l di tampone e centrifugare per rimuovere il tampone di lavaggio.
8. Aggiungere 5 µ l di dnasi I con 75 µ l di digestione del DNA nel buffer in ogni campione e incubare per 15 min.
9. Lavare il campione con 400 µ l di tampone di preparazione di RNA.
10. Lavare 2 volte con tampone di lavaggio di RNA.
11. Aggiungere acqua priva di nucleasi alla colonna, centrifuga, quindi raccogliere il RNA.
12. Misurare la concentrazione di RNA totale con uno spettrofotometro UV.

3. RT-qPCR

1. Prima del RT-qPCR, sintetizzare il cDNA. A seguito di quantificazione di concentrazione di RNA, posto 1 µ g di RNA in un volume finale di 20 µ l di reazione per preparare cDNA in un tubo PCR. Lavorare sempre su un banco pulito.
2. Tutti gli altri ingredienti necessari sono inclusi in tabella 1.

Ingredienti	Quantità (µ l) / (20 µ l) di campione
5 X cDNA Master mix	4
dNTP	2
Esameri casuali	1
Rinforzatore di RT	1
Mix di enzima verso	1
Acqua gratuita DNasi e RNasi	Qty richiesto dopo l'aggiunta di RNA per rendere 20 µ l

Tabella 1: Materiali per la sintesi di cDNA da campioni di RNA. Necessaria quantità di rispettivi ingredienti per preparare un mix master per un esemplare per la sintesi del cDNA.

3. Incubare in un termociclatore con le seguenti condizioni di temperatura: 42 ° C per 30 min; 95 ° C per 2 min; 4 ° C fino al prelievo di campioni.
4. Utilizzare immediatamente in normale PCR o qPCR, o conservare cDNA a-20 ° C.
5. Preparare soluzioni primer forward e reverse con privo di DNasi e RNasi acqua ad una concentrazione di 10 µM dalla soluzione stock primer.
6. Preparare il mix master separati per ogni gene essere rilevato, in base al numero di campioni. Per ogni campione di cDNA (qPCR bene), la quantità di reazione è preparata secondo la tabella 2.

Ingredienti	Quantità (µ l) / (20 µ l) di campione
Mix master SYBR	10
Forward Primer - 10 μM	2
Reverse Primer - 10 μM	2
Acqua gratuita DNasi e RNasi	3
campione di cDNA	3

Tabella 2: materiali per PCR quantitativa in tempo reale dai campioni di cDNA. Necessaria quantità di ingredienti per preparare un mix master per un esemplare per qPCR.

7. Ogni campione viene posto nei rispettivi pozzetti.
8. Progettare il layout di esempio per la piastra di qPCR ben 96. Per ogni campione e gene analizzato, eseguire la reazione in triplici copie, o almeno in duplicati.
9. Sigillare la piastra ben 96 con un coperchio adesivo otticamente trasparente.
10. Rapido-spin la piastra per consentire la miscela di reazione raggiungere il fondo dei pozzetti.
11. Eseguire RT-qPCR secondo il seguente gradiente termico:
    1) 50 ° C per 2 min
    2) 95 ° C per 2 min
    3) 95 ° C per 15 s
    4) prendere la lettura
    5) 60 ° C per 1,5 minuti
    6) Ripetere il passaggio 3 per 39 volte
12. Eseguire il seguente gradiente termico in continuazione di cui sopra per determinare la curva di fusione che indica amplificazione del singolo prodotto.
    7) 65 ° C per min 0,31
    0,5 ° C/ciclo
    9) piatto Leggi
    10) Ripetere il passaggio 8 per 60 volte fino a 95 ° C
    11) 72 ° C per 2 min

4. elettroforesi su gel di agarosio per confermare l'amplificazione del gene singolo

1. Preparare il gel di agarosio 1% in 1 tampone di x TBE.
2. Aggiungere etidio bromuro (EtBr) nel gel caldo (~ 50 ° C) fino ad ottenere una concentrazione finale di circa 0.2-0.5 µ g/mL. EtBR lega con DNA e consente di essere visualizzato sotto la luce in un imager di gel UV.
3. Versare il gel caldo in un cassetto del gel fornito con un contenitore di elettroforesi del gel. Attaccare il pettine fornito strettamente per pozzi uniforme.
4. Consentire il gel al resto e raffreddare a temperatura ambiente (TA) per ~ 30 min.
5. Quando il gel è solidificato, collocare il gel e il vassoio nella finestra di gel.
6. Riempire la vaschetta del gel con 1 x TBE buffer fino a quando il gel è completamente coperto.
7. Misurare la concentrazione del DNA dal processo di amplificazione di PCR utilizzando uno spettrometro UV.
8. Prendere ~ 15 ng di DNA in un piccolo tubo PCR, aggiungere 5 µ l di colorante e aggiungere la quantità necessaria di acqua priva di nucleasi a raggiungere un volume totale di 15 µ l.
9. Caricare il DNA ladder e campioni nei pozzetti.
10. Esegua il gel a 100 V fino a quando la linea di tintura è circa il 75-80% giù il gel.
    Nota: Assicurarsi che il gel viene eseguito da un negativo a carica positiva.
11. Rimuovere il gel e inserirlo nel gel imager per visualizzare il DNA.

5. analisi del ciclo cellulare da

1. Cellule⁵ seme 5 x 10 per ciascun campione in un matraccio da² cm di T25 ed eseguire una transfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, punti 1-5.
2. Dopo 24 h e h 48, quindi raccogliere le cellule di trypsinization.
3. Trasferire le sospensioni cellulari per provette sterili da 15 mL ed etichettarle correttamente.
4. Centrifugare i campioni a 751 x g per 5 min e scartare il surnatante.
5. Aggiungere 2 mL di PBS 1X ghiacciata, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 min, scartare il surnatante.
6. Ripetere la fase di lavaggio con 1x PBS per rimuovere media residua.
7. Risospendere e rompere il pellet con l'aggiunta di 200 µ l di PBS 1X ghiacciata di pipettaggio.
8. Fissare le cellule con l'aggiunta di 2 mL di etanolo al 70% ghiacciata goccia a goccia per il tubo mentre nel Vortex delicatamente.
9. Incubare le provette per 30 min a RT e posizionare i tubi a 4 ° C per 1 h.
10. Rimuovere tubi da 4 ° C e centrifugare a 751 x g per 5 min.
11. Aggiungere 2 mL di PBS 1X ghiacciata, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 min, scartare il surnatante.
12. Aggiungere 500 µ l di 1X PBS con ioduro di propidio (50 µ g/mL) e ribonucleasi A (200 µ g/mL)
13. Incubare per 30 min a RT, proteggendo i campioni dalla luce.
14. Acquisire dati sul citometro a flusso. Utilizzare avanti vs dispersione laterale (FSC e SSC) per selezionare la principale popolazione di cellule, ad eccezione di detriti nell'angolo sinistro inferiore dei cluster FSC vs SSC densità trama e cella nella parte superiore verso l'alto-lato destro della trama di densità del FSC e SSC.
15. Analizzare i dati per l'identificazione di popolazioni cellulari per ogni fase del ciclo cellulare con il software appropriato.

6. apoptosi dosaggio

1. Cellule⁵ seme 5 x 10 per ciascun campione in un matraccio da² cm di T25 ed eseguire una transfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, punti 1-5.
2. Dopo 24 h e 48 h, è possibile raccogliere le cellule dal trypsinization.
3. Trasferire le sospensioni cellulari per provette sterili da 15 mL ed etichettarle correttamente.
4. Centrifugare a 751 x g per 5 min e scartare il surnatante.
5. Aggiungere 2 mL di PBS 1X ghiacciata, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 min, scartare il surnatante.
6. Ripetere la fase di lavaggio con 1x PBS per rimuovere media residua.
7. Diluire 10 x buffer obbligatorio Annexin V a 1x con gelida dH₂O.
8. Aggiungere 1 mL di tampone di Annexin V che lega 1x per ogni provetta e Risospendere delicatamente.
9. Sospensione di cellule posto 96 µ l in una microcentrifuga da 1,5 mL.
10. Aggiungere 1 µ l di coniugato di Annexin V-FITC e 12,5 µ l di ioduro di propidio (PI) nella provetta contenente la sospensione cellulare.
11. Incubare la sospensione cellulare per 10 min sul ghiaccio al buio.
12. Aggiungere 250 µ l 1 ghiacciata x buffer obbligatorio di Annexin V per ogni provetta per diluire.
13. Analizzare immediatamente i campioni con citometro a flusso.

7. espressione di proteina di microarray dell'anticorpo ciclo cellulare

1. Seme 5 x 10⁵ celle per ogni campione preparato in boccette di T25 cm² e realizzare una transfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, punti 1-5.
2. Dopo 24 h e 48 h, è possibile raccogliere le cellule di trypsinization.
3. Trasferimento di sospensioni cellulari per provette da 15 mL e con l'etichetta di conseguenza.
4. Centrifugare a 751 x g per 5 min e scartare il surnatante.
5. Aggiungere 2 mL di PBS 1X ghiacciata, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 min, scartare il surnatante.
6. Ripetere la fase di lavaggio con 1x PBS.
7. Aggiungere 150 µ l di tampone di lisi completati con inibitori della proteasi. Dispensare su e giù delicatamente di distruggere le membrane cellulari.
8. Per evitare qualsiasi interferenza di tampone di Lisi, eseguire uno scambio di buffer per sostituire il tampone di lisi con etichettatura buffer, utilizzando colonne di scambio solvente del produttore.
9. Quantificare la proteina totale con un saggio BCA.
10. Prendere 70 µ g di campione della proteina e aggiungere per ottenere un volume finale di 75 µ l di tampone d'etichettatura.
11. Aggiungere 100 µ l di dimetilformammide (DMF) a 1 mg di reagente di biotina (biotina/DMF).
12. 3 µ l di biotina/DMF in ciascun campione di proteina (biotinylated campione della proteina) ed incubare per 2 h a TA.
13. Aggiungere 35 µ l di reagente di stop e mescolare nel Vortex.
14. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 min.
15. Rimuovere le diapositive di microarray dal frigorifero in modo che riscaldano a RT per 1 h prima dell'uso.
16. Eseguire il blocco per legame non specifico incubando le diapositive con soluzione di latte in polvere 3% (nel Reagente Bloccante fornito dal produttore) in una capsula di Petri con agitazione continua per 45 minuti a TA.
17. Lavare i vetrini con ddH₂O acqua (se non diversamente specificato, il lavaggio si svolge con ddH₂O).
18. Ripetere la fase di lavaggio ~ 10 x per rimuovere completamente la soluzione bloccante dalle superfici di scorrimento. Questo è importante per ottenere uno sfondo uniforme e basso.
19. Rimuovere l'acqua eccessiva dalle superfici di scorrimento e procedere al passaggio successivo senza lasciare che le diapositive a secco.
20. Preparare la soluzione di accoppiamento sciogliendo il latte secco 3% in un reagente di accoppiamento.
21. Aggiungere 6 mL della soluzione di accoppiamento e l'intero quantitativo del campione proteine biotinilate precedentemente preparato dal passaggio 7.12.
22. Posto una diapositiva in un pozzetto della camera del giunto del fornitore e aggiungere ~ 6 mL di proteina mix di accoppiamento ad esso.
    Nota: Assicurarsi che la diapositiva è completamente immersa nella proteina mix soluzione di accoppiamento.
23. Coprire la camera di accoppiamento e incubare per 2 h a temperatura ambiente con agitazione continua in un agitatore orbitale.
24. Trasferire i vetrini in una capsula di Petri e aggiungere 30 mL di 1x tampone di lavaggio. Posizionare la piastra di Petri nell'agitatore orbitale, agitare per 10 min e scartare la soluzione.
25. Ripetere il passaggio 7,24 2 x.
26. Sciacquare i vetrini con acqua₂O ddH estesamente come descritto nei passaggi 7,17 e 7,18 e procedere al passaggio successivo immediatamente per evitare la disidratazione.
27. Aggiungere 30 µ l di Cy3-streptavidina (0,5 mg/mL) in 30 mL di tampone di rilevamento.
28. Collocare il vetrino in una capsula di Petri e aggiungere 30 mL di tampone di rilevamento contenente Cy3-streptavidina.
29. Incubare in un agitatore orbitale per 20 min con continua agitazione protetto dalla luce.
    Nota: Cy-3 è una tintura fluorescente. Coprire con carta stagnola, oppure operare in condizioni di oscurità per mantenere l'intensità di fluorescenza.
30. Eseguire i passaggi 7,24-7,26 e lasciar asciugare con un leggero getto d'aria o mettendo la diapositiva in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 1.300 x g per 5-10 min.
31. Porre il vetrino in portavetrini e coprire con carta stagnola.
32. Eseguire la scansione della diapositiva in uno scanner per microarray con le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione appropriate. Nel caso di Cy3, il picco di lunghezza d'onda di eccitazione è al ~ 550 nm ed emissione di picco a ~ 570 nm.
33. Analizzare i dati (Vedi Tabella materiali) per il software utilizzato).

8. RNA 16s

1. Seme 5 x 10⁵ celle per ogni campione preparato in boccette di T25 cm² e realizzare una transfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, punti 1-5.
2. Dopo 24 h e 48 h, è possibile raccogliere le cellule dal trypsinization.
3. Trasferire le sospensioni cellulari per provette da 15 mL e con l'etichetta di conseguenza.
4. Estrarre RNA ai sensi dell'articolo 2, punti 1-6.
5. Verifica qualità di RNA come pure la concentrazione con un bioanalyzer. Un'integrità di RNA Punteggio ottenuto (RIN) di sopra di otto e caso istogrammi sono necessari per confermare la qualità di RNA.
6. Da RNA totale, utilizzare ~ 2 µ g del campione di RNA (RNA messaggero da RNA totale) di sequenziamento
7. Sequenza utilizzando un sequenziatore di nuova generazione¹¹.
8. Eseguire il taglio di qualità e mappa con un genoma di riferimento dal file FASTQ generati dal RNA sequenziamento macchina¹¹.
9. Caricare file FASTQ e read raw i dati di conteggio in Genebank, seguendo le istruzioni dei < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> sito Web.
   Nota: Vedere il numero di accessione SRP133420 per risultati precedenti.

9. analisi di formazione tubo

1. Valutare il potenziale angiogenico della post-transfezione di vena ombelicale umana miRNA-transfected le cellule endoteliali (HUVECs) 36 h, come descritto nella sezione 1, punti 1-5, utilizzando cellule HUVEC invece cellule A549.
2. Morire di fame HUVECs con M199 media di inedia per 4 h a 37 ° C con 5% CO₂.
3. Rimuovere il ridotto fattore di crescita di matrice della membrana basale da-80 ° C e conservare a 4 ° C durante la notte, che permette lo scongelamento graduale evitare la polimerizzazione e la formazione di bolle.
4. Lentamente e con cautela cappotto pozzetti di una piastra ben 96 con 0,04 mL di matrice della membrana basale di fattore di crescita ridotta, evitando la formazione di bolle. Eseguire l'intera procedura sotto cappa a flusso laminare.
5. Riempire adiacenti pozzetti della piastra ben 96 con 0,1 mL di PBS per mantenere umidità e mantengono la temperatura.
6. Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C per almeno 20 min affinché polimerizzazione dell'estratto della membrana dello scantinato è raggiunto. Non Incubare per più di 1 h.
7. Tripsinizzano trasfettate HUVECs da ciascun gruppo e risospendere in medium M199 ad una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule/mL.
8. Aggiungere 0,1 mL di sospensione ogni cella dei pozzetti contenenti matrici polimerizzata della membrana dello scantinato della piastra ben 96.
9. Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C con 5% CO₂ mentre avviene la preparazione dei fattori di crescita. Preparazione dei fattori di crescita avviene anche sotto la cappa a flusso laminare.
10. Ricostituire i fattori di crescita (VEGF) in 2 x la concentrazione finale desiderata (concentrazione di 4 ng/mL per la concentrazione finale di 2 ng/mL) e aggiungere 0,1 mL di fattore di crescita-contenente di M199 inedia terreno in cima il 0,1 mL di mezzo di inedia M199 con le cellule. Per fonti di non-VEGF-trattati, aggiungere 0,1 mL di mezzo di inedia M199 in cima il 0,1 mL di mezzo di inedia M199 con le cellule.
11. Incubare la piastra ben 96 per 6 h a 37 ° C con 5% CO₂.
12. Alla fine del periodo d'incubazione, ottenere immagini di ciascun pozzetto con ingrandimento 4x, usando un microscopio a campo chiaro collegato con una fotocamera digitale.
13. Elaborazione delle immagini con software è dotato di un plug-in "analizzatore di angiogenesi"¹⁹. Utilizzare tre parametri, il numero di nodi, numero di giunzioni e lunghezza totale germoglio, per confrontare gli effetti del trattamento di miRNA sull'angiogenesi.

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Risultati

Analisi dell'espressione genica tramite RT-qPCR ed elettroforesi su gel

Analisi di espressione genica differenziale usando RT-qPCR dimostrato significativi downregulation dei geni mirati CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 sono stati indicati per essere strumentale per il G2/M e transizioni G1/S, rispettivamente. Le analisi eseguite ha permesso il confronto diretto tra miRs individuale e attività di miR combinator...

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Discussione

Mirna possono operare come terapie mirate per il trattamento del cancro, riconoscendo l'alterazione dei livelli di espressione in malati vs tessuti normali. Questo studio mira a determinare i miRNA che potenzialmente fermare la progressione del ciclo cellulare durante le fasi multiple. È stato identificato che miR-143 e miR-506 arrestare il ciclo cellulare delle cellule tumorali e i protocolli presentati volti a comprendere l'attività di questo trattamento di miRNA combinatoria.

Le metodolog...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer	VWR	VWR40086A
96 well plate	CELLTREAT Scientific	50-607-511
96-well Microwell Plates	Thermo Scientific	12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells	ATCC	ATCC CCL-185
Agarose	VWR	0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA	Ambion	AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions	Full Moon Bio	KAS02
Bright field microscope	Microscoptics	IV-900
Bright field microscope	New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides	Full Moon Bio	ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate	Labconco	342391100
Cellquest Pro	BD bioscience	Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis
CFX96 Real Time System	BioRad	CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System	BioRad	Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Trevigen	3433-010-01
Digital Camera	AmScope	FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine	VWR	VWRL0100-0500
DNAse I	Zymo Research	E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)	BD Biosciences	356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets	Eppendrof	05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,	Fisher BioReagents	BP2818500
Ethidium bromide	Alfa acar	L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning	Corning	45000-354
FACS Calibur Flowcytometer	Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps	Fisherbrand Basix	02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator	Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)	Hospira	NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system	Benchtop lab system	BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic	ABM	MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic	ABM	MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)	Thermo Scientific	PHC9394
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Individual donors	IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen	Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10-977-015
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11-668-027
Loading dye 10X	ward's science+	470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)	Sigma Aldrich	M4530
Microscope Digital Camera	AmScope	MU130
Modfit LT	Verity Software	Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop	Thermo Scientific	NanoDrop one C
Opti-MEM	Gibco by life technologies	31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
Power UP sybr green master mix	Applied Biosystems	A25780
Propidium Iodide	MP Biochemicals LLC	IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner	Perkin elmer	ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover	Applied Biosystems	4360954
Quick-RNA Kits	Zymo Research	R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas	Sigma	R6513-50MG
ScanArray Express	PerkinElmer	Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker	Thermo Scientific	2314
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml	VWR	470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml	VWR	470225-004
TBS Buffer, 20x liquid	VWR	10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine	Thermo Scientific	ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine	Eppendrof	5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks	Thermo Scientific	12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Thermo Scientific	PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Thermo Scientific	PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates	Thermo Scientific	AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)	Thermo Scientific	AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder	Invitrogen	10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator	VWR