Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

Résumé

miRNA therapeutics ont un potentiel important dans la régulation de la progression du cancer. Démontré ici sont des approches analytiques utilisées pour l’identification de l’activité d’un traitement de miRNA combinatoire pour stopper le cycle cellulaire et l’angiogénèse.

Résumé

Cancer du poumon (LC) est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde entier. Semblable à d’autres cellules cancéreuses, une caractéristique fondamentale des cellules LC est non réglementée de la prolifération et la division cellulaire. Inhibition de la prolifération en stoppant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer, y compris les LC.

miRNA therapeutics ont émergé en tant que régulateurs des gènes post-transcriptionnels important et sont de plus en plus étudiées pour une utilisation dans le traitement du cancer. Dans des travaux récents, nous avons utilisé deux miARN, miR-143 et miR-506, pour réguler la progression du cycle cellulaire. Cellules A549 non-small cell lung cancer (NSCLC) ont été transfectées, modifications d’expression génique ont été analysées et activité apoptotique grâce au traitement a été finalement analysée. Diminution de l’expression des kinases cycline-dépendantes (CDKs) ont été détectés (CDK1, CDK4 et CDK6), et le cycle cellulaire s’arrêta aux transitions de phase G1/S et G2/M. Analyse de la voie a indiqué activité anti-angiogénique potentielle du traitement, qui dote l’approche de l’activité aux multiples facettes. Ici décrites sont les méthodes utilisées pour identifier l’activité miRNA concernant l’inhibition du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et les effets du traitement sur les cellules endothéliales par l’inhibition de l’angiogenèse. Il est à espérer que les méthodes présentées ici soutiendra les recherches futures sur miRNA thérapeutique et l’activité correspondante et que les données représentatives guidera d’autres chercheurs au cours des analyses expérimentales.

Introduction

Le cycle cellulaire est une combinaison de plusieurs événements réglementaires qui autorise la duplication de l’ADN et cellules de prolifération à travers le processus mitotique¹. Kinases cycline-dépendantes (CDKs) réglementent et promouvoir le cycle cellulaire². Parmi eux, le CDK mitotique (CDK1) et interphase cdk2 (CDK2, CDK4 et CDK6) ont un rôle essentiel dans le cycle cellulaire progression³. Protéine du rétinoblastome (Rb) est phosphorylé par la CDK4/CDK6 complexe pour permettre la progression de cycle cellulaire⁴et CDK1 activation est essentielle pour la division cellulaire avec succès⁵. Plusieurs inhibiteurs de CDK ont été développés et évalués dans des essais cliniques au cours des dernières décennies, indiquant le potentiel du ciblage cdk2 dans le traitement du cancer. En fait, trois inhibiteurs de CDK ont été approuvés pour le traitement du cancer du sein récemment^6,7,8,9,10. Ainsi, cdk2, et en particulier, la CDK1 et CDK4/6, sont d’un grand intérêt dans la régulation de la progression du cancer cell.

miARN (miRs) est petites, non codantes RNAs et régulateurs post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, régulation environ 30 % de tous les gènes humains¹¹. Leur activité est basée sur la répression traductionnelle ou dégradation des ARN messagers (ARNm)¹². Illustrant leur signification biologique, plus de 5 000 miARN ont été identifiées et une molécule de miRNA seul peut régler plusieurs gènes^11,13. Plus important encore, miRNA expression a été associée à différentes maladies et les statuts de la maladie, y compris le cancer¹³. En fait, les miARN ont été caractérisées comme oncogènes ou suppresseurs de tumeur, ayant la capacité à promouvoir ou à supprimer la tumeur développement et la progression de^14,15. L’expression relative des miARN dans les tissus malades peut réguler la progression de la maladie ; ainsi, la tradition exogène des miARN a potentiel thérapeutique.

Cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer et plus grande que 60 % de tous les cancers du poumon non à petites cellules^16,les cancers du poumon¹⁷, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 20 %¹⁸. L’utilisation de miR-143-3 p et p miR-506-3 a été récemment évaluée afin de cibler les cycles cellulaires de cellules du cancer du poumon¹¹. miR-143 et miR-506 ont des séquences qui sont complémentarité CDK1 et CDK4/CDK6, et les effets de ces deux miRs sur cellules A549 ont été analysés. Les détails expérimentaux sont présentés et discutés dans cet article. L’expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et l’apoptose ont été évalués à l’aide de différents protocoles expérimentaux et h après transfection. Nous avons utilisé des méthodes PCR (RT-qPCR) quantitatives en temps réel ainsi que l’analyse de microarray de mesurer l’expression de gènes spécifiques et séquençage de RNA de prochaine génération a servi à déterminer le gène global dysrégulation¹¹. Cette dernière méthode identifie l’abondance relative de transcription de chaque gène avec la sensibilité élevée et de la reproductibilité, tandis que des milliers de gènes peuvent être analysés d’une seule analyse expérimentale. En outre, apoptotic analyse suite à un traitement miRNA a été réalisée et est décrite ici. Bio-informatique complété l’analyse de la voie. Présentées ici sont protocoles utilisés pour l’analyse de la thérapeutique potentielle de la combinatoire miR-143 et miR-506.

L’objectif principal du présent protocole est d’identifier les effets des miARN dans les cellules, en mettant l’accent sur le cycle cellulaire. La variété des techniques présentées ici qui s’étend de l’analyse de l’expression génique prétraduction (à l’aide de qPCR) chargé d’élaborer et de nouvelles techniques d’analyse de gène au niveau des protéines, telles que l’analyse microarray. Il est à espérer que ce rapport est utile pour les chercheurs intéressés à travailler avec les miARN. Par ailleurs, la méthodologie d’analyse en cytométrie en flux du cycle cellulaire et l’apoptose des cellules est présenté.

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Protocole

1. transfection miR-143 et miR-506

Attention : Utilisez des gants en latex, lunettes de protection et un manteau de laboratoire tout en exécutant les expériences décrites. Au besoin, utiliser l’armoire de sécurité biologique avec le ventilateur d’armoire, sans bloquer les voies respiratoires ou de perturber le flux d’air laminaire. Toujours défini la vitre protectrice à la hauteur appropriée, telle que décrite par le fabricant.

1. Cellules A549 NSCLC graines dans une assiette bien T25 cm² flacon/6/96, en milieu DMEM/F12K additionné de 10 % SVF et 1 % la pénicilline-streptomycine (milieux de culture) dans une hotte de culture de tissus et incuber une nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ dans un incubateur de culture de tissus.
2. Suspendre l’imite miR-143 et/ou miR-506 ou brouiller les siARN avec agent de transfection (2,4 µg de miR ont été mélangés avec 14 µL d’agent de transfection ; voir Table des matières) dans 500 µL de médias de transfection et 1,5 mL de sérum et sans antibiotique milieu DMEM/F12K à une concentration de miRNA final de 100 nM. miRNA montant peut exiger l’optimisation différentes cellules et concentrations. Des approches appropriées incluent la transfection de cellules avec une augmentation des concentrations de miRNA (c.-à-d., 50-200 nM) et l’évaluation de la diminution d’expression des gènes d’intérêt.
3. Retirer des milieux de culture de fiole/plaque et laver une fois avec du PBS 1 x.
4. Ajouter miRNA/scramble-transfectants des complexes agent et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 6 h (taille de ballon définit le volume ajouté d’incubation).
5. Remplacer les médias avec 4 mL de milieu de culture et incuber les cellules pour 24h ou 48 h.
6. Récolter les cellules transfectées par trypsinisation, en ajoutant 1 mL de trypsine-EDTA dans chaque fiole de² cm T25, incuber pendant 5-10 min à 37 ° C et ajouter 3 mL de milieu de culture de récolter les cellules. Placez le contenu de chaque fiole dans un tube séparé, marqué 15 mL. Travailler sous une hotte de culture de tissus.
7. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
   NOTE : Attention est nécessaire au moment du retrait de surnageant, comme de l’agitation du tube peut entraîner une perte de cellules.
8. Ajouter 2 mL de solution 1 PBS x et centrifuger pendant 5 min à 751 x g.
9. Répétez les étapes 7 et 8 fois pour éliminer toute trace de médias et surnageant.
   Remarque : À ce stade, tubes d’échantillons peuvent être conservés à-80 ° C ou peuvent être utilisés immédiatement.

2. extraction de l’ARN

1. Nettoyer l’espace de travail par pulvérisation d’alcool isopropylique à 70 % et la solution de décontamination de RNAse.
2. Extraction de l’ARN doit être effectuée à l’aide d’un ARN approprié nécessaire (voir la Table des matières).
3. Retirer les tubes de-80 ° C et laissez-les décongeler. Ajouter 300 µL de tampon de lyse et pipette de haut en bas pour briser la membrane des cellules.
4. Ajouter un volume égal d’éthanol ultra purs à 100 %.
5. Bien mélanger et placer dans la colonne de séparation.
6. Centrifuger entre 11 et 16 g pendant 30 s et supprimer les intermédiaires.
7. Ajouter 400 µL de tampon et centrifugeuse pour retirer le tampon de lavage.
8. Ajouter 5 µL de la DNAse I 75 µl de la digestion de l’ADN de la mémoire tampon dans chaque échantillon et incuber pendant 15 min.
9. Laver l’échantillon avec 400 µL de tampon de préparation de RNA.
10. Laver 2 x avec tampon de lavage RNA.
11. Ajouter l’eau exempte de nucléase à la colonne, centrifugeuse, puis recueillir l’ARN.
12. Mesurer la concentration d’ARN totale avec un spectrophotomètre UV.

3. RT-qPCR

1. Avant la RT-qPCR, synthèse de l’ADNc. À la suite de quantification de RNA de concentration, placer 1 µg d’ARN dans un volume final de 20 µL de réaction pour préparer des ADNc dans un tube PCR. Toujours travailler sur un banc propre.
2. Tous les autres ingrédients nécessaires sont inclus dans le tableau 1.

Ingrédients	Quantité (µL) / (20 µL) d’échantillonnage
5 X cDNA Master mix	4
dNTPs	2
Hexamères aléatoire	1
Rehausseur de RT	1
Mélange enzymatique au verso	1
Eau libre de DNase et RNase	Qté nécessaire après l’ajout de RNA pour faire 20 µL

Tableau 1 : Matériaux pour la synthèse de cDNA d’échantillons d’ARN. Besoin de quantités d’ingrédients respectifs pour préparer un mélange maître pour un échantillon de la synthèse de cDNA.

3. Incuber dans un thermocycleur avec les conditions de température suivantes : 42 ° C pendant 30 min ; 95 ° C pendant 2 min ; 4 ° C jusqu’au prélèvement d’échantillons.
4. Utilisez immédiatement régulière PCR ou qPCR ou stocker des ADNc à-20 ° C.
5. Préparer les solutions d’apprêt avant et arrière avec DNase/RNase-libre eau à une concentration de 10 µM de solution stock amorce.
6. Préparer des mélanges maîtres distincts pour chaque gène être détectée, selon le nombre d’échantillons. Pour chaque échantillon d’ADNc (qPCR bien), la quantité de réaction est établie selon le tableau 2.

Ingrédients	Quantité (µL) / (20 µL) d’échantillonnage
Mix master SYBR	10
Primer avant - 10 μM	2
Reverse Primer - 10 μM	2
Eau libre de DNase et RNase	3
échantillon d’ADNc	3

Tableau 2 : matériaux pour des PCR quantitative en temps réel provenant d’échantillons de cDNA. Nécessaire la quantité des ingrédients pour préparer un mélange maître pour un échantillon de qPCR.

7. Placer chaque échantillon dans les puits respectifs.
8. Concevoir le schéma prédéterminé pour la plaque 96 puits qPCR. Pour chaque échantillon et gènes analysés, effectuer la réaction dans la géométrie, ou au moins en doublons.
9. Sceller la plaque 96 puits avec un couvercle optiquement transparent adhésif.
10. Accès rapide-spin la plaque pour permettre le mélange réactionnel atteindre le fond de chaque puits.
11. Exécutez RT-qPCR selon le gradient thermique suivant :
    1) 50 ° C pendant 2 min
    2) 95 ° C pendant 2 min
    3) 95 ° C pendant 15 s
    4) prendre la lecture
    5) 60 ° C pendant 1,5 min
    6) Répétez l’étape 3 pour 39 fois
12. Exécutez le gradient thermique suivant dans le prolongement de ce qui précède afin de déterminer la courbe de fusion qui indique l’amplification monoproduit.
    7) 65 ° C pour 0,31 min
    0,5 ° C/cycle
    9) lecture de plaques
    10) Répétez l’étape 8 pour 60 fois jusqu'à 95 ° C
    11) 72 ° C pendant 2 min

4. gel d’agarose pour confirmer l’amplification génique unique

1. Préparer un gel d’agarose de 1 % dans un tampon de x TBE 1.
2. Ajouter le bromure d’éthidium (EtBr) en gel chaud (~ 50 ° C) jusqu'à obtenir une concentration finale d’environ 0,2 à 0,5 µg/mL. Bromure d’éthidium se lie avec l’ADN et lui permet d’être visible sous les rayons dans un imageur de gel UV.
3. Verser chaud gel dans un plateau de gel fourni avec une boîte de gel d’électrophorèse. Fixer le peigne fourni étroitement pour puits uniformes.
4. Laisser le gel au repos et laisser refroidir à température ambiante (RT) pendant environ 30 min.
5. Lorsque le gel est solidifié, placer le gel et la barre d’état dans la boîte de gel.
6. Remplir la boîte gel avec 1 x TBE tampon jusqu'à ce que le gel soit complètement recouvert.
7. Mesurer la concentration de l’ADN de processus d’amplification PCR à l’aide d’un spectromètre UV.
8. Prendre environ 15 ng d’ADN dans un petit tube PCR, ajouter 5 µL de colorant et ajouter la quantité nécessaire d’eau exempte de nucléase afin d’obtenir un volume total de 15 µL.
9. Charger l’échelle d’ADN et des échantillons dans les puits.
10. Exécutez le gel à 100 V jusqu'à ce que la ligne de colorant est environ 75 à 80 % vers le bas le gel.
    Remarque : Veillez à ce que le gel relie un négatif à charge positive.
11. Retirer le gel et le placer dans l’imageur de gel pour visualiser l’ADN.

5. analyse de cycle de cellules

1. Semences 5 x 10⁵ cellules pour chaque échantillon dans une fiole T25 de² cm et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
2. Après 24 h et 48 h, puis de récolter les cellules par trypsinisation.
3. Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes stériles 15 mL et étiqueter correctement.
4. Centrifuger les échantillons à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x pour enlever les restes de fluides.
7. Resuspendre et briser le culot en ajoutant 200 µL de PBS glacée 1 x par pipetage.
8. Fixer les cellules en ajoutant 2 mL d’éthanol à 70 % et glacée goutte à goutte dans le tube tout en produisant des tourbillons doucement.
9. Incuber les tubes pendant 30 min à RT et placer les tubes à 4 ° C pendant 1 h.
10. Retirer les tubes de 4 ° C et centrifuger à 751 x g pendant 5 min.
11. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
12. Ajouter 500 µL de solution de 1 PBS x avec l’iodure de propidium (50 µg/mL) et de la ribonucléase A (200 µg/mL)
13. Incuber 30 min à ta tout en protégeant les échantillons de la lumière.
14. Acquisition de données sur le cytomètre en flux. Utiliser avant vs diffusion latérale (FSC vs SSC) pour sélectionner la principale population de cellules, à l’exclusion des débris dans le coin inférieur gauche des clusters intrigue et cellule densité FSC vs SSC en haut en haut-droite de la courbe de densité FSC vs SSC.
15. Analyser les données pour l’identification des populations de cellules par étape du cycle de la cellule avec un logiciel approprié.

6. dosage de l’apoptose

1. Semences 5 x 10⁵ cellules pour chaque échantillon dans une fiole T25 de² cm et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
3. Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes stériles 15 mL et étiqueter correctement.
4. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x pour enlever les restes de fluides.
7. Diluer 10 x tampon de liaison annexine V à 1 x avec glacee dH₂O.
8. Ajouter 1 mL de 1 x tampon de liaison de l’annexine V dans chaque tube d’échantillon et resuspendre doucement.
9. Suspension du lieu 96 µL des cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
10. Ajouter 1 µL de Annexin V-FITC conjugué et 12,5 µL de l’iodure de propidium (PI) dans le tube contenant la suspension cellulaire.
11. Incuber la suspension cellulaire pendant 10 min sur la glace dans l’obscurité.
12. Ajouter 250 µL glacée 1 x tampon de liaison Annexin V dans chaque tube d’échantillon pour diluer.
13. Analyser des échantillons avec cytomètre en flux immédiatement.

7. expression de la protéine par anticorps cycle cellulaire microarray

1. Semences 5 x 10⁵ cellules pour chaque échantillon dans des flacons de² cm T25 et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
3. Transfert des suspensions cellulaires aux tubes de 15 mL et étiquetez-les en conséquence.
4. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x.
7. Ajouter 150 µL de tampon de lyse additionné d’inhibiteurs de la protéase. Pipette de haut en bas doucement pour perturber les membranes cellulaires.
8. Pour éviter toute interférence de tampon de lyse, effectuer un échange tampon pour remplacer le tampon de lyse avec tampon de marquage, à l’aide de colonnes échange solvant du fabricant.
9. Quantifier les protéines totales avec un dosage BCA.
10. Prenez 70 µg d’échantillon de protéine et ajouter pour obtenir un volume final de 75 µL de tampon étiquetage.
11. Ajouter 100 µL de diméthylformamide (DMF) à 1 mg de réactif de biotine (biotine/DMF).
12. Ajouter 3 µL de la biotine/FMM dans chaque échantillon de protéine (échantillon de protéine biotinylé) et incuber pendant 2 h à température ambiante.
13. Ajouter 35 µL de réactif de stop et mélanger au vortex.
14. Incuber les échantillons à RT pendant 30 min.
15. Enlever les lames microarray du réfrigérateur pour qu’ils réchauffent à RT pendant 1 h avant utilisation.
16. Effectuer un blocage pour les liaisons non spécifiques en incubant les lames avec une solution de lait sec 3 % (en bloquant réactif fournie par le fabricant) dans une boîte de pétri avec agitation continue pendant 45 min à température ambiante.
17. Laver les lames avec de l’eau₂O ddH (sauf indication contraire, le lavage se déroule avec FD₂O).
18. Répétez l’étape de lavage ~ 10 x pour supprimer complètement la solution de blocage des surfaces de glissement. C’est important d’obtenir un arrière-plan uniform et faible.
19. Enlever l’eau excessive des surfaces slide et passez à l’étape suivante sans laisser les diapositives à sec.
20. Préparer la solution de couplage en dissolvant le lait sec 3 % dans un réactif de couplage.
21. Ajouter 6 mL de la solution de couplage et de la quantité totale de l’échantillon de protéines biotinylées préalablement préparée à l’étape 7.12.
22. Place une diapositive dans un puits de la chambre de couplage fournis par le vendeur et ajouter environ 6 mL de protéine mélange de couplage pour elle.
    Remarque : Veiller à ce que la diapositive soit totalement immergée en protéines mélange solution de couplage.
23. Couvrir la chambre de couplage et incuber pendant 2 heures au RT avec agitation continue dans un agitateur orbital.
24. Transférer les lames à une boîte de Pétri et ajouter 30 mL de 1 x tampon de lavage. Placez la boîte de pétri en agitateur orbital, agiter pendant 10 min et jetez la solution.
25. Répétez l’étape 7,24 2 x.
26. Rincer les lames avec de l’eau₂O ddH intensivement comme décrit aux étapes 7.17 et 7.18 et passez à l’étape suivante immédiatement pour éviter le séchage.
27. Ajouter 30 µL de streptavidine-Cy3 (0,5 mg/mL) dans 30 mL de tampon de détection.
28. Placez la diapositive dans une boîte de Pétri et ajouter 30 mL de tampon de détection contenant streptavidine-Cy3.
29. Incuber dans un agitateur orbital pendant 20 min avec agitation continue protégée de la lumière.
    NOTE : Cy-3 est un colorant fluorescent. Couvrir avec du papier aluminium ou fonctionnent dans des conditions sombres pour maintenir l’intensité de la fluorescence.
30. Procédez comme 7.24-7,26 et laisser la lame sécher à l’aide d’un léger courant d’air ou de la diapositive dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 1300 x g pendant 5-10 min.
31. Placez la lame dans porte-lames et recouvrir de papier d’aluminium.
32. Scan de la lame dans un scanner de microarray les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées. Dans le cas de Cy3, le pic de longueur d’onde d’excitation est à ~ 550 nm et émission maximum à ~ 570 nm.
33. Analyser les données (voir la Table des matières) pour le logiciel utilisé).

8. séquençage de RNA

1. Semences 5 x 10⁵ cellules pour chaque échantillon dans des flacons de² cm T25 et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
3. Transférer les suspensions cellulaires aux tubes de 15 mL et étiquetez-les en conséquence.
4. Extrait de RNA conformément à l’article 2, étapes 1-6.
5. Vérifier la qualité de RNA ainsi que la concentration avec une bioanalyzer. Une intégrité de RNA score (RIN) supérieur à huit et échéant histogrammes sont nécessaires pour confirmer la qualité de la RNA.
6. À partir de l’ARN total, utilisez ~ 2 µg de l’échantillon pour l’ARN (ARN messager de l’ARN total) le séquençage
7. Séquence à l’aide d’un séquenceur de prochaine génération¹¹.
8. Exécuter le parage de qualité et carte avec un génome de référence de FASTQ les fichiers générés à partir de l’ARN séquençage machine¹¹.
9. Télécharger des fichiers FASTQ et cru lire les données de comptage à la banque de gènes, suivant les instructions de la < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> site.
   Remarque : Voir numéro SRP133420 pour les résultats antérieurs.

9. test de formation tube

1. Évaluer le potentiel angiogénique de veine ombilicale humaine transfectées miRNA cellules endothéliales (HUVEC) 36 h après la transfection, tel que décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5, à l’aide de cellules HUVEC au lieu de cellules A549.
2. Affamer HUVECs avec médias famine M199 pendant 4 h à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
3. Supprimer le facteur de croissance réduite matrice de la membrane basale de-80 ° C et conserver à 4 ° C durant la nuit, permettant à un dégel progressif afin d’éviter la polymérisation et la formation de bulles.
4. Soigneusement et lentement recouvrir le puits d’une plaque 96 puits en 0,04 mL de matrice de membrane basale de facteur de croissance réduite, en évitant la formation de bulles. Effectuer l’ensemble de la procédure sous une hotte à flux laminaire.
5. Remplir les puits adjacents de la plaque 96 puits avec 0,1 mL de PBS, afin de maintenir l’humidité et protéger la température.
6. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C pendant au moins 20 min pour que la polymérisation de l’extrait de la membrane basale est atteint. Pas incuber pendant plus de 1 heure.
7. Trypsinize transfectées HUVECs de chaque groupe et remettre en suspension en milieu M199 à une concentration de 1 x 10⁵ cellules/mL.
8. Ajouter 0,1 mL de chaque suspension de cellules dans les puits contenant la matrice des membranes basales polymérisé dans la plaque 96 puits.
9. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant que la préparation des facteurs de croissance se déroule. Préparation des facteurs de croissance se fait sous la hotte à flux laminaire.
10. Reconstituer les facteurs de croissance (VEGF) à 2 x la concentration finale souhaitée (concentration de 4 ng/mL pour la concentration finale de 2 ng/mL) et ajouter 0,1 mL de milieu de famine M199 contenant du facteur de croissance sur le dessus de la 0,1 mL de milieu de famine M199 avec les cellules. Pour les puits non traitées VEGF, ajouter 0,1 mL de milieu famine M199 sur le dessus de la 0,1 mL de milieu de famine M199 avec les cellules.
11. Incuber la plaque 96 puits pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
12. À la fin de la période d’incubation, obtenir des images de chaque puits avec un grossissement x 4, à l’aide d’un microscope à fond clair connecté avec un appareil photo numérique.
13. Traiter des images avec le logiciel équipé d’un plug-in « angiogenèse analyzer »¹⁹. Trois paramètres, le nombre de nœuds, le nombre de jonctions et longueur totale sprout, permet de comparer les effets du traitement miRNA sur l’angiogenèse.

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Résultats

Analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-qPCR et gel d’électrophorèse

Analyse de l’expression différentielle des gènes à l’aide de la RT-qPCR a démontré une diminution significative des gènes ciblés CDK1, CDK4 et CDK6. CDK1 et CDK4/6 ont été montré pour être un instrument pour le G2/M et les transitions G1/S, respectivement. L’analyse effectuée a permis de comparaison directe...

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Discussion

miARN peut fonctionner comme des thérapies ciblées pour le traitement du cancer, reconnaissant le dérèglement des niveaux d’expression dans malades vs les tissus normaux. Cette étude visait à déterminer les miARN qui potentiellement stopper la progression du cycle cellulaire au cours de plusieurs étapes. Il a été identifié que miR-143 et miR-506 de faire cesser le cycle cellulaire des cellules cancéreuses et les protocoles présentés visant à comprendre l’activité de ce traitement combinatoire miRNA.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer	VWR	VWR40086A
96 well plate	CELLTREAT Scientific	50-607-511
96-well Microwell Plates	Thermo Scientific	12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells	ATCC	ATCC CCL-185
Agarose	VWR	0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA	Ambion	AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions	Full Moon Bio	KAS02
Bright field microscope	Microscoptics	IV-900
Bright field microscope	New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides	Full Moon Bio	ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate	Labconco	342391100
Cellquest Pro	BD bioscience	Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis
CFX96 Real Time System	BioRad	CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System	BioRad	Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Trevigen	3433-010-01
Digital Camera	AmScope	FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine	VWR	VWRL0100-0500
DNAse I	Zymo Research	E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)	BD Biosciences	356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets	Eppendrof	05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,	Fisher BioReagents	BP2818500
Ethidium bromide	Alfa acar	L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning	Corning	45000-354
FACS Calibur Flowcytometer	Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps	Fisherbrand Basix	02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator	Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)	Hospira	NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system	Benchtop lab system	BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic	ABM	MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic	ABM	MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)	Thermo Scientific	PHC9394
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Individual donors	IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen	Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10-977-015
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11-668-027
Loading dye 10X	ward's science+	470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)	Sigma Aldrich	M4530
Microscope Digital Camera	AmScope	MU130
Modfit LT	Verity Software	Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop	Thermo Scientific	NanoDrop one C
Opti-MEM	Gibco by life technologies	31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
Power UP sybr green master mix	Applied Biosystems	A25780
Propidium Iodide	MP Biochemicals LLC	IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner	Perkin elmer	ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover	Applied Biosystems	4360954
Quick-RNA Kits	Zymo Research	R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas	Sigma	R6513-50MG
ScanArray Express	PerkinElmer	Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker	Thermo Scientific	2314
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml	VWR	470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml	VWR	470225-004
TBS Buffer, 20x liquid	VWR	10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine	Thermo Scientific	ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine	Eppendrof	5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks	Thermo Scientific	12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Thermo Scientific	PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Thermo Scientific	PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates	Thermo Scientific	AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)	Thermo Scientific	AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder	Invitrogen	10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator	VWR