Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture

Résumé

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Une méthode simple pour analyser les complexes multimères stabilisés par ces liaisons est une analyse SDS-PAGE non réductrice. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS.

Résumé

Les structures de nombreuses protéines sont stabilisées par des liaisons disulfures covalentes. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-traductionnelle. Ainsi, il est important de pouvoir étudier cette modification dans les cellules vivantes. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est par une méthode en deux étapes d’analyse SDS-PAGE non réductrice et de réticulation du formaldéhyde. Cette méthode en deux étapes est avantageuse comme première étape pour découvrir les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures en raison de sa facilité technique et de son faible coût de fonctionnement. Ici, la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS est utilisée pour illustrer cette méthode en analysant spécifiquement l’isoforme nucléaire de dUTPase.

Introduction

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-translationnelle réversible, agissant comme un "commutateur redox" à base de cystéine permettant la modulation de la fonction de protéine, de l’emplacement et de l’interaction^{1,2, 3,4}. Il est donc important de pouvoir étudier cette modification. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est de ne pas réduire l’analyse SDS-PAGE⁵. L’analyse SDS-PAGE est une technique utilisée dans de nombreux laboratoires, où les résultats peuvent être obtenus et interprétés rapidement, facilement et avec des coûts minimes, et est avantageux par rapport aux autres techniques utilisées pour identifier les liaisons disulfure telles que la spectrométrie de masse^{6 ,7} et dichroïsme circulaire⁸.

Une étape importante pour déterminer si cette méthode est une technique appropriée pour aider dans une étude est d’examiner attentivement la séquence primaire de la protéine d’intérêt pour s’assurer qu’il y a des résidus de cystéine (s) présents. Une autre étape utile est de rechercher toutes les structures cristallines précédentes publiées ou d’utiliser une application de bioinformatique pour explorer la structure tridimensionnelle de la protéine d’intérêt pour visualiser où le résidu de cystéine (s) peut être localisé. Si le ou les résidus sont présents sur la surface extérieure, il peut être préférable de former un lien disulfure plutôt qu’un résidu de cystéine enterré à l’intérieur de la structure. Cependant, il est important de noter que les protéines peuvent subir des changements structurels sur des interactions de substrat ou des interactions protéine-protéine permettant à ces résidus d’être alors exposés à l’environnement aussi bien.

Les complexes multimères identifiés peuvent ensuite être vérifiés avec un réticulation chimique à l’aide de formaldéhyde. Le formaldéhyde est un lien de croisement idéal pour cette technique de vérification en raison de la perméabilité cellulaire élevée et de la courte portée croisée de ~ 2-3 Å, assurant la détection d’interactions protéine-protéine spécifiques^9,10. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS¹¹. Cependant, ce protocole peut être adapté pour d’autres lignées cellulaires, tissus et organismes.

Protocole

1. blocage des résidus de cystéine libres à l’aide d’iodoacétamide

1. Cultiver des cellules OS U-2 dans un plat de 6 cm² à 50% – 60% de Confluences dans un milieu essentiel minimum avec un taux élevé de glucose contenant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pyruvate de sodium à 37 ° c dans 5% co₂.
2. Faire un nouveau stock de 10 mM d’iodoacétamide juste avant l’utilisation, puis jeter tout réactif inutilisé.
3. Ajouter l’iodoacétamide de concentration finale de 0,1 mM directement dans les milieux de culture cellulaire. Faire basculer doucement le plat à température ambiante pendant 2 min.

2. récolter les cellules

1. Aspirer les médias des cellules.
2. Laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) trois fois. Aspirer la solution finale de lavage de PBS puis ajouter 1 mL de PBS froid.
3. Grattez les cellules du fond du plat à l’aide d’un grattoir cellulaire. À l’aide d’une pipette de 1 mL, prélever le PBS et la suspension cellulaire et distribuer tout le liquide dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
4. Tourner les cellules à 7 500 x g pendant 3 min à 4 ° c. Aspirer le PBS, laissant le culot de la cellule derrière. Le culot de la cellule peut être stocké à-80 ° c jusqu’à

3. extraction de protéines

1. Préparer 100 μL de tampon de lyse dilué dans le FD₂O (voir tableau des matériaux). Ajouter le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) immédiatement avant utilisation à une concentration finale de 1 mM.
2. Ajouter 50 μL du tampon de lyse 1x directement sur le culot de la cellule et suspendre. Incuber ce sur la glace pendant 5 min.
3. Sonicate pour 8 s en utilisant le mode d’impulsion constante à 40% (voir tableau des matériaux pour Sonicator; ajuster si nécessaire pour différents sonicateurs), en gardant l’extrait sur la glace.
4. Faire tourner l’extrait à 4 ° c pendant 5 min à 16 000 x g. Le surnageant est la fraction protéique soluble. L’analyse de Bradford peut être effectuée pour déterminer la concentration de protéines si désiré.

4. préparation de l’échantillon

1. Prélever 10 μL d’extrait de protéine soluble et ajouter 10 μL de tampon de SDS-échantillon de Laemmli 1x (4% de SDS, 20% de glycérol, 0,004% de bleu de bromophénol et 0,125 M de Tris-HCl, pH 6,8). Ne pas ajouter de réactifs réducteurs.
2. Conservez les échantillons sur la glace si l’analyse de la SDS PAGE sera effectuée ce jour-là; pour le stockage à long terme,-20 ° c est approprié. Juste avant d’exécuter le gel, chauffer l’échantillon pendant 5 min à 85 ° c.

5. in vivo formaldéhyde réticulation des protéines endogènes dans les cellules U-2 OS

1. Cultivez des cellules OS U-2 dans un flacon de 175 cm² à 70% – 80% de Confluences (voir rubrique 1).
2. Effectuer la réaction de réticulation du formaldéhyde
   1. Dans une hotte, aliquote une solution de formaldéhyde à 37% achetée à partir de sources commerciales. Ajouter le fixatif de formaldéhyde directement au milieu à une concentration finale de 1% et incuber à température ambiante avec une agitation douce pendant 15 min.
   2. Pour étancher la réaction, ajouter 1,25 M glycine à une concentration finale de 0,125 M et incuber à température ambiante avec une agitation douce sur un rocker pendant 5 min.
3. Laver les cellules avec 5 mL de PBS froid trois fois. Aspirer la solution finale de lavage de PBS et ajouter 10 mL de PBS. Gratter les cellules du fond de la fiole à l’aide d’un grattoir cellulaire.
4. À l’aide d’une pipette de 10 mL, prélever le PBS et la suspension cellulaire et distribuer tout le liquide dans un tube de centrifugation conique de 15 mL. Faire tourner les cellules à 500 x g pendant 2 min à 4 ° c. Aspirer le PBS, laissant le culot de la cellule derrière.

6. fractionnement des noyaux

1. Préparer 10 mL de tampon d’homogénéisation: 0,25 M de saccharose, 1 mM d’EDTA, 10 mM d’HEPES et 0,5% de BSA à pH 7,4. Ajouter le PMSF immédiatement avant utilisation à une concentration finale de 1 mM et 3mL de tampon de suspension de noyaux (0,1% de Triton X-100 dans le PBS).
2. Ajouter 5 mL de tampon d’homogénéisation directement sur le culot de la cellule et suspendre complètement. Centrifuger la suspension à 500 x g pendant 2 min à 4 ° c puis jeter le surnageant.
3. Suspendre le culot dans 5 mL de tampon d’homogénéisation. Utiliser un homogénéisateur de verre-Teflon serré, dounce homogénéiser les cellules à 10 coups/500 RPM.
4. Centrifuger la suspension à 1 500 x g pendant 10 min à 4 ° c, puis jeter le surnageant.
   Remarque: Utiliser le surnageant pour isoler les mitochondrias en centrifugeant à 10 000 x g pendant 10 min.
5. Suspendre le culot dans un tampon de suspension de noyaux de 1 mL et incuber sur la glace pendant 10 min.
6. Centrifuger à 600 x g pendant 10 min. jeter le surnageant.
7. Suspendre le culot dans 1 mL de tampon de suspension de noyaux et centrifuger à nouveau. Jetez le surnageant. Le culot final sera des noyaux isolés.

7. extraction de protéines

1. Répéter la section 4, sauf en ajoutant 25 μL du tampon de lyse 1x directement au culot de la cellule puis en suspendant.

8. préparation de l’échantillon

1. Préparer deux échantillons pour la SDS-PAGE en prenant 10 μL chacun de l’extrait de protéine soluble et ajouter 10 μL de 2x tampon de SDS-échantillon de Laemmli et 1 μL de 2-mercaptoéthanol (BME).
2. Chauffer un échantillon pendant 5 min à 37 ° c et le deuxième échantillon pendant 15 min à 98 ° c pour inverser la liaison croisée formaldéhyde.

9. analyse SDS-PAGE

1. Préparer 1 L de tampon de course de Tris-Glycine 1x (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% (p/v) SDS).
2. Configurez l’appareil de fonctionnement SDS-PAGE.
   Remarque: ce protocole utilise une page SDS TGX de 16% préfabriqué. De note, n’importe quel pourcentage de gel peut être utilisé.
   1. Par le protocole du fabricant, ouvrez le paquet dans lequel le gel est stocké et retirez la cassette.
   2. Retirez le peigne qui est en alignant les puits et la bande du bas de la cassette.
   3. Placez le gel dans l’appareil de roulement.
   4. Remplissez la chambre avec le tampon de fonctionnement 1x jusqu’à ce que les puits soient immergés dans le liquide. À l’aide d’un pipetage en plastique, rincer les puits avec le tampon de roulement.
3. Chargez les échantillons sur le gel ainsi que 10 μL de marqueur standard préteinté.
4. Faire fonctionner le gel à 200 V jusqu’à ce que le front de teinture soit à environ 1 cm du fond du gel.

10. Western Blot

1. Préparer 1 L de tampon de transfert 1x (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% méthanol) et conserver à 4 ° c jusqu’à l’utilisation.
2. Retirez délicatement le gel et ouvrez la cassette. À l’aide d’un rasoir, coupez soigneusement et jetez le gel d’empilage. Ramasser le gel en utilisant un coin et le placer dans un plateau avec tampon de transfert, ce qui lui permet de roche doucement pendant 5 min.
3. Pendant que le gel bascule, placez un bloc de glace (stocké dans-20 ° c) dans le réservoir de transfert et ajoutez le tampon de transfert à 3/4 plein.
4. Mouiller la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) en la trempant dans 100% de méthanol pendant 30 s.
5. Une fois que les 5 min ont passé, préparez-vous à mettre en place le transfert dans un plateau avec tampon de transfert. Le tampon de transfert doit être suffisant pour submerger complètement la tache. Réglez le transfert de la tache comme suit: en bas, le fond du support de cassette (noir); puis une éponge épaisse, du papier buvard extra épais, du gel de polyacrylamide, une membrane PVDF, du papier buvard extra épais et une éponge épaisse; puis enfin le haut du support de cassette (blanc) en haut.
6. Verrouiller la cassette et placer l’appareil dans le réservoir de transfert avec la membrane PVDF vers l’anode positive et le gel vers le négatif. En haut de l’unité avec tampon de transfert jusqu’à ce que votre transfert est complètement submergé.
7. Placez l’appareil au-dessus d’une plaque d’agitation. Ajouter une barre de brassage à l’unité et commencer à remuer à 125 tr/min.
8. Courir à 100 V pour 60 min.
9. Pendant que le transfert est en cours, préparez une solution de 5% de lait en poudre dissous dans la solution saline tamponnée au tris, avec Tween-20, pH 7,5 (TBST).
10. Démonter l’unité et enlever la membrane, en notant quel côté était en contact avec le gel; Assurez-vous que ce côté reste dans le tiroir pour les étapes restantes.
11. Faire tremper la membrane pendant 2 min dans une solution saline tamponnée (TBS) suivie d’un blocage de la membrane en incubant dans 5 mL de 5% de lait-TBST pendant 30 min à température ambiante.
12. Remplacez le lait par une solution fraîche de 4 mL de lait-TBST de 5% et ajoutez l’anticorps primaire à la dilution appropriée (dans ce cas, notre dilution est de 1:2000 pour l’anticorps dUTPase) et incubez pendant la nuit avec un léger balancement à 4 ° c.
13. Le jour suivant, retirez la tache du rocker de 4 ° c à une bascule de température ambiante, en rejetant la solution d’anticorps primaire.
14. Faire trois lavages rapides avec TBST, en utilisant assez de liquide pour submerger complètement la tache, suivie de 3 lavages, 5 min chacun, bascule lentement.
15. Après le dernier lavage, ajouter 5 mL de la solution 5% Milk-TBST et faire basculer la tache pendant 15 min puis la jeter.
16. Ajouter l’anticorps secondaire dilué dans 5% de lait-TBST à la concentration désirée. (Dans ce cas, dilution 1:5000 de chèvre anti-lapin dilué dans 5 mL de 5% de lait-TBST solution)
17. Incuber à température ambiante, à bascule pendant 1 h, puis jeter la solution.
18. Faites trois lavages rapides avec le TBST suivi de 3 lavages, 5 min chacun, bascule lentement, puis jetez le lavage final et ajoutez 5 mL de TBS.
19. Préparer un mélange 1:1 de solutions de détection chimiluminescente ECL (1 mL de chaque réactif pour un volume final de 2 mL) et l’ajouter directement à la tache incubant pendant 1 min.
20. Retirez la membrane à l’aide de pinces et tamponnez le coin avec une lingette de laboratoire, en éliminant toute solution excédentaire. Placez la membrane dans un enveloppement rétractable et placez le côté protéique dans une cassette à rayons x.
21. Exposer la membrane au film radiographique. Le temps d’exposition variera.

Résultats

La dUTPase nucléaire forme une liaison disulfure intermoléculaire formant une configuration dimère stable grâce à l’interaction de deux résidus de cystéine positionnés au troisième acide aminé de chaque protéine monomère¹¹. Ceci est démontré dans la figure 1a, B. Pour s’assurer que cette liaison disulfure n’était pas une interaction non spécifique en raison d’anomalies de la migration dans l’e...

Discussion

La méthode décrite ici donne un protocole direct pour l’analyse des complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures. Ce protocole peut facilement être adapté à d’autres lignées de culture cellulaire, des tissus et des organismes permettant une large gamme d’applications.

Une étape importante dans cette procédure est de s’assurer que les liaisons disulfure ne sont pas une conséquence de la procédure d’extraction. Tous les résidus de cystéine libre peuvent êt...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090