Analyse der kombinatorischen MiRNA Behandlungen zur Regulierung des Zellzyklus und Angiogenese

Zusammenfassung

MiRNA-Therapeutika haben erhebliches Potenzial bei der Regulierung der Tumorprogression. Hier demonstriert werden analytische Ansätze zur Identifikation der Aktivität einer kombinatorischen MiRNA-Behandlung in der Eindämmung des Zellzyklus und Angiogenese verwendet.

Zusammenfassung

Lungenkrebs (LC) ist die führende Ursache von Krebs-in Verbindung stehenden Todesfälle weltweit. Ähnlich wie bei anderen Krebszellen, ist ein wesentliches Merkmal des LC Zellen unkontrollierte Proliferation und Zellteilung. Hemmung der Proliferation von Zellzyklus Fortschreiten zu stoppen hat gezeigt, ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Krebs, einschließlich LC.

MiRNA Therapeutika sind als wichtige posttranskriptionelle gen Regulatoren entstanden und werden zunehmend für den Einsatz in der Krebstherapie untersucht. In den letzten Arbeiten haben wir zwei MiRNAs, MiR-143 und MiR-506, zur Regulierung des Zellzyklus Progression verwendet. A549 nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebszellen wurden transfiziert gen Ausdruck Änderungen wurden analysiert und apoptotische Aktivität aufgrund der Behandlung war schließlich analysiert. Herabregulation von cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) erkannt wurden (d. h. CDK1, CDK4 und CDK6), und den Zellzyklus gestoppt an den Phasenübergängen G1/S und G2/M. Pathway Analyse zeigte mögliche Anti-angiogenetische Tätigkeitsbereich die Behandlung, die das Konzept mit vielfältigen Aktivitäten verleiht. Hier beschrieben, sind die Methoden zur Identifikation von MiRNA Tätigkeit betreffend Zellzyklus Hemmung, Induktion der Apoptose und Auswirkungen der Behandlung auf Endothelzellen durch Hemmung der Angiogenese. Es ist zu hoffen, dass die hier vorgestellten Methoden Zukunftsforschung auf MiRNA Therapeutika und entsprechende Aktivität unterstützen und die repräsentativen Daten andere Forscher während experimentelle Analysen leiten werden.

Einleitung

Der Zellzyklus ist eine Kombination aus mehreren regulatorischen Ereignisse, die Vervielfältigung der DNA und Zellproliferation durch den mitotischen Prozess¹ermöglichen. Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) regulieren und fördern die Zellzyklus-². Unter anderem haben die mitotische CDK (CDK1) und Interphase CDKs (CDK2, CDK4 und CDK6) eine zentrale Rolle im Zellzyklus Progression³. Retinoblastom-Protein (Rb) ist von der CDK4/CDK6 komplexe erlauben Zellzyklus Fortschreiten⁴phosphoryliert und CDK1 Aktivierung ist unerlässlich für erfolgreiche Zellteilung⁵. Zahlreiche CDK-Inhibitoren wurden entwickelt und bewertet in klinischen Studien in den letzten Jahrzehnten zeigt das Potenzial des Zielens CDKs in der Krebsbehandlung. In der Tat drei CDK-Inhibitoren zur Behandlung von Brustkrebs genehmigt worden vor kurzem^6,7,8,9,10. So CDKs und insbesondere CDK1 und CDK4/6, sind von großem Interesse bei der Regulierung der Zelle Tumorprogression.

MiRNAs (MiRs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs und posttranskriptionelle Regulatoren der Genexpression, Regulierung von ca. 30 % aller menschlichen Gene¹¹. Ihre Tätigkeit basiert auf translationale Repression oder zum Abbau von Messenger-RNAs (mRNAs)¹². Beispielhaft für ihre biologische Bedeutung, mehr als 5.000 MiRNAs wurden identifiziert und ein einzelnes MiRNA-Molekül kann mehrere Gene^11,13regulieren. Noch wichtiger ist, wurde MiRNA Ausdruck verschiedener Krankheiten und Zustände von Krankheit, einschließlich Krebs¹³zugeordnet. In der Tat MiRNAs haben so onkogenen gekennzeichnet worden oder Tumor-Suppressoren, fähig zu fördern oder zu unterdrücken Tumor Entwicklung und Progression^14,15. Die relative Expression von MiRNAs in erkrankten Geweben kann Fortschreiten der Krankheit regulieren; so hat die exogene Lieferung von MiRNAs therapeutisches Potenzial.

Lungenkrebs ist die häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle und mehr als 60 % aller malignen Erkrankungen Lunge nicht klein sind Zelle Lungenkrebs Krebs^16,17, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 20 %¹⁸. Die Verwendung von MiR-143-3 p und MiR-506-3 p wurde vor kurzem für die Ausrichtung der Zelle Zyklen in der Lunge Krebs Zellen¹¹bewertet. MiR-143 und MiR-506 Sequenzen, die Komplementarität CDK1 und CDK4/CDK6 sind, und die Auswirkungen dieser beiden MiRs auf A549 Zellen wurden analysiert. Die experimentelle Details werden vorgestellt und diskutiert in diesem Papier. Genexpression, Zellzyklus Progression und Apoptose wurden mit verschiedenen experimentellen Designs und Zeitpunkte nach Transfektion ausgewertet. Wir Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) Methoden zusammen mit Microarray-Analyse zur Messung der spezifischen Gen-Expression und RNA Sequenzierung der nächsten Generation wurde verwendet, um globale gen Dysregulation¹¹bestimmen. Die letztere Methode identifiziert die relative Häufigkeit jedes Gen Abschrift mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit, während Tausende von Genen aus einer einzigen experimentellen Analyse analysiert werden können. Darüber hinaus Apoptotic Analyse aufgrund der MiRNA-Behandlung wurde durchgeführt und wird hier beschrieben. Bioinformatik ergänzt die Pfad-Analyse. Hier werden Protokolle zur Analyse der das therapeutische Potenzial der kombinatorischen MiR-143 und MiR-506 verwendet.

Der Hauptzweck dieses Protokolls ist es, die Auswirkungen von MiRNAs in Zellen, mit einem Fokus auf den Zellzyklus. Die Vielfalt der Techniken hier vorgestellten Spanne von gen Expressionsanalyse Vorübersetzung (mit qPCR) zu erarbeiten und neue Techniken für die Genanalyse auf Proteinebene, wie Microarray-Analyse. Es ist zu hoffen, dass dieser Bericht hilfreich für Forscher in Zusammenarbeit mit MiRNAs interessiert ist. Darüber hinaus präsentiert Methodik zur durchflusszytometrischen Analyse des Zellzyklus und Apoptose der Zellen.

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Protokoll

1. MiR-143 und MiR-506 Transfektion

Achtung: Verwenden Sie Latexhandschuhe, schützende Brillen und einen Laborkittel während der Durchführung der beschriebenen Experimente. Bei Bedarf verwenden Sie das Biosafety-Gehäuse mit dem Gehäuse Lüfter, ohne die Atemwege blockieren oder stören die laminare Luftströmung. Immer die schützende Glasscheibe auf die passende Höhe eingestellt, wie vom Hersteller beschrieben.

1. Samen NSCLC A549 Zellen in ein T25 cm² Kolben/6/96 well-Platte in DMEM/F12K Medien mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (Kultur, Medien) in einer Gewebekultur Kapuze ergänzt und über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO₂ in einer Gewebekultur Inkubator inkubieren.
2. MiR-143 und/oder MiR-506 Mimik auszusetzen oder zu klettern, SiRNA mit transfecting Mittel (2,4 µg von MiR waren gemischt mit 14 µL transfecting Agent; siehe Tabelle of Materials) in 500 µL Transfektion Medien und 1,5 mL Serum und antibiotikafreien DMEM/F12K Medien in einer endgültige MiRNA-Konzentration von 100 nM. MiRNA kann Optimierung auf verschiedene Zellen und Konzentration erfordern. Entsprechende Ansätze umfassen die Transfektion von Zellen mit steigenden Konzentrationen von MiRNA (d.h., 50-200 nM) und Bewertung der Ausdruck Herabregulation der Gene von Interesse.
3. Nährmedien aus Kolben/Platte entfernen und einmal mit 1 X PBS waschen.
4. Hinzufügen von MiRNA/Scramble-transfecting-Agent-komplexe und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO₂ 6 h (Kolben Größe definiert zusätzliche Inkubation).
5. Ersetzen Sie die Medien mit 4 mL Nährmedien und inkubieren Sie Zellen für 24 h bzw. 48 h.
6. Ernte transfizierten Zellen durch Trypsinization, durch Zugabe von 1 mL Trypsin-EDTA in jedem T25 cm² Kolben, 5-10 min bei 37 ° C inkubieren, und 3 mL Kulturmedien, die Zellen zu ernten. Legen Sie den Inhalt jeder Flasche in eine separate, markierte 15 mL-Tube. Arbeiten Sie in einer Gewebekultur-Haube.
7. 751 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
   Hinweis: Vorsicht ist geboten beim überstand entfernen, da Agitation des Rohres Verlust von Zellen führen kann.
8. Fügen Sie 2 mL 1 X PBS und Zentrifuge für 5 min am 751 X g.
9. Wiederholen Sie die Schritte 7 und 8 einmal alle Spuren von Medien und überstand entfernen.
   Hinweis: In diesem Stadium Probenröhrchen können bei-80 ° C gelagert werden oder können sofort verwendet werden.

2. RNA-Extraktion

1. Reinigen Sie den Arbeitsbereich durch Besprühen mit 70 % Isopropylalkohol und RNAse Dekontaminationslösung.
2. RNA-Extraktion durchgeführt werden, mit einer entsprechenden RNA kit (siehe Tabelle der Materialien).
3. Entfernen Sie die Röhren von-80 ° C und lassen sie zu tauen. Fügen Sie 300 µL Puffer lyse und Pipette rauf und runter, die Zellmembran zu brechen.
4. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 100 % ultra-reines Ethanol.
5. Mischen Sie gut und in Spalte trennen.
6. Zwischen 11 und 16 X g für 30 s und Entfernen der durchströmten zentrifugieren.
7. Fügen Sie 400 µL Puffer und Zentrifuge zu entfernen, den Puffer zu waschen.
8. Fügen Sie 5 µL der DNAse I mit 75 µL DNA Verdauung Puffer in jeder Probe und 15 min inkubieren.
9. Waschen Sie die Probe mit 400 µL RNA Prep Puffer.
10. Waschen Sie 2 X mit RNA Waschpuffer.
11. Nuklease-freies Wasser die Spalte fügen Sie hinzu, Zentrifuge, dann sammeln die RNA.
12. Messen Sie RNA-Gesamtkonzentration mit einem UV-Spektralphotometer.

(3) RT-qPCR

1. Synthetisieren Sie vor RT-qPCR die cDNA. Im Anschluss an die RNA-Konzentration-Quantifizierung legen Sie 1 µg RNA in einem 20 µL Endvolumen von Reaktion, cDNA in einem PCR-Röhrchen vorzubereiten. Arbeiten Sie immer auf einen sauberen Werkbank.
2. Alle anderen Zutaten sind in Tabelle 1enthalten.

Zutaten	Menge (µL) / Probe (20 µL)
5 X cDNA Master mix	4
dNTPs	2
Zufällige hexamers	1
RT-enhancer	1
Verso Enzym-mix	1
DNase und RNase freies Wasser	Erforderliche Menge nach dem Hinzufügen von RNA zu 20 µL

Tabelle 1: Materialien für die cDNA-Synthese von RNA-Proben. Erforderlichen Mengen der jeweiligen Zutaten vorzubereiten einen master-Mix für eine Probe für die cDNA-Synthese.

3. Brüten in einem Thermocycler mit den folgenden Temperaturbedingungen: 42 ° C für 30 min; 95 ° C für 2 min; 4 ° C bis zur Abholung von Proben.
4. Sofort in regulären PCR oder qPCR verwenden Sie oder speichern Sie cDNA bei-20 ° C.
5. Bereiten Sie vorwärts und rückwärts Grundierung Lösungen mit DNase/RNase-freie Wasser in einer Konzentration von 10 µM aus Lager Primer Lösung.
6. Bereiten Sie separate master Mischungen für jedes Gen erkannt werden, entsprechend der Anzahl der Proben. Für jede Probe cDNA (qPCR gut) ist die Messgröße Reaktion nach Tabelle 2bereit.

Zutaten	Menge (µL) / Probe (20 µL)
SYBR-master-mix	10
Forward Primer - 10 μM	2
Rückwärts-Primer - 10 μM	2
DNase und RNase freies Wasser	3
cDNA-Probe	3

Tabelle 2: Werkstoffe für quantitative Real-Time PCR aus cDNA Proben. Erforderliche Menge der Zutaten, um ein master-Mix für eine Probe für qPCR vorzubereiten.

7. Legen Sie jede Probe in den jeweiligen Brunnen.
8. Das Probe-Layout für die 96 auch qPCR-Platte. Für jede Probe und analysierten Gens führen die Reaktion im Triplicates oder am wenigsten in Duplikate.
9. Verschließen Sie die 96-well-Platte mit einem optisch klare selbstklebende Deckel.
10. Quick-Spin die Platte, um das Reaktionsgemisch auf den unteren Rand jedes gut erreichen lassen.
11. RT-qPCR nach folgenden Temperaturgefälle ausgeführt:
    (1) 50 ° C für 2 min
    (2) 95 ° C für 2 min
    (3) 95 ° C für 15 s
    (4) Meßwert
    (5) 60 ° C 1,5 min.
    (6) wiederholen Sie Schritt 3 für 39 Mal
12. Führen Sie die folgende Temperaturgefälle in Fortsetzung der oben genannten schmelzenden Kurve zu bestimmen, welche Einzelprodukt Verstärkung zeigt.
    (7) 65 ° C für 0,31 min
    0,5 ° C/Zyklus
    (9) Platte lesen
    (10) wiederholen Sie Schritt 8 für 60 Mal bis zu 95 ° C
    (11) 72 ° C für 2 min

(4) Agarose-Gelelektrophorese, einzelne Gene Amplification zu bestätigen

1. Bereiten Sie 1 % Agarose-Gel auf 1 X TBE-Puffer.
2. Fügen Sie Interkalation Bromid (EtBr) in warmen (~ 50 ° C) Gel bis erreicht eine Endkonzentration von etwa 0,2-0,5 µg/mL. EtBR mit DNA bindet und erlaubt es, unter UV-Licht in ein Gel-Imager visualisiert werden.
3. Gießen Sie warme Gel in einem Gel-Tablett mit ein Elektrophorese-Gel-Box geliefert. Befestigen Sie den mitgelieferten Kamm fest für einheitliche Brunnen.
4. Ermöglichen Sie das Gel mit Rest und abkühlen auf Raumtemperatur (RT) für ~ 30 min.
5. Wenn das Gel verfestigt ist, legen Sie das Gel und Tablett im Feld Gel.
6. Füllen Sie die Gel-Box mit 1 X TBE Puffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist.
7. Messen Sie die Konzentration der DNA von PCR-Amplifikation-Prozess mit einer UV-Spektrometer.
8. Nehmen Sie ~ 15 ng DNA in ein PCR-Röhrchen, 5 µL Farbstoff hinzufügen und fügen Sie die erforderliche Menge an Nuklease-freies Wasser auf ein Volumen von insgesamt 15 µL zu erreichen.
9. Laden Sie die DNA-Leiter und Proben in die Vertiefungen.
10. Führen Sie das Gel bei 100 V, bis die Farbstoff-Linie etwa 75-80 % nach unten das Gel ist.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Gel von einem negativen zu positiven Ladung läuft.
11. Entfernen Sie das Gel und legen Sie sie in der Gel-Imager, DNA zu visualisieren.

5. Zellzyklus-Analyse

1. 5 x 10⁵ Samenzellen für jede Probe in einem T25 cm² Kolben und führen eine Transfektion gemäß dem Protokoll beschrieben in Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5.
2. Nach 24 h und 48 h dann ernten Sie die Zellen durch Trypsinization.
3. Übertragen der Zellsuspensionen auf 15 mL steriles Röhrchen und beschriften Sie sie ordnungsgemäß.
4. Zentrifugieren Sie Proben bei 751 X g für 5 min und verwerfen Sie den überstand.
5. Fügen Sie 2 mL eiskaltes 1 X PBS, Wirbel und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
6. Wiederholen Sie die Waschschritt mit 1 X PBS, passives Medium zu entfernen.
7. Aufschwemmen Sie und brechen Sie das Pellet durch Zugabe von 200 µL des eiskalten 1 X PBS durch pipettieren.
8. Zellen zu beheben, indem Sie sanft das Rohr beim Aufschütteln 2 mL 70 % eiskaltem Ethanol tropfenweise hinzufügen.
9. Inkubieren Sie Rohre für 30 min bei RT und legen Sie die Rohre bei 4 ° C für 1 h.
10. Rohre von 4 ° C und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min zu entfernen.
11. Fügen Sie 2 mL eiskaltes 1 X PBS, Wirbel und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
12. Hinzufügen von 500 µL 1 X PBS mit Propidium Jodid (50 µg/mL) und Ribonuklease ein (200 µg/mL)
13. Inkubieren Sie für 30 min bei RT und die Proben vor Licht zu schützen.
14. Erwerben Sie Daten auf Durchflusszytometer. Verwenden Sie vorwärts vs. Side Scatter (FSC vs. SSC) zu den wichtigsten Population von Zellen, ausgenommen Schutt in der unteren linken Ecke der FSC vs. SSC Dichte Handlung und Zelle Cluster wählen an der Spitze nach oben-rechts der FSC vs. SSC Dichte Handlung.
15. Analysieren von Daten zur Identifizierung des Zell-Populationen pro Zellzyklus Etappe mit der entsprechenden Software.

(6) Apoptose-assay

1. 5 x 10⁵ Samenzellen für jede Probe in einem T25 cm² Kolben und führen eine Transfektion gemäß dem Protokoll beschrieben in Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5.
2. Nach 24 h und 48 h Ernte der Zellen durch Trypsinization.
3. Übertragen der Zellsuspensionen auf 15 mL steriles Röhrchen und beschriften Sie sie ordnungsgemäß.
4. 751 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
5. Fügen Sie 2 mL eiskaltes 1 X PBS, Wirbel und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
6. Wiederholen Sie die Waschschritt mit 1 X PBS, passives Medium zu entfernen.
7. Verdünnen Sie 10 x Annexin V Bindung Puffer, 1 X mit eiskalten dH₂O.
8. Jede Probe Tube 1 mL 1 x Annexin V Bindung Puffer hinzu und Aufschwemmen Sie sanft.
9. Platz 96 µL der Zellsuspension in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
10. Das Röhrchen mit der Zellsuspension fügen Sie 1 µL Annexin V-FITC-Konjugat und 12,5 µL Propidium Jodid (PI hinzu).
11. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 10 min auf Eis im Dunkeln.
12. Jede Probenröhrchen verdünnen fügen Sie 250 µL eiskalte 1 x Annexin V Bindung Puffer hinzu.
13. Analysieren Sie Proben mit Durchflusszytometer sofort.

(7) Proteinexpression durch Antikörper Zellzyklus microarray

1. 5 x 10⁵ Samenzellen für jede Probe in T25 cm² Flaschen und führen Sie eine Transfektion gemäß dem Protokoll beschrieben in Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5.
2. Ernten Sie nach 24 h und 48 h Zellen durch Trypsinization.
3. Zellsuspensionen auf 15 mL Röhrchen übertragen und entsprechend beschriften.
4. 751 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
5. Fügen Sie 2 mL eiskaltes 1 X PBS, Wirbel und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
6. Wiederholen Sie die Waschschritt mit 1 X PBS.
7. Fügen Sie 150 µL Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren ergänzt. Pipettieren oben und unten vorsichtig, die Zellmembranen zu stören.
8. Zur Vermeidung von Interferenzen Lyse Puffer führen Sie ein Buffer Tausch den Lyse-Puffer mit Kennzeichnung Puffer, mit Lösemittel Austausch von Spalten des Herstellers zu ersetzen.
9. Quantifizieren Sie die gesamte-Protein mit einem BCA-Assay.
10. Nehmen Sie 70 µg Protein Probe und Kennzeichnung Puffer zu einem Endvolumen von 75 µL zu erreichen.
11. 1 mg Biotin Reagenz (Biotin/DMF) 100 µL Dimethylformamid (DMF) hinzufügen.
12. Jedes Protein Sample (biotinylierte Protein Beispiel) 3 µL Biotin/DMF hinzu und 2 h bei RT inkubieren
13. Vortexen 35 µL Stop Reagenz und Mischung hinzufügen.
14. Inkubieren Sie Proben bei RT 30 min.
15. Nehmen Sie die Microarray-Dias aus dem Kühlschrank, so dass sie auf RT 1 h vor Gebrauch warm.
16. Führen Sie blockieren für unspezifische Bindung durch Inkubation der Folien mit Trockenmilch 3 % Lösung (in blocking Reagenz vom Hersteller bereitgestellt) in einer Petrischale mit kontinuierlichen Schütteln für 45 min bei RT
17. Der Objektträger mit DdH₂O Wasser waschen (sofern nicht anders angegeben, Waschen erfolgt mit DdH₂O).
18. Wiederholen Sie die Waschschritt ~ 10 X um die blockierende Lösung von die Gleitflächen zu entfernen. Dies ist wichtig, einen einheitlichen und niedrigen Hintergrund zu erreichen.
19. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus der Gleitflächen und mit dem nächsten Schritt fortfahren Sie, ohne die Folien trocknen zu lassen.
20. Bereiten Sie Kupplung Lösung durch Auflösen von 3 % trockene Milch in ein Kupplung-Reagenz.
21. 6 mL der Kupplung-Lösung und die gesamte Menge der vorbereiteten biotinylierte Protein Probe aus Schritt 7.12 hinzufügen.
22. Statt einer Folie in einen Brunnen der Kupplung Kammer vom Hersteller bereitgestellten und ~ 6 mL Protein Mischung darauf Kupplung.
    Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die Folie im Protein Mischung Lösung Kupplung vollständig eingetaucht sind.
23. Decken Sie die Kupplung Kammer und 2 h bei RT mit kontinuierlichen Erregung in einem Orbitalschüttler inkubieren.
24. Übertragen Sie die Folien auf einer Petrischale und 30 mL 1 x Waschpuffer. Legen Sie die Petrischale in Orbitalschüttler, schütteln für 10 min und die Lösung zu verwerfen.
25. Wiederholen Sie Schritt 7,24 2 X.
26. Spülen Sie die Folien mit DdH₂O Wasser ausgiebig wie in den Schritten 7.17 und 7.18 beschrieben und fahren Sie mit nächsten Schritt sofort um Austrocknen zu vermeiden.
27. Fügen Sie in 30 mL Detektionspuffer 30 µL Cy3-Streptavidin (0,5 mg/mL).
28. Legen Sie die Folie in einer Petrischale und 30 mL Detektionspuffer mit Cy3-Streptavidin.
29. Brüten Sie in einem Orbitalschüttler für 20 min mit kontinuierlichen schütteln vor Licht geschützt.
    Hinweis: Cy-3 ist ein fluoreszierender Farbstoff. Mit Aluminiumfolie abdecken oder arbeiten unter schlechten Lichtverhältnissen zu Fluoreszenzintensität zu erhalten.
30. Führen Sie Schritte 7,24-7,26 und ermöglichen Sie die Folie trocken mit einem sanften Luftstrom oder Platzierung der Folie in ein 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 1300 X g für 5-10 min.
31. Legen Sie die Folie in Diahalter und mit Alufolie bedecken.
32. Scannen Sie die Folie in einem Microarray Scanner mit der entsprechenden Anregung und Emission Wellenlängen. Bei Cy3, steht Ihnen die Erregung Wellenlänge Peak ~ 550 nm und Emission Peak bei ~ 570 nm.
33. Analysieren Sie die Daten (siehe Tabelle der Materialien) für Software verwendet).

(8) RNA-Sequenzierung

1. 5 x 10⁵ Samenzellen für jede Probe in T25 cm² Flaschen und führen Sie eine Transfektion gemäß dem Protokoll beschrieben in Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5.
2. Nach 24 h und 48 h Ernte der Zellen durch Trypsinization.
3. Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf 15 mL-Tuben und entsprechend beschriften.
4. Extrahieren Sie RNA gemäß Abschnitt 2, Schritte 1 bis 6.
5. RNS-Qualität sowie Konzentration mit einem Bioanalyzer kontrollieren. Eine RNA-Integrität (RIN) über acht Punkte und entsprechende Histogramme sind notwendig, um RNS-Qualität bestätigen.
6. Verwenden Sie von der Gesamt-RNS ~ 2 µg der Probe für RNA Sequenzierung (Boten-RNA von Gesamt-RNS)
7. Sequenz mit einer nächsten Generation Sequenzer-¹¹.
8. Führen Sie Qualität trimmen und Karte mit einem Referenz-Genom von FASTQ Dateien, die von der RNA Sequenzierung Maschine¹¹generiert.
9. Laden Sie FASTQ Dateien und raw lesen die Zähldaten, Genbank, folgen Sie die Anweisungen des der < Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> Webseite.
   Hinweis: Siehe Zbl-Nummer SRP133420 für die bisherigen Ergebnisse.

9. Rohr Bildung assay

1. Das angiogenen Potenzial der MiRNA-transfizierten menschlichen Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) 36 h nach Transfektion, zu beurteilen, wie im Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5, HUVECS Zellen anstelle von A549 Zellen beschrieben.
2. Verhungern Mediumwechsel mit M199 Hunger Medien für 4 h bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
3. Reduzierte Wachstumsfaktor Basalmembran Matrix von-80 ° C und bei 4 ° C über Nacht, so dass allmählich Auftauen zur Vermeidung von Blasenbildung und Polymerisation zu entfernen.
4. Beschichten Sie vorsichtig und langsam Brunnen von einer 96-well-Platte mit 0,04 mL reduzierter Wachstumsfaktor Basalmembran Matrix, Vermeidung von Blasenbildung. Führen Sie das ganze Verfahren unter einem Laminar-Flow-Haube.
5. Füllen Sie neben Brunnen von den 96-well-Platte mit 0,1 mL PBS, Luftfeuchtigkeit und Temperatur zu erhalten.
6. Inkubieren Sie die 96-well-Platte bei 37 ° C für mindestens 20 Minuten, so dass Polymerisation der Basalmembran Extrakt erreicht wird. Nicht mehr als 1 h inkubieren.
7. Trypsinize transfizierten Mediumwechsel aus jeder Gruppe und Aufschwemmen im mittleren M199 in einer Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen/mL.
8. Die Brunnen polymerisierten Basalmembran Matrix in der 96-well-Platte mit fügen Sie 0,1 mL jedes Zellsuspension hinzu.
9. Inkubieren Sie die 96-well-Platte bei 37 ° C mit 5 % CO₂ , während der Vorbereitung von den Wachstumsfaktoren erfolgt. Vorbereitung von Wachstumsfaktoren erfolgt ebenfalls unter der Laminar-Flow-Haube.
10. Rekonstruieren Sie Wachstumsfaktoren (VEGF) 2 x die gewünschte Endkonzentration (4 ng/mL Konzentration für 2 ng/mL Endkonzentration) und 0,1 mL Wachstumsfaktor-haltigen M199 Hunger Medium auf die 0,1 mL M199 Hunger Medium mit den Zellen. Fügen Sie für VEGF-unbehandelte Brunnen 0,1 mL M199 Hunger Medium auf die 0,1 mL M199 Hunger Medium mit den Zellen.
11. Inkubieren Sie die 96-well-Platte für 6 h bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
12. Am Ende der Inkubationszeit Bilder von jedem Bohrloch mit 4 X Vergrößerung, mit einem Hellfeld-Mikroskop, verbunden mit einer Digitalkamera zu erhalten.
13. Verarbeiten von Bildern mit Software ausgestattet mit einem "Angiogenese-Analysator" Plug-in¹⁹. Verwenden Sie drei Parameter, die Anzahl der Knoten, die Anzahl der Kreuzungen und total sprießen Länge, um die Effekte der MiRNA-Behandlung auf die Angiogenese zu vergleichen.

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Ergebnisse

Ausdruck der Genanalyse mit RT-qPCR und Gel-Elektrophorese

Differentielle Ausdruck Genanalyse mit RT-qPCR zeigte signifikante Herabregulation der gezielt Gene CDK1, CDK4 und CDK6. Cdk1 und CDK4/6 erwiesen sich maßgeblich für die G2/M und G1/S Übergänge, beziehungsweise. Die durchgeführten Analysen erlaubt direkten Vergleich zwischen einzelnen MiRs und kombinatorische MiR Aktivität. Der Einsatz von SiRNA Ge...

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Diskussion

MiRNAs können agieren als zielgerichtete Therapien zur Behandlung von Krebs, erkennen die Dysregulation der Ausdruck Ebenen in erkrankten vs. normale Gewebe. Diese Studie soll MiRNAs zu bestimmen, die potenziell Zellzyklus Fortschreiten in mehreren Phasen zu stoppen. Es wurde festgestellt, dass MiR-143 und MiR-506 stoppen den Zellzyklus der Krebszellen und der vorgestellten Protokolle zielte darauf ab, die Aktivität dieser kombinatorischen MiRNA-Behandlung zu verstehen.

Die beschriebenen Met...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer	VWR	VWR40086A
96 well plate	CELLTREAT Scientific	50-607-511
96-well Microwell Plates	Thermo Scientific	12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells	ATCC	ATCC CCL-185
Agarose	VWR	0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA	Ambion	AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions	Full Moon Bio	KAS02
Bright field microscope	Microscoptics	IV-900
Bright field microscope	New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides	Full Moon Bio	ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate	Labconco	342391100
Cellquest Pro	BD bioscience	Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis
CFX96 Real Time System	BioRad	CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System	BioRad	Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Trevigen	3433-010-01
Digital Camera	AmScope	FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine	VWR	VWRL0100-0500
DNAse I	Zymo Research	E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)	BD Biosciences	356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets	Eppendrof	05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,	Fisher BioReagents	BP2818500
Ethidium bromide	Alfa acar	L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning	Corning	45000-354
FACS Calibur Flowcytometer	Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps	Fisherbrand Basix	02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator	Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)	Hospira	NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system	Benchtop lab system	BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic	ABM	MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic	ABM	MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)	Thermo Scientific	PHC9394
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Individual donors	IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen	Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10-977-015
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11-668-027
Loading dye 10X	ward's science+	470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)	Sigma Aldrich	M4530
Microscope Digital Camera	AmScope	MU130
Modfit LT	Verity Software	Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop	Thermo Scientific	NanoDrop one C
Opti-MEM	Gibco by life technologies	31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
Power UP sybr green master mix	Applied Biosystems	A25780
Propidium Iodide	MP Biochemicals LLC	IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner	Perkin elmer	ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover	Applied Biosystems	4360954
Quick-RNA Kits	Zymo Research	R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas	Sigma	R6513-50MG
ScanArray Express	PerkinElmer	Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker	Thermo Scientific	2314
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml	VWR	470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml	VWR	470225-004
TBS Buffer, 20x liquid	VWR	10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine	Thermo Scientific	ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine	Eppendrof	5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks	Thermo Scientific	12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Thermo Scientific	PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Thermo Scientific	PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates	Thermo Scientific	AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)	Thermo Scientific	AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder	Invitrogen	10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator	VWR