JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

Abstract

סרטן הריאות (LC) הוא הגורם המוביל למוות מסרטן ברחבי העולם. בדומה לתאים אחרים סרטן, מאפיין מהותי של תאים LC היא התפשטות ללא פיקוח חלוקת התא. עיכוב של התפשטות בעת עצירת התקדמות מחזור התא הוכח להיות גישה מבטיחה לטיפול בסרטן, כולל LC.

miRNA הרפוי הופיעו כמבקרי ג'ין post-transcriptional חשוב, הם יותר ויותר נחקר לשימוש בטיפול בסרטן. העבודה האחרונה, אנחנו מנוצל miRNAs שני, 143-מיר ומיר-506, כדי לווסת את התקדמות מחזור התא. תאים סרטניים (NSCLC) ריאות שאינם קטנים התא A549 היו transfected שינויים בביטוי הגנים נותחו, פעילות אפופטוטיים להיפגע עקב הטיפול ניתחנו את סוף סוף. Downregulation של kinases תלויי-cyclin (CDKs) אותרו (קרי, CDK1, CDK4 ו CDK6), והפסיקה מחזור התא על המעברים שלב G1/S ו G2/M. ניתוח מסלול הצביעו על פעילות אנטי-אנגיוגנטי פוטנציאלי של הטיפול, אשר מעניק את הגישה עם רבת פעילות. המתוארים להלן למתודולוגיות המשמש לזיהוי פעילות miRNA בדבר עיכוב מחזור התא, אינדוקציה של אפופטוזיס, ואת ההשפעות של טיפול בתאי אנדותל על ידי עיכוב של אנגיוגנזה. יש לקוות כי השיטות המובאות כאן יתמוך למחקר עתידי על miRNA הרפוי ובפעילות המתאים, כי נציג הנתונים ינחה חוקרים אחרים במהלך ניתוח ניסיוני.

Introduction

מחזור התא הוא שילוב של מספר אירועים רגולטוריות לאפשר כפילות של התפשטות ה-DNA של תאים דרך תהליך mitotic1. תלויי-cyclin kinases (CDKs) להסדיר ולקדם את מחזור התא2. ביניהם, mitotic CDK (CDK1) CDKs לאטמוספרה (CDK2, CDK4 ו CDK6) יש תפקיד מרכזי מחזור התא התקדמות3. חלבון רטינובלסטומה (Rb) הוא phosphorylated על ידי CDK4/CDK6 מורכבים כדי לאפשר התקדמות מחזור התא4, CDK1 הפעלה הוא חיוני עבור חלוקת התא מוצלחת5. יש רבים CDK מעכבי פותחה, הערכה בניסויים קליניים לאורך העשורים האחרונים, המציין את הפוטנציאל של פילוח CDKs בטיפול בסרטן. למעשה, שלושה מעכבי CDK אושרו לטיפול בסרטן השד לאחרונה6,7,8,9,10. לפיכך, CDKs, בפרט, CDK1 ו- CDK4/6, הם עניין רב בוויסות התקדמות תאי הסרטן.

miRNAs (מירס) הם קטנים, ללא קידוד RNAs הרגולטורים post-transcriptional של ביטוי גנים, ויסות כ-30% גנים אנושיים כל11. הפעילות שלהם מבוסס על הדחקה translational או השפלה של RNAs שליח (mRNAs)12. המחשה חשיבות הביולוגי שלהם, יותר מ-5,000 miRNAs זוהו, מולקולה בודדת miRNA ניתן לווסת גנים מרובים11,13. חשוב מכך, miRNA הביטוי נמצא קשור מחלות שונות ומצבים המחלה, כולל סרטן13. למעשה, miRNAs כבר שאפיינו גם oncogenic או מדכאי הגידול, להיות מסוגל לקדם או לדכא גידול פיתוח והתקדמות14,15. הביטוי יחסי תפקיד miRNAs בהתפתחות לרקמות החולות של יכול לווסת את התקדמות המחלה; לפיכך, משלוח אקסוגני של miRNAs יש הפוטנציאל הטיפולי.

סרטן הריאות הוא הגורם המוביל של מקרי מוות מסרטן, גדול יותר מאשר 60% של כל ממאירות ריאות שאינם קטנים התא ריאות סרטן16,17, עם שיעור הישרדות 5 שנים של פחות מ-20%18. השימוש של מיר-143-3 p ומיר-506-3 p הוערך לאחרונה הכוונת את מחזורי תאים תאים של סרטן ריאות11. 143-מיר ומיר-506 יש רצפי כי הם משלימים את החסר CDK1, CDK4/CDK6, ההשפעות של מירס שני אלה על תאים A549 נותחו. הפרטים ניסיוניים שהוצגו, המתוארים במסמך זה. ביטוי גנים, התקדמות מחזור התא, אפופטוזיס הוערכו באמצעות עיצובים מוטוריים שונים ו- timepoints בעקבות תרביות תאים. השתמשנו בשיטות PCR (RT-qPCR) כמותית בזמן אמת יחד עם ניתוח microarray למדוד ביטוי גנים ספציפיים, הדור הבא רצפי RNA שימשו לקביעת הכללית ג'ין dysregulation11. השיטה השנייה מזהה שפע יחסי התעתיק של ג'ין כל עם רגישות גבוהה, הפארמצבטית, בעוד אלפי גנים ניתן לנתח מתוך ניתוח ניסיוני יחיד. בנוסף, ניתוח אפופטוטיים להיפגע עקב טיפול miRNA בוצעה, מתואר כאן. ביואינפורמטיקה מצורפים ניתוח מסלול. המוצג כאן הפרוטוקולים משמשים לניתוח של טיפולית פוטנציאל של 143-מיר קומבינטורית, מיר-506.

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה הוא לזהות את ההשפעות של miRNAs בתאים, עם דגש על מחזור התא. מגוון רחב של טכניקות המובאת כאן span החל מפענוח הביטוי מראש (באמצעות qPCR) לפרט ותרגום הרומן טכניקות מפענוח ברמת חלבון, כגון ניתוח microarray. יש לקוות כי דו ח זה שימושי עבור חוקרים מעונינת לעבוד עם miRNAs. בנוסף, מוצגת מתודולוגיה ניתוח תזרים cytometric של מחזור התא, אפופטוזיס של תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תרביות תאים מיר-143 ו miR-506

התראה: השתמש כפפות גומי, מגן משקפיים, מעיל מעבדה בעת ביצוע הניסויים המתוארים. במידת הצורך, השתמש הקבינט אבטחה עם המאוורר הקבינט על, מבלי לחסום את דרכי הנשימה או להפריע את זרימת האוויר למינריות. תמיד להגדיר חלון זכוכית שיגן על הגובה המתאים, כפי שתואר על ידי היצרן.

  1. הזרע התאים NSCLC A549 בצלחת T25 ס מ2 הבקבוק/6/96 טוב בתקשורת DMEM/F12K בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (תרבות מדיה) בשכונה תרביות רקמה, דגירה בין לילה ב 37 ° C עם 5% CO2 מגשים תרביות רקמה.
  2. להשעות מחקה 143-מיר ו/או מיר-506, או לטרוף siRNA עם סוכן transfecting (2.4 µg של מיר, מעורבים עם 14 µL של סוכן transfecting; ראה טבלה של חומרים) ב- µL 500 תקנים ומדיה 1.5 מ של סרום ושל תרופתיים התקשורת DMEM/F12K ריכוז miRNA הסופי של 100 ננומטר. כמות miRNA עשויים לדרוש אופטימיזציה על תאים שונים וריכוזי. גישות מתאימות כוללות תרביות של תאים תאים עם הגדלת ריכוזים של miRNA (קרי: 50-200 ננומטר) והערכה של ביטוי downregulation של הגנים של עניין.
  3. הסר תרבות המדיה של הבקבוק/צלחת, לשטוף פעם עם 1 x PBS.
  4. להוסיף miRNA/לטרוף-transfecting מתחמי הסוכן, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 6-אייץ ' (גודל הבקבוק מגדיר האחסון הדגירה שנוספו).
  5. החלף את המדיה 4 מ"ל של תרבות התקשורת, דגירה תאים עבור 24 שעות ביממה ו/או 48 שעות.
  6. קציר transfected תאים על-ידי trypsinization, על-ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין-EDTA את הבקבוק2 ס מ לכל T25, תקופת דגירה של 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף 3 מ"ל של תרבות התקשורת כדי לקצור את התאים. מקם את התוכן של כל הבקבוק לתוך צינור נפרדים, מסומן, 15 מ"ל. לעבוד בשכונה תרביות רקמה.
  7. צנטריפוגה ב x 751 g למשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
    הערה: נדרש משנה זהירות במהלך הסרת supernatant, כמו עצבנות של הצינור עלול לגרום לאובדן של תאים.
  8. להוסיף 2 מ"ל של 1 x PBS, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 751 g...
  9. חזור על שלבים 7 ו-8 פעם להסיר את עקבות של התקשורת ואת תגובת שיקוע.
    הערה: בשלב זה, צינורות מדגם שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס או יכול לשמש באופן מיידי.

2. RNA החילוץ

  1. לנקות את אזור העבודה ע י ריסוס עם אלכוהול איזופרופיל 70%, RNAse טיהור פתרון.
  2. החילוץ-RNA צריכה להתבצע באמצעות של RNA המתאים קיט (ראה טבלה של חומרים).
  3. להסיר את הצינורות-80 ° C ולאפשר להם להפשיר. הוסף µL 300 של פירוק מאגר, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את קרום התא.
  4. הוסף אמצעי שווה של אתנול אולטרה טהור 100%.
  5. מערבבים היטב והניחו להפריד עמודה.
  6. צנטריפוגה בין 11 ל 16 x g עבור 30 s והסר הזרימה דרך.
  7. להוסיף 400 µL לרחוץ את המאגר, צנטריפוגה כדי להסיר את המאגר.
  8. להוסיף 5 µL של DNAse אני עם 75 µL של ה-DNA עיכול מאגר בכל מדגם, תקופת דגירה של 15 דקות.
  9. לשטוף את הדגימה. עם 400 µL מאגר ההכנה RNA.
  10. לשטוף 2 x עם מאגר שטיפת RNA.
  11. להוסיף מים נטולי נוקלאז העמודה, צנטריפוגה, ואז לאסוף את הרנ א.
  12. למדוד ריכוז ה-RNA מוחלט עם ספקטרופוטומטרים UV.

3. RT-qPCR

  1. לפני RT-qPCR, לסנתז את cDNA. מיד לאחר כימות ריכוז ה-RNA, מקום 1 µg של RNA אמצעי אחסון 20 µL הסופי של תגובה להכין cDNA צינור ה-PCR. תמיד לעבוד על ספסל נקי.
  2. כל המרכיבים הדרושים אחרים הכלולים בטבלה 1.
מרכיביםכמות (µL) / לטעום (20 µL)
מאסטר X cDNA 5 לערבב4
dNTPs2
Hexamers אקראי1
RT משפר1
אנזים פונה מיקס1
DNase ומים חינם RNaseכמות נדרשת לאחר הוספת ה-RNA כדי להפוך 20 µL

טבלה 1: חומרי cDNA סינתזה מדגימות רנ א. נדרש כמויות החומרים המתאימים כדי להכין תערובת בסיס דוגמא אחת של cDNA סינתזה.

  1. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי עם התנאים הבאים טמפרטורה: 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 4 ° C עד אוסף של דוגמאות.
  2. השתמש באופן מיידי ב- PCR רגיל או qPCR או לאחסן cDNA ב-20 ° C.
  3. להכין בפתרונות פריימר ואחורה DNase/RNase ללא מים-ריכוז של 10 מיקרומטר מהפתרון פריימר מניות.
  4. להכין נפרד מאסטר תערובות כל הגן להתגלות, לפי מספר דוגמאות. עבור כל דגימה cDNA (qPCR טוב), הכמות התגובה מוכן לפי טבלה 2.
מרכיביםכמות (µL) / לטעום (20 µL)
מיקס מאסטר SYBR10
פריימר לפנים - 10 μM2
פריימר הפוכה - 10 μM2
DNase ומים חינם RNase3
לדוגמה cDNA3

בטבלה 2: חומרים עבור PCR כמותי בזמן אמת מדגימות cDNA. נדרשת כמות החומרים להכנת תערובת בסיס דוגמא אחת עבור qPCR.

  1. מקם כל מדגם הבארות בהתאמה.
  2. עיצוב פריסת הדגימה הצלחת 96 qPCR טוב. עבור כל דגימה ו ג'ין שנותחה, לבצע את התגובה ב- triplicates, או לפחות בתוך כפילויות.
  3. חותם את הצלחת היטב 96 עם מכסה שטיחות ברור דבק.
  4. מהיר-ספין הלוח כדי לאפשר את תערובת התגובה להגיע התחתון של כל טוב.
  5. הפעל RT-qPCR על פי מעבר הצבע תרמי הבאים:
    1) 50 º C למשך 2 דקות
    2) 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות
    3) 95 ° C 15 s
    4) לקחת את הקריאה
    5) 60 ° C עבור 1.5 דקות
    6) חזור על שלב 3 עבור 39 פעמים
  6. להפעיל מעבר הצבע תרמי הבאים המשכו של האמור לעיל כדי לקבוע את עקומת ההיתוך המציינת הגברה במוצר אחד.
    7) 65 מעלות צלזיוס למשך דקות 0.31
    8) +0.5 ° C/מחזור
    9) הצלחת לקרוא
    10) חוזר את שלב 8 פעמים 60 עד 95 ° C
    11) 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות

4. Agarose בג'ל כדי לאשר הגברה גנטי יחיד

  1. להכין.1% ג'ל agarose במאגר x TBE 1.
  2. להוסיף אתידיום ברומיד (EtBr) בג'ל חם (~ 50 ° C) עד להשגת ריכוז סופי של-0.2-0.5 µg/mL. EtBR נקשר עם ה-DNA ומאפשרת ניתן לאבחן תחת אולטרא סגול ב- imager ג'ל.
  3. יוצקים חם ג'ל מגש ג'ל שסופק עם קופסת ג'ל אלקטרופורזה. לצרף את המסרק שסופקו בחוזקה. למעיינות אחיד.
  4. לאפשר את הג'ל לנוח וקריר לטמפרטורת החדר (RT) ~ 30 דקות.
  5. כאשר הג'ל הוא פני השטח למוצק, למקם את ג'ל ומגש בתיבת ג'ל.
  6. למלא את תיבת ג'ל עם מאגר x TBE 1 עד הג'ל מכוסה לגמרי.
  7. למדוד את הריכוז של ה-DNA מתהליך הגברה PCR באמצעות ספקטרומטר של UV.
  8. קח ~ 15 ng של ה-DNA בשפופרת קטנה PCR, הוסף 5 µL של צבע, והוסף את הכמות הנדרשת של נוקלאז ללא מים כדי להשיג את הנפח הכולל 15 µL.
  9. לטעון את סולם הדנ א ודוגמאות לתוך הבארות.
  10. להפעיל את הג'ל ב- 100 וולט עד קו צבע הוא כ 75% - 80% למטה הג'ל.
    הערה: ודא שהג'ל מקשר בין שלילי מטען חיובי.
  11. להסיר את הג'ל ולמקם אותו םלצה ג'ל כדי להמחיש את הדנ א.

5. מחזור התא ניתוח

  1. זרע 5 x 105 תאים עבור כל דגימה בבקבוקון2 ס מ T25 ולבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
  2. לאחר 24 שעות, 48 שעות, ואז לקצור את התאים על ידי trypsinization.
  3. להעביר את המתלים תא צינורות סטרילי 15 מ"ל, לתייג אותם כראוי.
  4. צנטריפוגה דגימות ב x 751 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. להוסיף 2 מ של PBS קר כקרח 1 x, מערבולת, צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. חזור על השלב כביסה עם PBS 1 x כדי להסיר מדיה שיורית.
  7. Resuspend ולשבור את צניפה על-ידי הוספת µL 200 ל- PBS קר כקרח 1 x על-ידי pipetting.
  8. לתקן את התאים על-ידי הוספת 2 מ"ל אתנול 70% קר כקרח dropwise הצינור תוך vortexing בעדינות.
  9. דגירה צינורות במשך 30 דקות ב- RT ולמקם את הצינורות ב 4 ° C עבור 1 h.
  10. הסר צינורות 4 ° C ו צנטריפוגה ב 751 x g למשך 5 דקות.
  11. להוסיף 2 מ של PBS קר כקרח 1 x, מערבולת, צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  12. להוסיף 500 µL ל- PBS x 1 עם propidium יודיד (50 µg/mL), ribonuclease (200 µg/mL)
  13. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT תוך הגנה על הדגימות מפני אור.
  14. רוכשים נתונים על זרימה cytometer. השתמש קדימה לעומת הצד פיזור (FSC לעומת האס) כדי לבחור את האוכלוסייה העיקרית של תאים, למעט פסולת שבפינה השמאלית התחתונה של FSC לעומת האס צפיפות האשכולות העלילה ותא בראש הדף-צד ימין של העלילה צפיפות FSC לעומת האס.
  15. ניתוח נתונים עבור זיהוי של אוכלוסיות תאים לכל מחזור התא הבמה עם תוכנה מתאימה.

6. אפופטוזיס assay

  1. זרע 5 x 105 תאים עבור כל דגימה בבקבוקון2 ס מ T25 ולבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
  2. לאחר 24 שעות, 48 שעות, לקצור את התאים על ידי trypsinization.
  3. להעביר את המתלים תא צינורות סטרילי 15 מ"ל, לתייג אותם כראוי.
  4. צנטריפוגה ב x 751 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. להוסיף 2 מ של PBS קר כקרח 1 x, מערבולת, צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. חזור על השלב כביסה עם PBS 1 x כדי להסיר מדיה שיורית.
  7. לדלל 10 x מאגר איגוד Annexin V ל- x 1 עם קרח dH2O.
  8. להוסיף 1 מ"ל של 1 x מאגר Annexin V מחייב כל שפופרת הדגימה, resuspend בעדינות.
  9. מקום 96 µL של הבולם תא צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  10. להוסיף הצינור המכיל התליה תא µL 1 של המספר המשלים Annexin V-FITC ו- 12.5 µL של propidium יודיד (PI).
  11. דגירה התליה תא 10 דקות על קרח בחושך.
  12. להוסיף 250 µL קר כקרח 1 x Annexin V איגוד מאגר כל שפופרת הדגימה כדי לדלל.
  13. לנתח דגימות עם זרימה cytometer מיד.

7. חלבון ביטוי על ידי נוגדנים מחזור התא microarray

  1. זרע 5 x 105 תאים לכל אחד לטעום ב- T25 ס מ2 מבחנות ולבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
  2. לאחר 24 שעות, 48 שעות, קציר תאים על-ידי trypsinization.
  3. תא המתלים להעביר צינורות 15 מ"ל, לתייג אותם בהתאם.
  4. צנטריפוגה ב x 751 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. להוסיף 2 מ של PBS קר כקרח 1 x, מערבולת, צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. חזור על השלב כביסה עם 1 x PBS.
  7. להוסיף 150 µL מאגר פירוק בתוספת מעכבי פרוטאז. Pipet למעלה ולמטה בעדינות כדי לשבש את קרום התא.
  8. כדי למנוע כל הפרעה מאגר של פירוק, לבצע החלפת המאגר כדי להחליף את המאגר פירוק מאגר תיוג, תוך שימוש בעמודות החלפת ממס של היצרן.
  9. לכמת את החלבון הכולל עם וזמינותו BCA.
  10. לקחת µg 70 מדגם חלבונים ולהוסיף מאגר תיוג כדי להשיג נפח סופי של 75 µL.
  11. להוסיף 100 µL של dimethylformamide (DMF) 1 מ ג של ביוטין ריאגנט (ביוטין/DMF).
  12. להוסיף 3 µL של ביוטין/DMF כל מדגם חלבון (חלבון biotinylated לדוגמה), תקופת דגירה של 2 h-RT.
  13. להוסיף µL 35 של ריאגנט stop ושילוב באמצעות vortexing.
  14. דגירה בדגימות ב RT למשך 30 דקות.
  15. הסר את השקופיות microarray מהמקרר כך הם מחממים ל RT לשעה לפני השימוש.
  16. לבצע חסימת לכריכה שאינם ספציפיים על-ידי המקננת השקופיות עם חלב יבש 3% פתרון (ריאגנט חסימה המסופקים על ידי היצרן) בצלחת פטרי ברעידות רציף למשך 45 דקות ב- RT.
  17. לשטוף את השקופיות במים2O ddH (אלא אם צוין אחרת, כביסה לוקח מקום ב- ddH2O).
  18. חזור על השלב כביסה ~ 10 x כדי להסיר לחלוטין את הפתרון חסימה של משטחים שקופיות. זה חשוב להשיג רקע אחיד ונמוך.
  19. הסר מים מופרזת משטחים שקופית והמשך לשלב הבא בלי לתת את השקופיות יבש.
  20. להכין פתרון צימוד על ידי המסת חלב יבש 3% בריאגנט צימוד.
  21. להוסיף 6 מ של הפתרון צימוד וכדי כמות מלאה של המדגם חלבון biotinylated בעבר מוכן מהשלב 7.12.
  22. שקופית אחת את המקום היטב אחד של התא צימוד שסופקו על-ידי הספק ולהוסיף ~ 6 מ"ל של חלבון צימוד לערבב את זה.
    הערה: ודא כי השקופית לגמרי שקוע חלבון צימוד תמהיל פתרון.
  23. מכסה תא צימוד, תקופת דגירה של 2 h ב- RT עם עצבנות מתמדת שייקר מסלולית.
  24. להעביר את השקופיות צלחת פטרי, להוסיף 30 מ של 1 x שטיפה מאגר. מניחים על צלחת פטרי תפקודי לב / נשימה, לנענע 10 דקות, ולמחוק את הפתרון.
  25. חזור על שלב 7.24 2 x.
  26. לשטוף את השקופיות במים2O ddH בהרחבה כפי שתואר בשלבים 7.17 ו- 7.18 והמשך לשלב הבא מיד כדי למנוע ייבוש.
  27. להוסיף 30 µL של Cy3-streptavidin (0.5 מ"ג/מ"ל) ב- 30 מ של מאגר זיהוי.
  28. מקם את השקופית בצלוחית ולהוסיף 30 מ של גילוי מאגר המכיל Cy3-streptavidin.
  29. דגירה שייקר מסלולית כעשרים דקות עם רציף רועד מוגנים מפני אור.
    הערה: Cy-3 הוא הפלורסנט. לכסות ברדיד אלומיניום או לפעול בתנאים כהה כדי לשמור על עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
  30. בצע שלבים 7.24-7.26 ולאפשר את השקופית לייבש בעזרת זרם עדין של אוויר או הנחת השקופית צינור חרוטי 50 מ ל, צנטריפוגה ב 1300 x g למשך 5-10 דקות.
  31. מקם את השקופית מחזיק שקופיות ומכסים ברדיד אלומיניום.
  32. סרוק את השקופית סורק microarray עם אורכי הגל המתאימים עירור, פליטה. במקרה של Cy3, הפסגה אורך גל עירור היא בשיא ~ 550 ננומטר, פליטה-~ 570 ננומטר.
  33. לנתח את הנתונים (ראה טבלה של חומרים) עבור התוכנה ששימשה).

8. רצפי הרנ א

  1. זרע 5 x 105 תאים לכל אחד לטעום ב- T25 ס מ2 מבחנות ולבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
  2. לאחר 24 שעות, 48 שעות, לקצור את התאים על ידי trypsinization.
  3. להעביר את המתלים תא צינורות 15 מ"ל, לתייג אותם בהתאם.
  4. תמצית ה-RNA לפי סעיף 2, השלבים 1-6.
  5. בדוק RNA איכות, כמו גם ריכוז עם bioanalyzer. RNA ניקוד (RIN) מעל שמונה ובטחונו המתאים היסטוגרמות נחוצים לאשר את איכות ה-RNA.
  6. מ- RNA הכולל, להשתמש µg ~ 2 המדגם RNA רצף (RNA שליח מן הרנ א סה כ)
  7. ברצף של הדור הבא (sequencer)11.
  8. בניהול איכות זמירה, מפה עם גנום הפניה מקבצים FASTQ המופקים את הרנ א רצף מכונת11.
  9. להעלות קבצים FASTQ וקריאה raw הנתונים הרוזן Genebank, ביצוע ההוראות של < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> באתר.
    הערה: ראה מספר גישה SRP133420 עבור תוצאות קודמות.

9. צינור היווצרות assay

  1. להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של miRNA-transfected יפתור תאי אנדותל (HUVECs) 36 h שלאחר תרביות תאים, כמתואר בסעיף 1, צעדים 1-5, באמצעות תאים HUVEC במקום A549 תאים.
  2. ברעב HUVECs עם M199 מדיה רעב במשך 4 שעות ב 37 ° C עם 5% CO2.
  3. הסר מטריצה של קרום המרתף פקטורי גדילה מופחת מ-80 מעלות צלזיוס ו החנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ומאפשר מפשיר הדרגתית למנוע היווצרות בועה הפילמור.
  4. לאט ובזהירות מעיל בארות של צלחת טוב 96 עם 0.04 מ של מטריצה קרום המרתף מופחת גורם גדילה, הימנעות היווצרות בועה. בצע את ההליך כולו תחת תא למינארי.
  5. למלא הבארות הסמוכים של צלחת טוב 96 0.1 מ"ל של PBS כדי לשמור על לחות ולשמר את הטמפרטורה.
  6. דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 20 דקות כך פלמור של קרום המרתף תמצית מושגת. לא תקופת דגירה של יותר מ 1 h.
  7. Trypsinize HUVECs transfected מכל קבוצה, resuspend ב M199 בינוני-ריכוז של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל....
  8. להוסיף 0.1 מ"ל של השעיה תא כל הבארות המכיל polymerized קרום המרתף מטריקס בצלחת טוב 96.
  9. דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 ° C עם 5% CO2 בזמן ההכנה של גורמי גדילה מתקיים. הכנה של גורמי גדילה מתקיים גם מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית.
  10. לשקם גורמי גדילה (VEGF) 2 x הריכוז הסופי הרצוי (4 ננוגרם למ"ל ריכוז 2 ריכוז סופי ng/mL) ולהוסיף 0.1 מ"ל המכיל גורם הגדילה M199 רעב בינוני מעל mL 0.1 M199 רעב בינוני עם התאים. שאינם מטופלים VEGF וולס, הוסיפו 0.1 מ"ל M199 רעב בינוני מעל mL 0.1 M199 רעב בינוני עם התאים.
  11. דגירה את הצלחת היטב 96 עבור 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO2.
  12. בסוף תקופת הדגירה, להשיג כמה תמונות של כל טוב עם 4 x הגדלה, באמצעות מיקרוסקופ brightfield מחובר באמצעות מצלמה דיגיטלית.
  13. לעיבוד תמונות בעזרת תוכנת מצויד עם יישום plug-in "מנתח אנגיוגנזה"19. השתמש שלושה פרמטרים, מספר הצמתים, מספר צמתים, וכן נבט סה כ אורך, כדי להשוות את ההשפעות של טיפול miRNA על אנגיוגנזה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ניתוח ביטוי גנטי באמצעות RT-qPCR וג'ל אלקטרופורזה

ניתוח ביטוי גנטי דיפרנציאלי באמצעות RT-qPCR הפגינו משמעותית downregulation של גנים יישוב CDK1, CDK4 ו- CDK6. CDK1 ו- CDK4/6 הראו להם להיות אינסטרומנטלי G2/M ומעברים G1/S, בהתאמה. בביצוע ניתוח מותר השוואה ישירה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

miRNAs יכול לפעול טיפולים ממוקדים לטיפול בסרטן, לזהות את dysregulation של רמות ביטוי נגועים לעומת רקמות רגילה. מחקר זה שמטרתה לקבוע miRNAs זה פוטנציאל לעצור את מחזור התא התקדמות בשלבים מרובים. זה זוהה 143-מיר ומיר-506 לעצור את מחזור התא של תאים סרטניים, ואת הפרוטוקולים הציג שמטרתם להבין את הפעילות של טיפו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים, הייתי רוצה להכיר את ג'ון Caskey באוניברסיטת לואיזיאנה סטייט לסיוע שלו על ניתוח מסלול של הנתונים רצפי RNA, של אוניברסיטת טקסס Southwestern Medical Center, מק'דרמט הבא הדור רצף הליבה המרכזית עבור מבצע את רצפי RNA וניתוח נתונים. מחקר זה נתמך על ידי המכללה לרוקחות, אוניברסיטת לואיזיאנה מונרו סטארט-אפ מימון במכון הלאומי של בריאות (NIH) דרך המכון הלאומי של כללי רפואי מדעי מענקים 5 P20 GM103424-15, GM103424 P20 3-15S1....

Acknowledgements

אין ניגודי עניינים מוצהרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
-80 °C FreezerVWRVWR40086A
96 well plateCELLTREAT Scientific 50-607-511
96-well Microwell Plates  Thermo Scientific12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer CellsATCCATCC CCL-185
AgaroseVWR0710-25G
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNAAmbionAM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 ReactionsFull Moon BioKAS02
Bright field microscope  Microscoptics IV-900
Bright field microscope  New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 SlidesFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceSteps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time SystemBioRadCFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging SystemBioRadChemidoc Touch Imaging System
CO2 IncubatorThermo ScientificHERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixTrevigen3433-010-01
Digital CameraAmScope FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-GlutamineVWRVWRL0100-0500
DNAse IZymo ResearchE1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)BD Biosciences356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack SetsEppendrof05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagentsBP2818500
Ethidium bromideAlfa acarL07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, CorningCorning45000-354
FACS Calibur FlowcytometerBecton Dickinson
Fetal Bovine Serum - PremiumAntlanta BiologicalsS11150
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher Scientific10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap CapsFisherbrand Basix02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubatorThermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis systemBenchtop lab systemBT102
hsa-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)Thermo ScientificPHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)Individual donorsIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenResults: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10-977-015
Lipofectamine 2000 Invitrogen11-668-027
Loading dye 10Xward's science+470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)Sigma AldrichM4530
Microscope Digital CameraAmScope MU130
Modfit LTVerity SoftwareStep 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Power UP sybr green master mixApplied BiosystemsA25780
Propidium IodideMP Biochemicals LLCIC19545825
Proscanarray HT Microarray scannerPerkin elmerASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive coverApplied Biosystems4360954
Quick-RNA KitsZymo ResearchR1055
Ribonuclease A from Bovine pancreasSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerStep 7.33: Microarray analysis software
ShakerThermo Scientific2314
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15mlVWR470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50mlVWR470225-004
TBS Buffer, 20x liquidVWR10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchineThermo ScientificST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchineEppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated FlasksThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted PlatesThermo ScientificAB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)Thermo ScientificAB1453B
Ultra Low Range DNA LadderInvitrogen10597012
VWR standard solid door laboratory refrigeratorVWR

References

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090(2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769(2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495(2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543(2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078(2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145miRNARNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved