Combinación de análisis de SDS-página no-reducción y reticulación química para detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro en células de mamíferos en la cultura

Resumen

Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. Un método simple para analizar complejos multiméricos estabilizados por estos vínculos es mediante el análisis de SDS-PAGE no reductor. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células de osteosarcoma ósea humana U-2 OS.

Resumen

Las estructuras de muchas proteínas se estabilizan a través de enlaces de disulfuro covalente. En los trabajos recientes, este vínculo también se ha clasificado como una modificación post-translacional. Por lo tanto, es importante poder estudiar esta modificación en las células vivas. Un método simple para analizar estos complejos multiméricos de la cisteína estabilizada es a través de un método de dos pasos de no reducir el análisis de SDS-PAGE y la reticulación de formaldehído. Este método de dos pasos es ventajoso como el primer paso para descubrir complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro debido a su facilidad técnica y bajo costo de operación. Aquí, la línea de células osteosarcoma ósea humana U-2 OS se utiliza para ilustrar este método mediante el análisis específico de la isoforma nuclear de dUTPase.

Introducción

Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. En los trabajos recientes, este lazo también se ha clasificado como una modificación post-translacional reversible, actuando como un "interruptor redox" basado en la cisteína que permite la modulación de la función de la proteína, ubicación e interacción^{1,2, 3,4}. Por lo tanto, es importante poder estudiar esta modificación. Un método simple para analizar estos complejos multiméricos de la cisteína estabilizada es a través de análisis de SDS-PAGE no-reducción⁵. El análisis de SDS-PAGE es una técnica utilizada en muchos laboratorios, donde los resultados se pueden obtener e interpretar de forma rápida, fácil y con costos mínimos, y es ventajoso sobre otras técnicas utilizadas para identificar enlaces de disulfuro como la espectrometría de masas^{6 ,7} y dicroísmo circular⁸.

Un paso importante para determinar si este método es una técnica apropiada para ayudar en un estudio es examinar a fondo la secuencia primaria de la proteína de interés para asegurar que hay residuos de cisteína presentes. Otro paso útil es investigar cualquier estructura cristalina anterior publicada o utilizar una aplicación de bioinformática para explorar las tres estructuras dimensionales de la proteína de interés para visualizar donde pueden estar localizados los residuos de cisteína. Si el residuo (s) está presente en la superficie exterior puede ser un mejor candidato para formar un enlace de disulfuro en lugar de un residuo de cisteína enterrado en el interior de la estructura. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las proteínas pueden someterse a cambios estructurales en las interacciones de sustrato o interacciones proteína-proteína permitiendo que estos residuos a continuación, se exponen al medio ambiente, así.

Los complejos multiméricos identificados se pueden verificar con la reticulación química utilizando formaldehído. El formaldehído es un enlace cruzado ideal para esta técnica de verificación debido a la alta permeabilidad de las células y a la corta distancia cruzada de ~ 2-3 Å, asegurando la detección de interacciones proteína-proteína específicas^9,10. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células osteosarcoma ósea humana U-2 OS¹¹. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado para otras líneas celulares, tejidos y organismos.

Protocolo

1. bloqueo de residuos de cisteína libre usando Iodoacetamida

1. Crecer células U-2 OS en un 6 cm² plato a 50% – 60% confluencia en medio esencial mínimo con alta glucosa que contiene 10% suero bovino fetal y 1% piruvato sódico a 37 ° c en 5% Co₂.
2. Haga un caldo fresco de iodoacetamida de 10 mM justo antes de su uso, luego deseche cualquier reactivo no utilizado.
3. Añadir 0,1 mM de concentración final iodoacetamida directamente al medio de cultivo celular. Rocía suavemente el plato a temperatura ambiente durante 2 min.

2. cosechar las células

1. Aspiran los medios de las células.
2. Lave tres veces las células con 5 mL de solución salina con tampón de fosfato frío (PBS). Aspirar la solución final de lavado PBS y luego añadir 1 mL de PBS frío.
3. Raspe las células de la parte inferior del plato usando un raspador celular. El uso de una pipetas de 1 mL extraerá el PBS y la suspensión celular y dispensará todo el líquido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
4. Gire las células a 7.500 x g durante tres minutos a 4 ° c. Aspiran el PBS, dejando el pellet de células detrás. El pellet de células se puede almacenar a-80 ° c hasta el procesamiento

3. extracción de proteína

1. Preparar 100 μL de un tampón de lisis 1x diluido en ddH₂O (ver tabla de materiales). Agregar fluoruro de fenilmetilsulfonyl (PMSF) inmediatamente antes de su uso a una concentración final de 1 mM.
2. Añadir 50 μL del tampón de lisis 1x directamente al pellet de células y suspender. Incubar esto sobre hielo durante 5 min.
3. Sonicar para 8 s utilizando el modo de pulso constante en 40% (ver tabla de materiales para el sonicador; ajustar según sea necesario para diferentes sonicadores), manteniendo el extracto en hielo.
4. Gire el extracto a 4 ° c durante 5 min a 16.000 x g. El sobrenadante es la fracción de proteína soluble. El análisis de Bradford se puede realizar para determinar la concentración de proteína si se desea.

4. preparación de la muestra

1. Tomar 10 μL del extracto proteico soluble y añadir 10 μL de un tampón 1x Laemmli SDS-muestra (4% SDS, 20% glicerol, 0,004% azul de bromofenol, y 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). No agregue reactivos reductores.
2. Mantenga las muestras en hielo si el análisis de la página SDS se realizará ese día; para almacenamiento a largo plazo,-20 ° c es apropiado. Justo antes de ejecutar el gel, calentar la muestra durante 5 min a 85 ° c.

5. en vivo formaldehído reticulación de proteínas endógenas en U-2 OS células

1. Crezca las células del SO U-2 en un matraz de 175 cm² a 70% – 80% de confluencia (ver sección 1).
2. Realizar la reacción de reticulación de formaldehído
   1. En una campana de humo, alícuota una solución de formaldehído 37% comprada de fuentes comerciales. Añadir el fijador de formaldehído directamente al medio a una concentración final del 1% e incubar a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 min.
   2. Para saciar la reacción, añadir 1,25 M de glicina a una concentración final de 0,125 M e incubar a temperatura ambiente con agitación suave en un balancín durante 5 min.
3. Lavar las células con 5 mL de PBS frío tres veces. Aspirar la solución final de lavado PBS y añadir 10 mL de PBS. Raspar las células de la parte inferior del matraz con un raspador celular.
4. Utilizando una Piera de 10 mL, elabore el PBS y la suspensión celular y dispense todo el líquido en un tubo de centrífuga cónica de 15 mL. Gire las células a 500 x g durante 2 min a 4 ° c. Aspiran el PBS, dejando el pellet de células detrás.

6. fraccionamiento de núcleos

1. Preparar 10 mL de tampón de homogeneización: 0,25 M sacarosa, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, y 0,5% BSA a pH 7,4. Añadir PMSF inmediatamente antes de su uso a una concentración final de 1 mM y 3mL de tampón de suspensión de núcleos (0,1% Triton X-100 en PBS).
2. Añadir 5 mL de tampón de homogeneización directamente al pellet de células y suspender por completo. Centrifugar la suspensión a 500 x g durante 2 min a 4 ° c y desechar el sobrenadante.
3. Suspender el pellet en 5 mL de tampón de homogeneización. Utilice un homogeneizador de vidrio-teflón ceñido, las células de homogenizar de la Dounce a 10 golpes/500 rpm.
4. Centrifugar la suspensión a 1.500 x g durante 10 min a 4 ° c, luego deseche el sobrenadante.
   Nota: Utilice el sobrenadante para el aislamiento de las mitocondrias centrifugando a 10.000 x g durante 10 min.
5. Suspender el pellet en tampón de suspensión de núcleos de 1 ml e incubar sobre hielo durante 10 min.
6. Centrifugar a 600 x g durante 10 min desechar el sobrenadante.
7. Suspender el pellet en 1 mL de tampón de suspensión de núcleos y centrifugar de nuevo. Deseche el sobrenadante. El pellet final será núcleos aislados.

7. extracción de proteína

1. Repetir la sección 4, excepto añadir 25 μL del tampón de lisis 1x directamente al pellet de la célula y luego suspenderlo.

8. preparación de la muestra

1. Preparar dos muestras para la SDS-página tomando 10 μL cada uno del extracto de proteína soluble y añadir 10 μL de 2x Laemmli SDS-muestra tampón y 1 μL de 2-Mercaptoetanol (BME).
2. Calentar una muestra durante 5 min a 37 ° c y la segunda muestra durante 15 min a 98 ° c para revertir el enlace cruzado de formaldehído.

9. Análisis de SDS-PAGE

1. Prepare 1 L de 1x Tris-tampón de correr glicina (Tris 25 mM, 192 mM glicina, 0,1% (p/v) SDS).
2. Configure el aparato de ejecución SDS-PAGE.
   Nota: este protocolo utiliza un 16% preast TGX SDS-PAGE. Cabe destacar que cualquier porcentaje de gel se puede utilizar.
   1. Por el protocolo del fabricante, abra el paquete en el que se almacena el gel y extraiga el cassette.
   2. Retire el peine que está alineando los pozos y la cinta de la parte inferior del cassette.
   3. Coloque el gel en el aparato corriente.
   4. Llene la cámara con el amortiguador de corriente 1x hasta que los pozos estén sumergidos en líquido. Con un Pipet de plástico, enjuague los pozos con el tampón de correr.
3. Cargue las muestras en el gel junto con 10 μL de marcador estándar preactivado.
4. Ejecutar el gel a 200 V hasta que el frente de tinte es de aproximadamente 1 cm de la parte inferior del gel.

10. Western Blot

1. Prepare 1 L de buffer de transferencia 1x (Tris de 25 mM, 192 mM de glicina, 20% de metanol) y almacene a 4 ° c hasta su uso.
2. Retire con cuidado el gel y abra el cassette. Con una cuchilla de afeitar, corte y deseche cuidadosamente el gel de apilamiento. Coge el gel usando una esquina y colócalo en una bandeja con tampón de transferencia, permitiendo que se rocía suavemente durante 5 min.
3. Mientras el gel está balanceando, coloque un bloque de hielo (almacenado en-20 ° c) en el tanque de transferencia y agregue el búfer de transferencia a 3/4 lleno.
4. Humedezca la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) remojando el 100% de metanol durante 30 s.
5. Una vez pasados los 5 min, prepárese para configurar la transferencia en una bandeja con búfer de transferencia. El búfer de transferencia debe ser suficiente para sumergir completamente la mancha. Configure la transferencia de la mancha de la siguiente manera: en la parte inferior, la parte inferior del soporte del cassette (negro); luego una esponja gruesa, papel de engorde extra grueso, el gel de poliacrilamida, una membrana de PVDF, papel secante extra grueso, y una esponja gruesa; a continuación, finalmente, la parte superior del soporte de cassette (blanco) en la parte superior.
6. Bloquee el cassette y coloque la unidad en el tanque de transferencia con la membrana PVDF hacia el ánodo positivo y el gel hacia el negativo. Tapa la unidad con búfer de transferencia hasta que la transferencia esté completamente sumergida.
7. Coloque la unidad encima de una placa de agitación. Agregue una barra de agitación a la unidad y empiece a agitar a 125 rpm.
8. Ejecutar a 100 V para 60 min.
9. Mientras se está ejecutando la transferencia, prepare una solución de 5% de leche en polvo disuelta en la solución salina tamponada Tris, con Tween-20, pH 7,5 (TBST).
10. Desmontar la unidad y retirar la membrana, señalando que lado estaba en contacto con el gel; Asegúrese de que este lado permanezca en la bandeja para los pasos restantes.
11. Sumergir la membrana durante 2 min en solución salina tamponada Tris (TBS) seguida de bloqueo de la membrana incubando en 5 mL de solución de leche-TBST al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
12. Sustituir la leche con 4 mL de solución de leche-TBST al 5% y añadir el anticuerpo primario en la dilución adecuada (en este caso, nuestra dilución es 1:2000 para el anticuerpo dUTPase) e incubar durante la noche con balanceo suave a 4 ° c.
13. Al día siguiente, retire la mancha del Rocker de 4 ° c a un balancín de temperatura ambiente, desechando la solución de anticuerpos primarios.
14. Haga tres lavados rápidos con TBST, utilizando suficiente líquido para sumergir completamente la mancha, seguida de 3 lavados, 5 min cada uno, balanceándose lentamente.
15. Después del último lavado, añadir 5 mL de la solución de 5% de leche-TBST y rocía la mancha durante 15 min y luego desechar.
16. Añadir anticuerpo secundario diluido en 5% Milk-TBST a la concentración deseada. (En este caso, 1:5000 dilución de cabra anti-conejo diluido en 5 mL de 5% de solución de leche-TBST)
17. Incubar a temperatura ambiente, balanceando durante 1 h, luego deseche la solución.
18. Haga tres lavados rápidos con TBST seguidos de 3 lavados, 5 min cada uno, balanceándose lentamente, luego deseche el lavado final y añada 5 mL de TBS.
19. Prepare una mezcla de 1:1 de una solución de detección quimiluminiscente ECL (1 mL de cada reactivo para un volumen final de 2 mL) y añádela directamente a la mancha incubando durante 1 min.
20. Retire la membrana usando pinzas y frote la esquina con una toallita de laboratorio, eliminando cualquier exceso de solución. Coloque la membrana en envoltura retráctil y coloque la proteína hacia arriba en un cassette de rayos x.
21. Exponga la membrana a la película de rayos x. El tiempo de exposición variará.

Resultados

Nuclear dUTPase forma un varillaje de disulfuro intermoleculares formando una configuración de dímero estable a través de la interacción de dos residuos de cisteína colocados en el tercer aminoácido de cada proteína monomérica¹¹. Esto se demuestra en la figura 1A, B. Para garantizar que esta vinculación de disulfuro no era una interacción no específica debido a anomalías en la migración en el entorno no re...

Discusión

El método descrito aquí da un protocolo recto para el análisis de complejos multiméricos estabilizados a través de enlaces de disulfuro. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras líneas de cultivo celular, tejidos y organismos que permiten una amplia gama de aplicaciones.

Un paso importante en este procedimiento es garantizar que los enlaces de disulfuro no sean una consecuencia del procedimiento de extracción. Cualquier residuo de cisteína libre puede ser bloqueado usando io...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090