JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Erratum Notice
  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Erratum
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

miRNA tedavi kanser ilerleme düzenlenmesinde önemli potansiyele sahip. Aşağıda gösterildiği analitik yaklaşımlar hücre döngüsü ve anjiogenezi durdurma içinde bir birleşimsel miRNA tedavi faaliyetinin tanımlaması için kullanılır.

Özet

Akciğer kanseri (LC) kanser bağlı ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir. Diğer kanser hücrelerinin, LC hücreleri temel karakteristik düzensiz yayılması ve hücre bölünmesi benzer. Hücre döngüsü ilerleme durdurma tarafından yayılması inhibisyonu LC dahil olmak üzere kanser tedavisi için umut verici bir yaklaşım gibi gösterilmiştir.

miRNA therapeutics önemli çoğu gen düzenleyiciler ortaya çıkan ve giderek kanser tedavisinde kullanılmak incelendiği. Son çalışmada, iki miRNAs, miR-143 ve miR-506, hücre döngüsü ilerleme düzenlemek için kullanılan. A549 küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hücreleri transfected, gen ifade değişikliklerini analiz edildi ve apoptotik etkinliği nedeniyle tedavi sonunda analiz edildi. Siklin bağımlı kinazlar (CDKs) downregülasyon algılandı (yani, CDK1, CDK4 ve CDK6), ve hücre döngüsü G1/S ve G2/M faz geçişleri durdurdu. Yolu analiz yaklaşım çok yönlü aktivitesiyle endows tedavinin potansiyel anjiogenik faaliyet göstermiştir. Burada açıklanan angiogenez inhibisyonu tarafından miRNA aktiviteyle ilgili hücre döngüsü inhibisyon, Apoptozis indüksiyon ve endotel hücreleri tedavisinin etkileri tanımlamak için kullanılan yöntemleri vardır. Burada sunulan yöntemleri gelecekteki araştırma miRNA therapeutics ve karşılık gelen etkinliğini destekleyecek ve temsilcisi veri deneysel analizleri sırasında diğer araştırmacılar rehberlik edecek umulmaktadır.

Giriş

Hücre döngüsü DNA ve Hücre proliferasyonu ile Mitotik süreci1tekrarını izin birden çok düzenleyici olayların bir kombinasyonudur. Siklin bağımlı kinazlar (CDKs) düzenleyen ve hücre döngüsü2teşvik. Bunlar arasında Mitotik CDK (CDK1) ve Interphase CDKs (CDK2, CDK4 ve CDK6) hücre döngüsü ilerleme3' te bir rol var. Retinoblastom protein (Rb) CDK4/hücre döngüsü ilerleme4izin vermek için CDK6 tarafından karmaşık fosforile ve CDK1 etkinleştirme başarılı hücre bölünmesi5için esastır. Çok sayıda CDK inhibitörleri geliştirilen ve CDKs kanser tedavisinde hedefleme potansiyeli gösteren son birkaç on yıl içinde klinik deneylere değerlendirildi. Aslında, üç CDK inhibitörleri meme kanseri tedavisi için onaylanmış olan son zamanlarda6,7,8,9,10. Böylece, CDKs, ve özellikle, CDK1 ve CDK4/6, kanser hücre ilerleme düzenlenmesinde büyük ilgi.

miRNAs (miRs) küçük, kodlamayan RNA'ların ve tüm insan genlerinin11yaklaşık % 30'u düzenleyen gen ifadesinin çoğu düzenleyiciler vardır. Faaliyetlerini translasyonel baskı ya da haberci RNA (mRNA)12bozulma dayanır. Onların biyolojik önemi açıklayıcı, 5.000'den fazla miRNAs tespit edilmiştir ve bir tek miRNA molekül birden çok gen11,13düzenleyen. Daha da önemlisi, miRNA ifade hastalık durumları, kanser13de dahil olmak üzere ve farklı hastalıklar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Aslında, miRNAs kadar oncogenic ile karakterize veya tümör bastırıcılarının, teşvik veya tümör gelişme ve ilerleme14,15bastırmak için yetenekli olmak. MiRNAs hastalıklı dokuları içinde göreli ifade hastalık ilerleme düzenleyen; Böylece, miRNAs eksojen teslimini terapötik bir potansiyele sahiptir.

Akciğer kanseri olduğu önde gelen neden kanser ile ilgili ölümlerin ve daha büyük daha tüm akciğer maligniteler % 60'ı küçük hücre akciğer kanserleri16,17, 5 yıllık sağkalım oranı az % 20 ile18. MiR-143-3 p ve miR-506-3 p kullanımı son zamanlarda akciğer kanseri hücreleri11hücre döngülerle hedefleme için değerlendirilmiştir. miR-143 ve miR-506 tamamlayıcılık CDK1 ve CDK4/CDK6 dizileri ve A549 hücreleri bu iki miRs etkilerini analiz edildi. Deneysel detayları sundu ve bu yazıda ele. Gen ifadesinin, hücre döngüsü ilerleme ve Apoptozis farklı deneysel tasarım ve transfection takip timepoints kullanarak değerlendirildi. Biz gerçek zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR) yöntemleri ile birlikte Mikroarray analiz belirli bir gen ifade ölçmek için kullanılan ve yeni nesil RNA sıralama küresel gen bozukluk11belirlemek için kullanılmıştır. Genler binlerce tek bir deneysel analizi analiz edilebilir iken ikinci yöntemi ile yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik, her genin transkript göreli bolluk tanımlar. Ayrıca, apoptotik analiz miRNA tedavi nedeniyle yapıldı ve burada anlatılan. Biyoinformatik yolu analiz desteklenmiştir. Burada sunulan iletişim kuralları analiz tedavi için Kombinatorik miR-143, potansiyel ve miR-506 kullanılır.

Ana amacı bu iletişim kuralı, miRNAs hücrelerde, hücre döngüsü odaklanarak etkilerini belirlemektir. Çeşitli teknikler burada yayılma alanından gen ifade analizi öncesi çeviri (ayrıntı için qPCR kullanarak) ve yeni sunulan teknikleri gen Analizi Mikroarray çözümlemesi gibi protein düzeyinde için. Bu rapor araştırmacılar miRNAs ile çalışmak için yararlıdır umulmaktadır. Ayrıca, metodoloji Apoptozis hücre ve hücre döngüsünün akış sitometrik analizi için sunulmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. miR-143 ve miR-506 transfection

: Lateks eldiven, koruyucu gözlük ve bir laboratuvar kat açıklanan deneyler yaparken dikkatli olun. Gerektiğinde, Biyogüvenlik kabini, solunum yolları engelleme veya laminar hava akımı rahatsız olmadan kabine fan ile kullanın. Her zaman koruma cam pencere uygun yüksekliğe üretici tarafından açıklandığı gibi ayarlayın.

  1. Tohum NSCLC A549 hücreleri bir T25 cm2 şişe/6/96 iyi plaka DMEM/F12K medya % 10 FBS ve % 1 penisilin-streptomisin (kültür medya) doku kültürü Hood ile desteklenmiş ve gecede %5 CO2 bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. MiR-143 ve/veya miR-506 taklit eder askıya alma veya karıştırmak transfecting maddesi ile siRNA (miR 2.4 µg transfecting Ajan 14 µL ile karışık; Tablo reçetesibakın) transfection medya ve 1,5 mL serum ve antibiyotik ücretsiz 500 µL içinde DMEM/F12K medya, bir son miRNA konsantrasyon 100 nM. miRNA tutar optimizasyonu farklı hücreleri ve konsantrasyonları gerektirebilir. Uygun bir yaklaşım ile artan konsantrasyonları miRNA (yani, 50-200 nM) ve faiz genlerin ifade downregülasyon değerlendirilmesi hücrelerinin transfection içerir.
  3. Şişesi/plaka kültür ortamını çıkarın ve bir kez 1 x PBS ile yıkayın.
  4. MiRNA/scramble-transfecting Ajan kompleksleri ekleyin ve 37 ° c 6 h %5 CO2 ile kuluçkaya (ebatı eklenen kuluçka birimi tanımlar).
  5. 4 mL ile Kültür medya ortamı değiştirin ve hücreler 24 h ve/veya 48 h için kuluçkaya.
  6. Transfected hücreleri her T25 cm2 şişeye tripsin-EDTA 1 mL ekleyerek trypsinization, hasat, 5-10 dk 37 ° C'de için kuluçkaya ve kültür hücreleri hasat için medya 3 mL ekleyin. Her şişe içeriğini ayrı, işaretli 15 mL tüp içine yerleştirin. Doku kültürü mahallede çalışıyorum.
  7. Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
    Not: ajitasyon tüp hücrelerinin kaybı neden olabilir dikkat olarak süpernatant kaldırma sırasında gereklidir.
  8. 2 mL 1 x PBS ve 5 min için santrifüj 751 x g. Ekle
  9. Adım 7 ve 8 bir kez medya ve süpernatant izlerini kaldırmak için yineleyin.
    Not: Bu aşamada örnek tüpler-80 ° C'de depolanan veya hemen kullanılabilir.

2. RNA çıkarma

  1. Çalışma alanının % 70 izopropil alkol ve RNAse dekontaminasyon çözüm ile püskürtülerek temiz.
  2. RNA ayıklama uygun bir RNA kullanılarak gerçekleştirilmesi (bkz. Tablo reçetesi) kit.
  3. -80 ° C'den tüpler kaldırın ve çözülme izin. 300 µL lizis arabellek ve hücre zarının yukarı ve aşağı kırmaya pipet ekleyin.
  4. % 100 ultra-saf etanol eşit bir hacmi ekleyin.
  5. İyice karıştırın ve sütun ayıran yer.
  6. 11 ve 16 x g 30 s ve Kaldır akışı aracılığıyla arasındaki santrifüj kapasitesi.
  7. Tampon ve arabellek kaldırmak için santrifüj yıkama 400 µL ekleyin.
  8. Ben 75 µL DNA sindirim ile her örnek içinde tampon ve 15 min için kuluçkaya Dnaz 5 µL ekleyin.
  9. Örnek 400 µL RNA hazırlık arabelleği ile yıkayın.
  10. 2 x RNA yıkama arabellek ile yıkayın.
  11. Nükleaz ücretsiz su sütunu için santrifüj, sonra toplamak RNA ekleyin.
  12. Toplam RNA konsantrasyon UV Spektrofotometre ile ölçmek.

3. RT-qPCR

  1. RT-qPCR önce cDNA sentez. RNA konsantrasyon miktar sonraki tepki cDNA PCR tüp içinde hazırlamak için 20 µL son hacmi 1 µg RNA'ın yerleştirin. Her zaman temiz bir bankta çalışır.
  2. Diğer gerekli tüm malzemeler Tablo 1' e eklenmiştir.
MalzemelerMiktar (µL) / örnekleme (20 µL)
5 X cDNA Master mix4
dNTPs2
Rastgele hexamers1
RT artırıcı1
Verso enzim karışımı1
Dnaz ve RNase ücretsiz su20 µL yapmak için RNA ekledikten sonra gerekli miktar

Tablo 1: RNA örneklerinden cDNA sentezi için malzemeler. CDNA sentezi için bir örnek bir ana karışım hazırlamak için ilgili maddeler miktarda gerekli.

  1. Aşağıdaki sıcaklık koşulları ile termal cycler kuluçkaya: 42 ° C 30 dakika; 2 min için 95 ° C; 4 ° C kadar örnekleri topluluğu.
  2. Hemen düzenli PCR veya qPCR kullanın veya cDNA-20 ° C'de depolayın
  3. Dnaz/RNase-Alerjik ile ileriye ve geriye doğru astar çözümleri su 10 µM hisse senedi astar çözümden bir konsantrasyon, hazır olun.
  4. Her gen, örnek sayısına göre tespit için ayrı ana karışımları hazırlayın. Her cDNA örnek (qPCR iyi) için tepki miktarı Tablo 2göre hazırlanır.
MalzemelerMiktar (µL) / örnekleme (20 µL)
SYBR master mix10
Primer - 10 mikron ileri2
Primer - 10 mikron ters2
Dnaz ve RNase ücretsiz su3
cDNA örnek3

Tablo 2: malzemeler cDNA örneklerinden nicel gerçek zamanlı PCR. QPCR için bir örnek bir ana karışım hazırlamak için maddeler miktarı gerekli.

  1. Her örnek kendi wells yerleştirin.
  2. 96 iyi qPCR plaka için örnek düzeni tasarlayın. Her örnek ve analiz gen için reaksiyon triplicates ya da yapmak en azından içinde çoğaltır.
  3. Optik net yapışkanlı bir kapak ile 96 iyi plaka mühür.
  4. Hızlı-spin kalıbı her kuyunun ulaşmak tepki karışım izin verin.
  5. RT-qPCR göre aşağıdaki termal degrade çalıştırın:
    1) 2 min için 50 ° C
    2) 95 ° C için 2 dk
    3) 95 ° C 15 s
    4) okuma al
    5) 1,5 dk 60 ° C
    6) adım 3 için 39 kez tekrarlayın
  6. Aşağıdaki termal degrade yukarıda tek ürün amplifikasyon gösteren erime eğrisi belirlemek için devamı olarak çalıştırın.
    7) 0.31 min için 65 ° C
    8) +0.5 ° C/döngüsü
    9) plaka okuma
    10) 8 için 95 ° C ulaşan kadar 60 kez yineleyin
    11) 72 ° C için 2 dk

4. özel Jel Elektroforez tek gen amplifikasyon onaylamak için

  1. % 1'özel jel 1 x TBE tampon hazırlayın.
  2. Son konsantrasyonu yaklaşık 0,2-0,5 ulaşmak kadar sıcak (~ 50 ° C) jel etidyum bromür (EtBr) eklemek µg/mL. EtBR DNA ile bağlar ve UV jel Imager içinde ışığı altında görüntülenmeyecektir sağlar.
  3. Sıcak Jel Elektroforez jel kutusu ile sağlanan bir jel tepsi dökmek. Sıkı bir şekilde üniforma wells için sağlanan tarak iliştirin.
  4. Geri kalanı için jel ve oda sıcaklığında (RT) soğumaya ~ 30 min için izin verir.
  5. Ne zaman jel katılaşmış, jel ve tepsi jel kutuya koyun.
  6. Jel kutusu ile 1 x TBE tampon dolduramazsınız jel tamamen kaplıdır.
  7. DNA PCR güçlendirme işleminden bir UV Spektrometre kullanılarak konsantrasyonu ölçmek.
  8. ~ 15 al DNA ng küçük bir PCR tüp boya 5 µL ekleyip nükleaz ücretsiz su 15 µL toplam hacmi elde etmek için gerekli miktarda ekleyin.
  9. DNA merdiven ve örnekleri kuyu yükleyin.
  10. Yaklaşık % 75-%80 aşağı jel boya çizgidir kadar jel 100 V çalıştırın.
    Not: jel bir negatif pozitif giderlerini yayınladığından emin olun.
  11. Jel kaldırmak ve DNA görselleştirmek için jel Imager yerleştirin.

5. Hücre döngüsü analizi

  1. Tohum 5 x 105 hücreleri her bir T25 cm2 şişeye örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.
  2. 24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.
  3. Hücre süspansiyonlar 15 mL steril tüpler için transfer ve onları düzgün etiket.
  4. 751 x g 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.
  6. Artık medya kaldırmak için 1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.
  7. Resuspend ve pipetting tarafından buz gibi 1 x PBS 200 µL ekleyerek Pelet kesin.
  8. Hücreleri % 70 buz gibi etanol dropwise 2 mL tüp vortexing ederken yavaşça ekleyerek düzeltmek.
  9. Tüpler, RT 30 dk için kuluçkaya ve tüpler için 1 h 4 ° C'de yer.
  10. 4 ° C ve 5 min için vasıl 751 x g santrifüj tüpleri çıkarın.
  11. Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.
  12. 1 x PBS propidium iyodür (50 µg/mL) ve ribonükleaz bir (200 µg/mL) ile 500 µL Ekle
  13. RT, 30 dk için örnekleri ışıktan koruyarak kuluçkaya.
  14. Akış Sitometresi verileri elde etmek. İleri en üstte ve üst tarafı dağılım (FSC FSC SSC yoğunluğu arsa ve hücre kümeleri sol alt köşesinde enkaz hariç hücrelerinin ana nüfus seçmek için SSC) vs kullanın-FSC SSC yoğunluğu arsa sağ tarafında.
  15. Hücre döngüsü aşamasını uygun yazılım ile başına hücre popülasyonlarının tanımlanması için verileri analiz.

6. Apoptosis tahlil

  1. Tohum 5 x 105 hücreleri her bir T25 cm2 şişeye örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.
  2. 24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.
  3. Hücre süspansiyonlar 15 mL steril tüpler için transfer ve onları düzgün etiket.
  4. Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.
  6. Artık medya kaldırmak için 1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.
  7. 10 x 1 x ile buz gibi dH2O. Annexin V bağlayıcı arabelleğe sulandırmak
  8. 1 mL 1 x V Annexin bağlama arabellek her örnek tüp ekleyin ve hafifçe resuspend.
  9. 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde yer 96 µL of hücre süspansiyon.
  10. Annexin V-FITC eşlenik 1 µL ve propidium iyodür (PI) 12.5 µL hücre süspansiyon içeren tüp ekleyin.
  11. Hücre süspansiyon buz karanlıkta 10 min için kuluçkaya.
  12. Annexin V bağlama arabellek x 250 µL buz gibi 1 sulandırmak için her örnek tüp ekleyin.
  13. Akış Sitometresi ile örnekleri hemen analiz edin.

7. protein ifade antikor hücre döngüsü Mikroarray tarafından

  1. Tohum 5 x 105 hücreleri her T25 cm2 şişeler içinde örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.
  2. 24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.
  3. Hücre süspansiyonlar 15 mL tüpler için transfer ve onları buna göre etiket.
  4. Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.
  6. 1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.
  7. Proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş lizis arabelleği 150 µL ekleyin. Damlalıklı yukarı ve aşağı yavaşça hücre zarlarında bozmaya.
  8. Herhangi bir lizis arabellek etkilenmemesi için üreticinin solvent alışverişi sütunları kullanarak etiketleme arabellek ile lizis tampon yerine bir arabellek değişimi gerçekleştirmek.
  9. Toplam protein BCA tahlil ile ölçmek.
  10. 70 µg protein örneği alıp 75 µL son hacmi elde etmek için etiketleme arabellek ekleyin.
  11. Dimethylformamide (DMF) 100 µL 1 mg biotin reaktif (biotin/DMF) ekleyin.
  12. Biotin/DMF 3 µL her protein örnek (biotinylated protein örnek) ekleyin ve RT. 2 h için kuluçkaya
  13. Vortexing tarafından 35 µL dur reaktif ve karışımı ekleyin.
  14. RT, örnekleri 30 dk için kuluçkaya.
  15. Böylece onlar için 1S kullanmadan önce RT için sıcak Mikroarray slaytlar buzdolabından çıkarın.
  16. Non-spesifik bağlama için 45 dk RT. az için sürekli sallayarak ile bir petri içinde % 3 kuru süt çözümde (engelleme reaktif üreticisi tarafından sağlanan) ile slaytlar kuluçka tarafından engelleme gerçekleştirmek
  17. Slaytlar GKD2O su ile yıkamak (aksi belirtilmedikçe, çamaşır GKD2O ile yer alır).
  18. Çamaşır ~ 10 x tamamen engelleme çözüm slayt yüzeyler arasında kaldırmak için adımları yineleyin. Bu bir üniforma ve düşük arka plan elde etmek önemlidir.
  19. Slayt yüzeyler arasında aşırı su çıkarın ve kuru slayt izin olmadan sonraki adıma geçin.
  20. Kaplin çözüm kaplin reaktif % 3 kuru süt çözülerek hazırlayın.
  21. 6 mL kaplin çözüm ve önceden hazırlanmış biotinylated protein örnek tam miktarı 7.12 adımından ekleyin.
  22. Kaplin odasının bir iyi yer bir slayt satıcı tarafından sağlanan ve protein karışımı için kaplin ~ 6 mL ekleyin.
    Not: Slayt tamamen protein karışımı çözüm kaplin sular altında olun.
  23. Kaplin odası kapak ve RT 2 h ile bir orbital shaker sürekli ajitasyon için kuluçkaya.
  24. Slaytları bir Petri kabına aktarın ve arabellek yıkama x 1 30 mL ekleyin. Orbital Çalkalayıcı Petri kabına koyun, 10 dakikadır sallamak ve çözüm atın.
  25. Adımı yineleyin 7.24 2 x.
  26. 7,17 ve 7.18 adımlarda açıklandığı gibi kapsamlı slaytlar GKD2O su ile durulama ve hemen kurutma önlemek için sonraki adıma geçin.
  27. Cy3-streptavidin (0,5 mg/mL) 30 µL algılama arabelleği 30 mL ekleyin.
  28. Slayt bir Petri kabına yerleştirin ve algılama arabelleği Cy3-streptavidin içeren 30 mL ekleyin.
  29. Orbital shaker sürekli ışıktan korunan sallayarak ile 20 dk için kuluçkaya.
    Not: Bir floresan boya Cy-3'tür. Alüminyum folyo ile kapatın veya floresan yoğunluğu korumak için karanlık koşullar altında çalışır.
  30. 7.24 7.26 adımlarını gerçekleştirin ve kuru hava yumuşak akışı kullanarak veya bir 50 mL konik tüp ve 5-10dk için 1300 x g , santrifüj slayt yerleştirmek slayt izin.
  31. Slaydı slayt tutucu ve alüminyum folyo ile kapatın yerleştirin.
  32. Uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında Mikroarray tarayıcıyla slayt tarama. Cy3 söz konusu olduğunda, uyarma dalga boyu zirve 570 ~ ~ 550 nm ve emisyon zirvesinde yer almaktadır nm.
  33. «««Analiz) ( Tablo malzemelerigörmek) veri için kullanılan yazılım.

8. RNA sıralama

  1. Tohum 5 x 105 hücreleri her T25 cm2 şişeler içinde örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.
  2. 24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.
  3. Hücre süspansiyonlar 15 mL tüpler için transfer ve onları buna göre etiket.
  4. RNA Bölüm 2, 1-6 adımları göre ayıklayın.
  5. Konsantrasyon ile bir bioanalyzer yanı sıra RNA kalite kontrol edin. Bir RNA bütünlük (RIN) sekiz puan ve uygun çubuk grafikler RNA kalite onaylamak gerekli.
  6. Toplam RNA, RNA (Toplam RNA üzerinden mesajcı RNA) sıralama için ~ 2 µg örnek kullanın
  7. Yeni nesil Sekanslama11kullanılarak sırası.
  8. Kalite düzeltme çalıştırmak ve makine11sıralama RNA oluşturulan FASTQ dosyalarından başvuru genom ile eşleyin.
  9. FASTQ dosyaları ve ham okuma sayısı verileri talimatları takip Genebank için upload < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> Web sitesi.
    Not: önceki sonuçları için katılım numarası SRP133420 bakın.

9. tüp oluşumu tahlil

  1. MiRNA transfected insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) 36 h sonrası transfection, anjiogenik potansiyelinin 1, adım 1-5, HUVEC hücre A549 hücreler yerine kullanarak kısmında açıklandığı gibi değerlendirmek.
  2. 37 ° C % 5 CO2ile 4 h için M199 açlık medya ile HUVECs açlıktan.
  3. Düşük büyüme faktörü membran matris kabarcık oluşumu ve polimerizasyon önlemek kademeli çözdürme izin-80 ° C ve mağaza bir gecede 4 ° C'de kaldırın.
  4. Yavaş yavaş ve dikkatli 96 iyi plaka wells kabarcık oluşumu kaçınarak düşük büyüme faktörü membran matrisinin 0,04 mL ile kat. Laminar akış başlık altında tüm yordamı gerçekleştirin.
  5. 96 iyi plaka bitişik wells nem korumak ve sıcaklığı korumak için PBS 0.1 mL ile doldurulması.
  6. Böylece polimerizasyon membran ekstresinin elde 96 iyi plaka için en az 20 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Daha 1 h için kuluçkaya değil.
  7. Her gruptan transfected HUVECs trypsinize ve orta M199, 1 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon içinde resuspend.
  8. Her hücre süspansiyon 0.1 mL polimerli membran matris 96 iyi plaka içeren wells ekleyin.
  9. Hazırlık büyüme faktörlerinin yer alır iken % 5 CO2 37 ° C'de 96 iyi plaka kuluçkaya. Büyüme faktörleri hazırlanması da laminar akış başlık altında yer alır.
  10. Büyüme faktörü (VEGF) son istenen konsantrasyonu (2 ng/mL nihai toplama 4 ng/mL konsantrasyona) x 2 sulandırmak ve büyüme faktörü içeren M199 açlık orta üst kısmında M199 açlık orta hücreleri ile 0.1 mL 0.1 mL ekleyin. VEGF tedavi kuyular için 0,1 mL M199 açlık orta M199 açlık orta hücreleri ile 0.1 mL üstüne ekleyin.
  11. 6 h %5 CO2ile 37 ° C'de 96 iyi plaka kuluçkaya.
  12. Kuluçka dönemi sonunda, her şey bir dijital kamera ile bağlı bir aydınlık alan mikroskop kullanarak 4 x büyütme ile görüntü elde.
  13. Yazılım bir "angiogenez analyzer" eklenti19ile donatılmış ile işlemi görüntüler. Üç parametre, düğüm sayısı, kavşaklar ve toplam Filiz uzunluğu, anjiogenez üzerinde miRNA tedavisinin etkileri karşılaştırmak için kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

RT-qPCR ve Jel Elektroforez kullanarak gen ifade analizi

RT-qPCR kullanarak farklı gen ifade analizi önemli downregülasyon hedeflenen genlerin CDK1, CDK4 ve CDK6 gösterdi. CDK1 ve CDK4/6 sırasıyla G2/M ve G1/S geçişleri için etkili olduğu gösterilmiştir. Gerçekleştirilen analiz bireysel miRs ve Kombinatorik miR aktivite arasında doğrudan karşılaştırma izin. Scramble siRNA yordamdan gelen herh...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

miRNAs kanser tedavisi, ifade seviyelerinde bozukluk tanıma için hedeflenmiş tedaviler olarak çalışabilir hastalıklı normal dokuların vs. Bu çalışmada potansiyel olarak birden çok aşamaları sırasında hücre döngüsü ilerleme durdurmak miRNAs belirlemek amaçlanmıştır. MiR-143 ve miR-506 hücre döngüsü bu Kombinatorik miRNA tedavinin etkinliğini anlamayı amaçlayan sunulan iletişim kuralları ve kanser hücrelerinin durdurmak tespit edilmiştir.

Açıklanan yöntemle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar Louisiana State Üniversitesi'nde John Caskey yolu analizi RNA sıralama veri ve University of Texas Southwestern Tıp Merkezi, McDermott Merkezi sonraki nesil sıralama çekirdek için onun yardımını kabul etmek istiyorum RNA sıralama ve veri çözümlemesi gerçekleştirme. Bu araştırma üniversite eczacılık, Louisiana Üniversitesi Monroe başlangıç finansman ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) aracılığıyla Ulusal Enstitüsü, genel tıbbi bilim hibe 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1 tarafından desteklenmiştir.

Teşekkürler

Hiçbir çıkar çatışmaları bildirilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
-80 °C FreezerVWRVWR40086A
96 well plateCELLTREAT Scientific 50-607-511
96-well Microwell Plates  Thermo Scientific12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer CellsATCCATCC CCL-185
AgaroseVWR0710-25G
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNAAmbionAM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 ReactionsFull Moon BioKAS02
Bright field microscope  Microscoptics IV-900
Bright field microscope  New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 SlidesFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceSteps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time SystemBioRadCFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging SystemBioRadChemidoc Touch Imaging System
CO2 IncubatorThermo ScientificHERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixTrevigen3433-010-01
Digital CameraAmScope FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-GlutamineVWRVWRL0100-0500
DNAse IZymo ResearchE1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)BD Biosciences356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack SetsEppendrof05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagentsBP2818500
Ethidium bromideAlfa acarL07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, CorningCorning45000-354
FACS Calibur FlowcytometerBecton Dickinson
Fetal Bovine Serum - PremiumAntlanta BiologicalsS11150
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher Scientific10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap CapsFisherbrand Basix02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubatorThermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis systemBenchtop lab systemBT102
hsa-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)Thermo ScientificPHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)Individual donorsIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenResults: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10-977-015
Lipofectamine 2000 Invitrogen11-668-027
Loading dye 10Xward's science+470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)Sigma AldrichM4530
Microscope Digital CameraAmScope MU130
Modfit LTVerity SoftwareStep 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Power UP sybr green master mixApplied BiosystemsA25780
Propidium IodideMP Biochemicals LLCIC19545825
Proscanarray HT Microarray scannerPerkin elmerASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive coverApplied Biosystems4360954
Quick-RNA KitsZymo ResearchR1055
Ribonuclease A from Bovine pancreasSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerStep 7.33: Microarray analysis software
ShakerThermo Scientific2314
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15mlVWR470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50mlVWR470225-004
TBS Buffer, 20x liquidVWR10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchineThermo ScientificST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchineEppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated FlasksThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted PlatesThermo ScientificAB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)Thermo ScientificAB1453B
Ultra Low Range DNA LadderInvitrogen10597012
VWR standard solid door laboratory refrigeratorVWR

Referanslar

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090(2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769(2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495(2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543(2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078(2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser ara t rmalarsay 145transfectionmiRNAakci er kanserih cre d ng sApoptozisanjiogenezRNA s ralama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır