الجمع بين تحليل الصفحات غير المتناقصة والربط الكيميائي للكشف عن مجمعات مولتيميرك التي استقرت بالروابط الثنائية في خلايا الثدييات في الثقافة

Summary

ومنذ فتره طويلة من المعروف ان الروابط الثنائية الكبريتيد لتحقيق الاستقرار في هيكل العديد من البروتينات. والطريقة البسيطة لتحليل المجمعات التي استقرت فيها هذه الروابط هي من خلال عدم الحد من البيانات التحليلية للصفحات. هنا ، يتم توضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل ايزوفورم النووية من دوبيز من العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS.

Abstract

وتستقر هياكل العديد من البروتينات من خلال الروابط الثنائية التكافؤ. وفي الاعمال الاخيره ، صنفت هذه الرابطة أيضا علي انها تعديل بعد الإجراءات الانتقالية. التالي ، من المهم ان تكون قادره علي دراسة هذا التعديل في الخلايا الحية. طريقه بسيطه لتحليل هذه المجمعات مولتيمريك استقرت السيستين هو من خلال طريقه من خطوتين من عدم الحد من SDS-صفحه التحليل و الفورمالديهايد عبر ربط. هذه الطريقة من خطوتين هو مفيد كخطوه اولي للكشف عن المجمعات مولتيمريك استقرت من خلال الروابط الثنائية بسبب سهوله التقنية وانخفاض تكلفه التشغيل. هنا ، يستخدم العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS لتوضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل علي وجه التحديد ايزوفورم النووية من دوبيز.

Introduction

ومنذ فتره طويلة من المعروف ان الروابط الثنائية الكبريتيد لتحقيق الاستقرار في هيكل العديد من البروتينات. في العمل الأخير ، وقد صنفت هذه الرابطة أيضا كتعديل عكسها بعد الانتقالية ، بوصفها المستندة إلى السيستين "تبديل الاكسده" السماح لتحوير وظيفة البروتين ، والموقع والتفاعل^{1،2، 3,4}. التالي ، من المهم ان تكون قادره علي دراسة هذا التعديل. طريقه بسيطه لتحليل هذه المجمعات مولتيمريك استقرت السيستين من خلال عدم الحد من SDS-تحليل الصفحة⁵. تحليل SDS-PAGE هو أسلوب يستخدم في العديد من المختبرات ، حيث يمكن الحصول علي النتائج وتفسيرها بسرعة وسهوله وباقل التكاليف ، وهو مفيد علي التقنيات الأخرى المستخدمة لتحديد الروابط الثنائية الكبريتيد مثل قياس الطيف الكتلي^{6 ,7} و [ديشرويسم] دائريه⁸.

خطوه هامه واحده في تحديد ما إذا كان هذا الأسلوب هو تقنيه مناسبه للمساعدة في الدراسة هو فحص دقيق للتسلسل الأساسي للبروتين الفائدة لضمان وجود بقايا السيستين (ق) الحالية. خطوه أخرى مفيده هي البحث عن اي هياكل الكريستال السابقة التي نشرت أو استخدام تطبيق المعلوماتية الحيوية لاستكشاف بنيه الابعاد الثلاثة للبروتين من الفائدة لتصور حيث بقايا السيستين (ق) قد تكون موجودة. إذا كانت بقايا (ق) موجودة علي السطح الخارجي قد يكون أفضل مرشح لتشكيل الربط الكبريتيد بدلا من بقايا السيستين مدفونة في الداخل من الهيكل. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان البروتينات قد تخضع للتغيرات الهيكلية علي التفاعلات الركيزة أو تفاعلات البروتين البروتين السماح لهذه المخلفات لتصبح ثم تتعرض للبيئة ، وكذلك.

يمكن بعد ذلك التحقق من المجمعات مولتيمريك المحددة مع الكيميائية عبر ربط استخدام الفورمالديهايد. الفورمالديهايد هو مثاليه عبر رابط لهذه التقنية التحقق بسبب نفاذيه الخلية العالية وقصيرة عبر ربط تمتد من ~ 2-3 Å ، وضمان الكشف عن التفاعلات بروتين البروتين محدده^9،10. هنا ، يتم توضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل ايزوفورم النووية من دوبيز من العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS¹¹. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لخطوط الخلايا الأخرى والانسجه والكائنات الحية.

Protocol

1. حجب بقايا السيستين الحرة باستخدام ايودواسيتاميد

1. تنمو الخلايا U-2 نظام التشغيل في 6 سم² طبق إلى 50 ٪-60 ٪ كونفلوينسي في الحد الأدنى من المتوسطة الاساسيه مع ارتفاع الجلوكوز التي تحتوي علي 10 ٪ الجنين البقري المصل و 1 ٪ بيروفات الصوديوم في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO₂.
2. جعل المخزون الطازج من iodoacetamide 10 ملم فقط قبل الاستخدام ، ثم تجاهل اي كاشف غير المستخدمة.
3. أضافه 0.1 mM التركيز النهائي iodoacetamide مباشره إلى وسائط ثقافة الخلية. صخره بلطف الطبق في درجه حرارة الغرفة لمده 2 دقيقه.

2. حصاد الخلايا

1. يستنشق وسائل الاعلام من الخلايا.
2. غسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات الباردة-مخزنه المالحة (تلفزيوني) ثلاث مرات. يستنشق الحل النهائي لغسل الملابس التلفزيونية ثم أضافه 1 مل من الباردة.
3. كشط الخلايا قباله الجزء السفلي من الطبق باستخدام مكشطه الخلية. باستخدام ماصه 1 مل سحب ما يصل النظام التلفزيوني وتعليق الخلية والاستغناء عن كل السائل في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.
4. تدور الخلايا في 7,500 x g لمده ثلاث دقائق في 4 °c. يستنشق التلفزيوني ، تاركا الخلية بيليه وراءها. يمكن تخزين الخلية بيليه في-80 درجه مئوية حتى معالجه

3. استخراج البروتين

1. اعداد 100 μL من المخزن المؤقت تحلل 1x المخفف في ddH₂O (انظر جدول المواد). أضافه فلوريد فينيل ميثيل السلفونيل (PMSF) مباشره قبل الاستخدام إلى تركيز نهائي 1 ملم.
2. أضافه 50 μL من المخزن المؤقت تحلل 1x مباشره إلى الخلية بيليه والتعليق. احتضان هذا علي الجليد لمده 5 دقائق.
3. سوكاتي لمده 8 ليالي باستخدام وضع نبض ثابت في 40 ٪ (انظر جدول المواد ل sonicator ؛ ضبط حسب الضرورة لمختلف الاجهزه الصوتية) ، والحفاظ علي استخراج علي الجليد.
4. تدور استخراج في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق في 16,000 x g. و ماده طافي هو كسر البروتين القابل للذوبان. ويمكن اجراء تحليل برادفورد لتحديد تركيز البروتين إذا رغبت في ذلك.

4. اعداد العينات

1. خذ 10 μL من استخراج البروتين القابل للذوبان وأضافه 10 μL من 1x Laemmli SDS-عينه العازلة (4 ٪ SDS ، 20 ٪ الجلسرين ، 0.004 ٪ بروموفينول الأزرق ، و 0.125 M تريس-HCl ، pH 6.8). لا تقم باضافه اي الكواشف الحد.
2. الاحتفاظ بالعينات علي الجليد إذا كان سيتم اجراء تحليل SDS PAGE في ذلك اليوم ؛ للتخزين علي المدى الطويل ،-20 درجه مئوية هو المناسب. الحق قبل تشغيل هلام ، تسخين العينة لمده 5 دقائق في 85 درجه مئوية.

5. في فيفو الفورمالديهايد الصليب-ربط البروتينات الذاتية في خلايا OS-2

1. تنمو الخلايا U-2 OS في 175 سم² قارورة إلى 70 ٪-80 ٪ كونفلوينسي (انظر القسم 1).
2. قم باجراء التفاعل المتقاطع بين الفورمالديهايد
   1. في غطاء الدخان ، قسامه محلول الفورمالديهايد 37 ٪ شراؤها من مصادر تجاريه. أضافه المثبت الفورمالديهايد مباشره إلى الوسط إلى تركيز النهائي من 1 ٪ واحتضان في درجه حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف لمده 15 دقيقه.
   2. لإرواء رد الفعل ، أضافه 1.25 M الجليسين إلى تركيز نهائي من 0.125 م واحتضان في درجه حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف علي الروك لمده 5 دقائق.
3. غسل الخلايا مع 5 مل من الباردة تلفزيوني ثلاث مرات. يستنشق الحل النهائي غسل التلفزيونية وأضافه 10 مل من تلفزيوني. كشط الخلايا قباله الجزء السفلي من القارورة باستخدام مكشطه الخلية.
4. باستخدام ماصه 10 مل ، ورسم ما يصل تلفزيوني وتعليق الخلية والاستغناء عن كل من السائل في أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل. تدور الخلايا في 500 x g لمده 2 دقيقه في 4 °c. يستنشق التلفزيوني ، تاركا الخلية بيليه وراءها.

6. تجزئه النوى

1. اعداد 10 مل من العازلة التجانس: 0.25 M السكروز ، 1 مم أدتا ، 10 ملم HEPES ، و 0.5 ٪ بوسنيا في الأس الهيدروجيني 7.4. أضف PMSF مباشره قبل الاستخدام إلى تركيز نهائي 1 ملم و 3 مل من المخزن المؤقت لتعليق النوى (0.1% تريتون X-100 في الاذاعه التلفزيونية).
2. أضافه 5 mL العازلة التجانس مباشره إلى بيليه الخلية والتعليق تماما. الطرد المركزي تعليق في 500 x g لمده 2 دقيقه عند 4 °c ثم تجاهل supernatant.
3. تعليق بيليه في 5 مل من العازلة التجانس. استخدام ضيق التركيب الخالطون الزجاج تفلون ، dounce المجانسة الخلايا في 10 السكتات الدماغية/500 دوره في الدقيقة.
4. الطرد المركزي تعليق في 1,500 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c ، ثم تجاهل supernatant.
   ملاحظه: استخدام ماده طافي لعزل الميتوكوندريا من قبل يطرد في 10,000 x g لمده 10 دقيقه.
5. تعليق بيليه في 1 مل العازلة تعليق نوى واحتضان علي الجليد لمده 10 دقيقه.
6. الطرد المركزي في 600 x g لمده 10 دقيقه. تجاهل supernatant.
7. تعليق بيليه في 1 مل العازلة تعليق نوى والطرد المركزي مره أخرى. تجاهل الخارقة. سوف بيليه النهائي تكون نواه معزولة.

7. استخراج البروتين

1. كرر المقطع 4 ، باستثناء أضافه 25 μL من المخزن المؤقت تحلل 1x مباشره إلى بيليه الخلية ثم تعليق.

8. اعداد العينات

1. اعداد عينتين ل SDS-PAGE بأخذ 10 μL كل من استخراج البروتين القابل للذوبان وأضافه 10 μL من 2x المخزن المؤقت لعينات المخزون الاحتياطي الصربي و 1 μL من 2-Mercaptoethanol (BME).
2. الحرارة عينه واحده لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية والعينة الثانية لمده 15 دقيقه في 98 درجه مئوية لعكس رابط الصليب الفورمالديهايد.

9-تحليل الصفحات المخزونة

1. اعداد 1 لتر من تريس-الجليسين تشغيل العازلة (25 ملم تريس ، 192 mM الجليسين ، 0.1 ٪ (w/v) SDS).
2. اعداد جهاز تشغيل الصفحة SDS.
   ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول 16% الجاهزة TGX SDS صفحه. من الملاحظة ، يمكن استخدام اي هلام نسبه مئوية.
   1. في بروتوكول الشركة المصنعة ، افتح الحزمة التي يتم تخزين الهلام فيها وأزاله الكاسيت.
   2. أزاله المشط الذي هو بطانة الآبار والشريط من الجزء السفلي من الكاسيت.
   3. ضع الهلام في الجهاز الجاري.
   4. ملء الغرفة مع 1x تشغيل العازلة حتى يتم غمر الآبار في السائل. باستخدام pipet البلاستيكية ، شطف الآبار مع المخزن المؤقت قيد التشغيل.
3. تحميل العينات علي هلام مع 10 μL علامة القياسية الملون.
4. تشغيل الهلام في 200 V حتى الجبهة صبغ ما يقرب من 1 سم من الجزء السفلي من هلام.

10. لطخه الغربية

1. اعداد 1 لتر من 1x المخزن المؤقت نقل (25 ملم تريس ، 192 mM الجليسين ، 20 ٪ الميثانول) وتخزين في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام.
2. أزاله الهلام بعناية وفتح الكاسيت. باستخدام شفره الحلاقة ، وقطع بعناية وتجاهل هلام التراص. التقاط هلام باستخدام زاوية واحده ووضعه في علبه مع العازلة نقل ، مما يسمح لها ان الصخور بلطف لمده 5 دقائق.
3. في حين ان هلام هو هزاز ، ووضع كتله الجليد (المخزنة في-20 درجه مئوية) في خزان نقل وأضافه العازلة نقل إلى 3/4 كامل.
4. الرطب فلوفينليدين فلوريد (PVDF) غشاء بنقع في 100 ٪ الميثانول لمده 30 ثانيه.
5. مره واحده قد مرت 5 دقيقه ، والاستعداد لاعداد نقل في علبه مع المخزن المؤقت نقل. يجب ان يكون المخزن المؤقت للنقل كافيا لدمج اللطخه بشكل كامل. اعداد نقل لطخه علي النحو التالي: في أسفل ، والجزء السفلي من حامل الكاسيت (اسود) ؛ ثم إسفنجه سميكه ، ورقه سميكه اضافيه التنقيط ، هلام بولياكريلاميد ، غشاء PVDF ، ورقه سميكه اضافيه التنقيط ، والإسفنج سميكه. ثم أخيرا اعلي حامل الكاسيت (ابيض) في الأعلى.
6. قفل الكاسيت ووضع وحده في خزان نقل مع غشاء PVDF نحو الآنود الموجبة وهلام نحو السلبية. اعلي الوحدة مع المخزن المؤقت نقل حتى يتم المغمورة تماما النقل الخاص بك.
7. وضع الوحدة علي راس لوحه يحركها. أضافه شريط تحريك إلى الوحدة والبدء في التحريك في 125 لفه في الدقيقة.
8. تشغيل في 100 V لمده 60 دقيقه.
9. في حين ان نقل قيد التشغيل ، واعداد حل من 5 ٪ مسحوق الحليب المذاب في تريس-مخزنه المالحة ، مع توين-20 ، pH 7.5 (TWEEN).
10. تفكيك وحده وأزاله الغشاء ، مشيرا إلى الجانب الذي كان علي اتصال مع هلام ؛ ضمان بقاء هذا الضلع في الدرج للخطوات المتبقية.
11. نقع الغشاء لمده 2 دقيقه في تريس-مخزنه المالحة (TBS) تليها عرقله الغشاء عن طريق احتضان في 5 مل من 5 ٪ الحليب-TBST حل لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
12. استبدلي الحليب بمحلول 4 مل من الحليب الطازج بنسبه 5% واضفي الجسم المضاد الأساسي في التخفيف المناسب (في هذه الحالة ، التخفيف هو 1:2000 للأجسام المضادة دوبيز) والاحتضان خلال الليل مع هزاز لطيف عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
13. في اليوم التالي ، أزاله لطخه من الروك 4 درجه مئوية إلى درجه حرارة الغرفة الروك ، ونبذ حل الأجسام المضادة الاساسيه.
14. القيام ثلاثه يغسل سريعة مع TBST ، وذلك باستخدام ما يكفي من السائل لغمر تماما وصمه عار ، تليها 3 يغسل ، 5 دقيقه لكل منهما ، هزاز ببطء.
15. بعد غسل الماضي ، أضافه 5 مل من الحل 5 ٪ حليب-TBST وصخره وصمه عار لمده 15 دقيقه ثم تجاهل.
16. أضافه الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 5% حليب-TBST في التركيز المطلوب. (في هذه الحالة ، 1:5000 التخفيف من الماعز المضادة لأرنب المخفف في 5 مل من محلول الحليب-TBST 5 ٪)
17. احتضان في درجه حرارة الغرفة ، هزاز لمده 1 ساعة ، ثم تجاهل الحل.
18. تفعل ثلاثه يغسل سريعة مع TBST تليها 3 يغسل ، 5 دقيقه لكل منهما ، هزاز ببطء ، ثم تجاهل غسل النهائي وأضافه 5 مل من TBS.
19. اعداد 1:1 مزيج من حلول الكشف عن الكيمياء الكيميائية ECL (1 مل من كل كاشف لحجم النهائي من 2 مل) وأضافه هذا مباشره إلى احتضان لطخه لمده 1 دقيقه.
20. أزاله الغشاء باستخدام ملاقط والداب الزاوية مع مسح المختبر ، وأزاله اي حل الزائدة. وضع الغشاء في التفاف يتقلص ووضع الجانب البروتين حتى في كاسيت الاشعه السينية.
21. فضح الغشاء إلى فيلم الاشعه السينية. سيختلف وقت التعرض.

النتائج

النووية دوبيز يشكل الربط ثنائي كبريتيد الجزيئية تشكيل تكوين ديمر مستقره من خلال التفاعل بين اثنين من بقايا السيستين المتمركزة في الأحماض الامينيه الثالثة لكل بروتين مونوميريك¹¹. ويتجلى ذلك في الشكل 1 الفوباء. ولضمان عدم وجود تفاعل غ...

Discussion

والطريقة المبينة هنا تعطي بروتوكولا مستقيما لتحليل المجمعات المعقدة التي استقرت من خلال الروابط الثنائية الكبريتيد. ويمكن بسهوله تكييف هذا البروتوكول مع غيرها من خطوط ثقافة الخلايا والانسجه والكائنات الحية مما يسمح لطائفه واسعه من التطبيقات.

ومن الخطوات الهامه في هذا ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090