שילוב מערכות SDS ללא הפחתה-דף ניתוח ויצירת קישור כימי כדי לזהות מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים הדיסולריים בתאי היונקים בתרבות

Summary

הקשרים disulfide כבר זמן רב ידועים לייצב את המבנה של חלבונים רבים. שיטה פשוטה לנתח מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי קישורים אלה היא באמצעות ניתוח שאינו מקטין SDS-PAGE. כאן, שיטה זו מומחש על ידי ניתוח isoform גרעינית של דאפס של העצם האנושית קו התאים אוסטאוסרקומה U-2 מערכת ההפעלה.

Abstract

המבנים של חלבונים רבים מיוצבים באמצעות קישורים דיצינטיים בעלי מבנה קוולנטי. בעבודה האחרונה, הקשר הזה מסווג גם כשינוי פוסט-טרנסלייתי. לכן, חשוב להיות מסוגל ללמוד שינוי זה בתאי החיים. שיטה פשוטה לנתח אלה cysteine התייצב מכלולי מערכות הוא באמצעות שיטת שני שלבים של שאינם מצמצמים SDS-ניתוח דף ו פורמלדהיד המקשר החוצה. זו שיטה בשני השלבים הוא יתרון כמו הצעד הראשון כדי לחשוף מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים קשר דיסולפידי בגלל הקלות הטכנית שלה עלות נמוכה של המבצע. כאן, העצם האנושית של קו התאים מערכת ההפעלה U-2 משמש כדי להמחיש שיטה זו על ידי ניתוח במיוחד של isopase גרעינית של דאפס.

Introduction

הקשרים disulfide כבר זמן רב ידועים לייצב את המבנה של חלבונים רבים. בעבודה האחרונה, הקשר הזה מסווג גם כשינוי הפיך לאחר המעבר, מתנהג כמו מיתוג מבוסס cysteine "המאפשר אפנון של פונקציית חלבון, מיקום ואינטראקציה^{1,2, 3,4}. לכן, חשוב להיות מסוגל ללמוד את השינוי הזה. שיטה פשוטה לנתח אלה cysteine התייצב מכלולי מערכות הוא דרך שאינם מצמצמים SDS-ניתוח עמוד⁵. Sds-ניתוח העמוד הוא טכניקה המשמשת במעבדות רבות, שבו ניתן להשיג את התוצאות ולפרש במהירות, בקלות, עם עלויות מינימליות, והוא יתרון על טכניקות אחרות המשמשות לזיהוי הקשרים קשר דיסולפידי כגון ספקטרומטר המוני^{6 ,7} ו קיווטות מעגלית⁸.

צעד חשוב אחד לקבוע אם שיטה זו היא טכניקה מתאימה כדי לסייע במחקר היא לבחון ביסודיות את הרצף העיקרי של חלבון הריבית כדי להבטיח שיש שאריות ציסטאין (s) נוכח. צעד מועיל נוסף הוא לחקור כל מבנה גביש הקודם שפורסם או להשתמש באפליקציה בביואינפורמטיקה כדי לחקור את המבנה תלת מימדי של חלבון הריבית כדי לדמיין היכן שאריות ציסטאין (s) יכול להיות ממוקם. אם השאריות נמצאות על המשטח החיצוני, היא עשויה להיות מועמדת טובה יותר ליצירת הצמדה דיגואנית במקום שאריות ציסטאין הקבורים בתוך המבנה. עם זאת, חשוב לציין כי חלבונים עשויים לעבור שינויים מבניים על אינטראקציות המצע או האינטראקציות חלבון חלבון המאפשר שאריות אלה להיות חשופים גם לסביבה.

זיהה מכלולי מולטימאריק יכול להיות מאומת עם החוצה קישור כימי באמצעות פורמלדהיד. פורמלדהיד הוא האידיאלי cross-מקשר עבור טכניקת אימות זה בשל חדירות התא גבוה החוצה טווח קישור קצר של ~ 2-3 Å, להבטיח זיהוי של אינטראקציות חלבון חלבונים ספציפיים^9,10. כאן, שיטה זו מומחש על ידי ניתוח isoform גרעינית של דאפס של העצם האנושי מערכת התאים אוסטאוסרקומה U-2 OS¹¹. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור קווי תאים אחרים, רקמות ואורגניזמים.

Protocol

1. חסימת שאריות Cysteine חינם באמצעות Iodoamide

1. לגדול U-2 תאים מערכת ההפעלה 6 ס"מ² צלחת ל 50% – 60% שליטה במדיום חיוני מינימלי עם גלוקוז גבוה המכיל 10% סרום העובר העוברי ו 1% נתרן פירובט ב 37 ° צ' ב 5% CO₂.
2. הפוך מלאי טרי של 10 מילימטר מיותר בדיוק לפני השימוש, ולאחר מכן להיפטר כל מגיב בשימוש.
3. להוסיף 0.1 mM ריכוז הסופי של החברה ישירות למדיה של תרבות התא. מטלטל בעדינות את המנה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.

2. קצירת התאים

1. . ומכה את התקשורת מהתאים
2. שטוף את התאים עם 5 מ ל של תמיסת מלח קר פוספט באגירה (PBS) שלוש פעמים. ולאחר מכן מוסיפים 1 מ ל של ה-pbs הקרה.
3. מגרד את התאים מהחלק התחתון של המנה באמצעות מגרד התא. באמצעות מנקז 1 מ ל לצייר את PBS ואת התא ההשעיה ולוותר את כל הנוזל לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
4. סובב את התאים ב 7,500 x g עבור שלושה דקות ב 4 ° c. . ומשאיר את הגלולה מאחור את הגלולה תא ניתן לאחסן ב-80 ° צ' עד העיבוד

3. הפקת חלבון

1. הכינו 100 μL של מאגר פירוק 1x מדולל ב-ddH₂O (ראה טבלת חומרים). הוסף פנילמתילסולולוניל פלוו (PMSF) מיד לפני השימוש 1 מ"מ ריכוז סופי.
2. הוסף 50 μL של מאגר הליזה 1x ישירות לגלולה ולהשעות את התאים. מודקון זה על הקרח למשך 5 דקות.
3. Sonicate עבור 8 s באמצעות מצב פולס קבוע ב 40% (ראה טבלת חומרים לsonicator; להתאים לפי הצורך sonicators שונים), שמירה על התמצית על קרח.
4. ספין התמצית ב 4 ° צ' עבור 5 דקות ב 16,000 x g. הסופרנטאנט הוא שבר החלבון הנמס. ניתן לבצע ניתוח ברדפורד כדי לקבוע ריכוז חלבונים במידת הצורך.

4. הכנה לדוגמא

1. לקחת 10 μL של תמצית חלבון מסיסים ולהוסיף 10 μL של 1x Laemmli SDS-מאגר לדוגמה (4% SDS, 20% גליצרול, 0.004% ברומאופנול כחול, ו 0.125 M טריס-HCl, pH 6.8). אין להוסיף הפחתת ריאגנטים.
2. שמור דגימות על הקרח אם ניתוח SDS העמוד יבוצע באותו יום; לאחסון לטווח ארוך-20 ° c מתאימים. בדיוק לפני הפעלת ג'ל, לחמם את המדגם עבור 5 דקות ב 85 ° c.

5. Vivo פורמלדהיד קרוס-קישור של חלבונים אנדוגניים בתאי מערכת ההפעלה U-2

1. הגדל את תאי מערכת ההפעלה U-2 ב 175 ס"מ² בקבוקון עד 70% – 80% שטף (ראה סעיף 1).
2. לבצע את התגובה פורמלדהיד המקשר
   1. בתוך כיסוי, סדרת מחלקים a 37% פורמלדהיד פתרון שנרכשו ממקורות מסחריים. להוסיף את הקיבעון פורמלדהיד ישירות בינוני לריכוז הסופי של 1% ו-דגירה בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדינה עבור 15 דקות.
   2. כדי להרוות את התגובה, להוסיף 1.25 M גליצין לריכוז הסופי של 0.125 M ו-דגירה בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדינה על הנדנדה עבור 5 דקות.
3. רוחצים את התאים עם 5 מ ל של הערוץ הקר שלוש פעמים. להוריד את התמיסה הסופית של ה-PBS ולהוסיף 10 מ ל של PBS. מגרד את התאים מהחלק התחתון של הבקבוקון באמצעות מגרד תא.
4. באמצעות מנקז 10 מ ל, לצייר את PBS ואת התא ההשעיה ולחלק את כל הנוזל לתוך 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה חרוט. סובב את התאים ב 500 x g עבור 2 דקות ב 4 ° c. . ומשאיר את הגלולה מאחור

6. שבירה של גרעינים

1. הכינו 10 מ ל של מאגר הומוגון: 0.25 M סוכות, 1 מ"מ EDTA, 10 מ"מ HEPES, ו 0.5% BSA ב-pH 7.4. הוסף PMSF מיד לפני השימוש 1 מ"מ ריכוז סופי ו 3mL של מאגר ההשעיה גרעינים (0.1% טריטון X-100 ב PBS).
2. להוסיף 5 מאגר המגון mL ישירות לתוך הגלולה התא ולהשעות לחלוטין. צנטריפוגה את ההשעיה ב 500 x g עבור 2 דקות ב 4 ° c ולאחר מכן להיפטר supernatant.
3. השהה את הגלולה ב -5 מ ל. של מאגר הומוגון השתמש היטב הולם טפלון זכוכית הומוגניצר, דאונס המגון תאים במהירות 10 משיכות/500 סל ד.
4. צנטריפוגה את ההשעיה ב 1,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, ואז להיפטר supernatant.
   הערה: השתמש supernatant עבור בידוד של המיטומטר על ידי תפרידו ב 10,000 x g עבור 10 דקות.
5. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל גרעיני מאגר ההשעיה ו דגירה על הקרח עבור 10 דקות.
6. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
7. השהה את הגלולה בתוך מאגר ההשעיה של גרעינים mL 1 ו צנטריפוגה שוב. . מחק את הסופרנטאנט הגלולה האחרונה תהיה. מבודדת גרעינים

7. הפקת חלבון

1. חזור על סעיף 4, למעט הוספת 25 μL של מאגר הליזה 1x ישירות לגלולה התא ואז השעיית.

8. הכנה לדוגמא

1. להכין שתי דגימות עבור SDS-עמוד על-ידי לקיחת 10 μL כל אחד תמצית חלבון מסיסים ולהוסיף 10 μL של 2x Laemmli SDS-מאגר לדוגמה 1 μL של 2-Mercaptoethanol (BME).
2. לחמם דוגמה אחת עבור 5 דקות ב 37 ° צ' והדגם השני עבור 15 דקות ב 98 ° צ' כדי להפוך את הקישור לחצות פורמלדהיד.

9. SDS-ניתוח עמודים

1. להכין 1 L של מאגר 1 x טריס-גליצין פועל (25 מ"מ Tris, 192 מ"מ גליצין, 0.1% (w/v) SDS).
2. הגדר את המנגנון המפעיל של SDS-PAGE.
   הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-16% מהסדרות tgx sds-עמוד. של הערה, ניתן להשתמש בכל האחוזים ג'ל.
   1. עבור פרוטוקול היצרן, פתח את החבילה שהג'ל מאוחסן בו והסר את הקלטת.
   2. הסר את המסרק שנמצא בציפוי הבארות והקלטת מהחלק התחתון של הקלטת.
   3. הניחו את הג לתוך המנגנון הפועל.
   4. מלא את החדר עם המאגר המפעיל 1x עד שבארות המים בנוזל. באמצעות מחית פלסטיק, לשטוף את הבארות עם מאגר פועל.
3. טען את הדגימות על ג'ל יחד עם 10 μL סמן סטנדרטי מראש.
4. הפעל את ג'ל ב 200 V עד חזית הצבע הוא כ 1 ס מ מהחלק התחתון של ג'ל.

10. כתם מערבי

1. הכינו 1 L של מאגר העברה של 1x (192 מילימטר גליצין, 20% המתנול) והחנות ב 4 ° צ' עד השימוש.
2. הסר את הג בזהירות ופתח את הקלטת. באמצעות תער, לחתוך בזהירות ולמחוק את ג'ל הערימה. להרים את הג באמצעות פינה אחת ולמקם אותו מגש עם מאגר העברה, ומאפשר אותו רוק בעדינות עבור 5 דקות.
3. בעוד הג הוא נדנדה, למקם בלוק קרח (מאוחסן ב-20 ° c) לתוך המיכל להעביר ולהוסיף את מאגר ההעברה כדי 3/4 מלא.
4. להרטיב את הממברנה polyvinylidene (PVDF) הקרום על ידי השרתו ב 100% מתנול עבור 30 s.
5. לאחר שחלפו 5 דקות, היכונו להגדיר את ההעברה במגש עם מאגר העברה. על מאגר ההעברות להיות מספיק כדי להטביע לחלוטין את האבן החשופה. הגדר את ההעברה החשופה כדלקמן: למטה, החלק התחתון של מחזיק הקלטת (שחור); לאחר מכן ספוג עבה, נייר מוכתם עבה במיוחד, ג'ל פוליאקרילמיד, קרום PVDF, נייר עבה במיוחד, וספוג סמיך; לבסוף את החלק העליון של מחזיק הקלטת (לבן) למעלה.
6. נעל את הקלטת ומניחים את היחידה לתוך מיכל ההעברה בעזרת קרום PVDF לכיוון האנאודה החיובי והג'ל לכיוון השלילי. החלק העליון של היחידה עם מאגר העברה עד שההעברה שלך תהיה מלאה לחלוטין.
7. הצב את היחידה על גבי צלחת מהומה. להוסיף בר מהומה ליחידה ולהתחיל ערבוב ב 125 סל ד.
8. רוץ ב 100 V עבור 60 דקות.
9. בעוד העברה פועלת, להכין פתרון של 5% אבקת חלב הומס באגירה מלוחים טריס, עם רצף-20, pH 7.5 (TBST).
10. לפרק את היחידה ולהסיר את קרום, וציין איזה צד היה במגע עם ג'ל; ודא שהצד הזה נשאר למעלה במגש עבור השלבים הנותרים.
11. להשרות את הקרום עבור 2 דקות בתוך מלוחים טריס באגירה (TBS) ואחריו חסימת הקרום על ידי דגירה 5 מ ל של 5% חלב-TBST פתרון עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
12. להחליף את החלב עם טרי 4 מ ל של 5% חלב-TBST הפתרון ולהוסיף את הנוגדן העיקרי על הדילול הנכון (במקרה זה, הדילול שלנו הוא 1:2000 עבור נוגדן דפאסה) ו דגירה בלילה עם הנדנדה עדין ב 4 ° c.
13. למחרת, להסיר את האבן החשופה מ 4 מעלות צלזיוס הנדנדה לטמפרטורת החדר נדנדה, להשליך את פתרון הנוגדן העיקרי.
14. לעשות שלוש שוטף מהיר עם TBST, באמצעות נוזל מספיק כדי להטביע לחלוטין את הכתם, ואחריו 3 שוטף, 5 דקות כל אחד, נדנדה לאט.
15. לאחר השטיפה האחרונה, להוסיף 5 מ ל של 5% חלב הפתרון האחרון סלע האבן החשופה עבור 15 דקות לאחר מכן להשליך.
16. הוסף נוגדן משני מדולל ב 5% חלב-TBST בריכוז הרצוי. (במקרה זה, 1:5000 דילול עז נגד ארנבת מדולל 5 מ ל של 5% חלב-TBST פתרון)
17. דגירה בטמפרטורת החדר, נדנדה עבור 1 h, ואז למחוק את הפתרון.
18. לעשות שלוש שוטף מהיר עם TBST ואחריו 3 שוטף, 5 דקות כל אחד, נדנדה לאט, ואז למחוק את הכביסה הסופית ולהוסיף 5 מ ל של TBS.
19. הכינו תערובת 1:1 של פתרונות זיהוי של ECL (1 מ ל של כל מגיב לכרך הסופי של 2 מ ל) והוסיפו זאת ישירות לדגירה החשופה של 1 דקות.
20. להסיר את הקרום באמצעות מלקחיים ולטפוח על הפינה עם מחיקה מעבדה, הסרת כל פתרון עודף. הניחו את הקרום בעטיפת הכיווץ והניחו את הצד החלבון בתוך קלטת רנטגן.
21. לחשוף את הקרום. לסרט רנטגן זמן החשיפה ישתנה.

תוצאות

מערכת הגרעין הגרעינית יוצרת הצמדה בלתי מולקולרית היוצרת תצורת קשר דיסולפידי יציבה דרך האינטראקציה של שני שאריות ציסטאין ממוקם על חומצת האמינו השלישי של חלבון monomeric¹¹. הדבר מוצג באיור 1A, B. כדי להבטיח שההצמדה הדיאטנית הזו לא היתה אינט?...

Discussion

השיטה המתוארים כאן מעניקה פרוטוקול ישר קדימה לניתוח של מכלולי מולטימאריק התייצב באמצעות קישור דיגופרתי. פרוטוקול זה ניתן בקלות להתאים קווים אחרים תרבות התא, רקמות ואורגניזמים המאפשרים מגוון רחב של יישומים.

צעד חשוב בהליך זה הוא להבטיח את הקישור הדיגופרתי הגילאים אינם תוצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090