Combinando análise de SDS-PAGE não redutora e reticulação química para detectar complexos multiméricos estabilizados por ligações de dissulfeto em células de mamíferos na cultura

Resumo

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Um método simples para analisar complexos multimérica estabilizados por estas ligações é através da análise de SDS-PAGE não-reduzindo. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS.

Resumo

As estruturas de muitas proteínas são estabilizadas através de ligações de dissulfeto covalente. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação em células vivas. Um método simples para analisar estes complexos multimérica cisteína-estabilizados é através de um método de duas etapas de não-reduzindo a análise SDS-PAGE e o cross-linking do formaldehyde. Este método de duas etapas é vantajoso como o primeiro passo para desvendar complexos multiméricos estabilizados por ligações dissulfeto devido à sua facilidade técnica e baixo custo de operação. Aqui, a linha celular do osteosarcoma do osso humano U-2 ósmio é usada para ilustrar este método analisando especificamente o isoforma nuclear de dUTPase.

Introdução

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional reversível, atuando como um "interruptor redox" baseado em cisteína, permitindo a modulação da função protéica, localização e interação^{1,2, 3,4}. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação. Um método simples para analisar esses complexos multiméricos estabilizados com cisteína é através da análise de SDS-PAGE não redutora⁵. A análise de SDS-PAGE é uma técnica usada em muitos laboratórios, onde os resultados podem ser obtidos e interpretados rapidamente, fàcilmente, e com custos mínimos, e são vantajosos sobre outras técnicas usadas para identificar ligações do dissulfide tais como a espectrometria maciça^{6 ,7} e Dicroísmo circular⁸.

Uma etapa importante em determinar se este método é uma técnica apropriada a ajudar em um estudo é examinar completamente a seqüência preliminar da proteína do interesse para segurar lá é resíduo do cisteína (s) atual. Outro passo útil é Pesquisar quaisquer estruturas de cristais anteriores publicadas ou usar uma aplicação de Bioinformática para explorar a estrutura tridimensional da proteína de interesse para visualizar onde os resíduos de cisteína podem ser localizados. Se o resíduo (s) está presente na superfície exterior pode ser um candidato melhor para formar uma ligação dissulfeto em vez de um resíduo de cisteína enterrado no interior da estrutura. No entanto, é importante notar que as proteínas podem sofrer alterações estruturais em interações de substrato ou interações proteína-proteína, permitindo que esses resíduos, em seguida, tornar-se exposto ao ambiente também.

Os complexos multimérica identificados podem então ser verificados com cross-linking químico usando o formaldehyde. O formaldehyde é um cross-linker ideal para esta técnica da verificação devido à permeabilidade elevada da pilha e à extensão cross-linking curta de ~ 2-3 Å, assegurando a deteção de interações específicas da proteína-proteína^9,10. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS¹¹. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para outras linhas celulares, tecidos e organismos.

Protocolo

1. bloqueando os resíduos de cisteína livre usando Iodoacetamida

1. Cresça as pilhas U-2 do ósmio em um prato de 6 cm² a 50%-a confluência de 60% no meio essencial mínimo com glicose elevada que contem o soro bovino fetal de 10% e o piruvato de sódio de 1% em 37 ° c em 5% co₂.
2. Fazer um estoque fresco de 10 mM iodoacetamida apenas antes de usar, em seguida, descartar qualquer reagente não utilizado.
3. Adicione a iodoacetamida de concentração final de 0,1 mM diretamente nos meios de cultura celular. Agitar suavemente o prato à temperatura ambiente durante 2 min.

2. colhendo as células

1. Aspirar a mídia das células.
2. Lave as células com 5 mL de soro fisiológico com tampão fosfato frio (PBS) três vezes. Aspirar a solução de lavagem PBS final e adicionar 1 mL de PBS frio.
3. Raspar as células da parte inferior do prato usando um raspador de células. Usando uma pipeta de 1 mL elaborar o PBS e suspensão celular e dispensar todo o líquido em um 1,5 mL tubo de microcentrífuga.
4. Gire as pilhas em 7.500 x g por três minutos a 4 ° c. Aspirar o PBS, deixando o pellet celular para trás. A pelota da pilha pode ser armazenada em-80 ° c até o processamento

3. extração de proteína

1. Prepare 100 μL de um tampão de Lise 1x diluído em ddH₂O (ver tabela de materiais). Adicionar fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) imediatamente antes de usar para uma concentração final de 1 mM.
2. Adicionar 50 μL do tampão de Lise 1x diretamente à pelota celular e suspender. Incubar isto no gelo durante 5 min.
3. SONICATE para 8 s usando o modo de pulso constante em 40% (ver tabela de materiais para sonicator; ajustar conforme necessário para sonicators diferentes), mantendo o extrato no gelo.
4. Gire o extrato a 4 ° c por 5 min em 16.000 x g. O sobrenadante é a fração protéica solúvel. A análise de Bradford pode ser executada para determinar a concentração da proteína se desejada.

4. preparação da amostra

1. Tomar 10 μL do extrato de proteína solúvel e adicionar 10 μL de um tampão de amostra SDS de Laemmli 1x (4% SDS, 20% de glicerol, 0, 4% de bromofenol azul e 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Não adicione nenhum reagente redutor.
2. Mantenha as amostras no gelo se a análise SDS PAGE será realizada naquele dia; para o armazenamento a longo prazo,-20 ° c é apropriado. Logo antes de executar o gel, aqueça a amostra por 5 min a 85 ° c.

5. in vivo formaldeído cross-linking de proteínas endógenas em células U-2 OS

1. Aumente as células U-2 do sistema operacional em um 175 cm² frasco para 70% – 80% de confluência (ver seção 1).
2. Realize a reação de reticulação de formaldeído
   1. Em uma capa de fumaça, alíquota uma solução de formaldeído 37% comprado de fontes comerciais. Adicionar o fixador de formaldeído diretamente ao meio para uma concentração final de 1% e incubar à temperatura ambiente com agitação suave por 15 min.
   2. Para saciar a reação, adicionar 1,25 M glicina a uma concentração final de 0,125 M e incubar à temperatura ambiente com agitação suave em um roqueiro por 5 min.
3. Lave as células com 5 mL de PBS frio três vezes. Aspirar a solução de lavagem PBS final e adicionar 10 mL de PBS. Raspar as células da parte inferior do balão usando um raspador de células.
4. Usando uma pipeta de 10 mL, desenhe o PBS e a suspensão celular e dispense todo o líquido em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Gire as células em 500 x g por 2 min a 4 ° c. Aspirar o PBS, deixando o pellet celular para trás.

6. fraccionamento dos núcleos

1. Prepare 10 mL de tampão de homogeneização: 0,25 M sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES e 0,5% BSA em pH 7,4. Adicione PMSF imediatamente antes de usar para uma concentração final de 1 mM e 3mL de amortecedor de suspensão de núcleos (0,1% Triton X-100 em PBS).
2. Adicione o amortecedor da homogeneização de 5 mL diretamente à pelota da pilha e suspenda completamente. Centrifugue a suspensão em 500 x g por 2 min a 4 ° c e descarte o sobrenadante.
3. Suspenda a pelota em 5 mL de tampão de homogeneização. Use um homogeneizador apertado-encaixe do vidro-Teflon, dounce Homogeneize pilhas em 10 cursos/500 rpm.
4. Centrifugue a suspensão a 1.500 x g durante 10 min a 4 ° c e, em seguida, descarte o sobrenadante.
   Nota: Use o sobrenadante para o isolamento de mitmitoas por centrifugação em 10.000 x g por 10 min.
5. Suspenda o pellet em 1 mL núcleos amortecedor de suspensão e incubar no gelo por 10 min.
6. Centrifugue em 600 x g por 10 min. descarte o sobrenadante.
7. Suspenda o pellet em 1 mL núcleos amortecedor de suspensão e centrífuga novamente. Descarte o sobrenadante. A pelota final será núcleos isolados.

7. extração de proteína

1. Repita a seção 4, exceto adicionando 25 μL do tampão da lise 1x diretamente ao pellet da pilha que suspende então.

8. preparação da amostra

1. Prepare duas amostras para SDS-PAGE tomando 10 μL cada um do extrato solúvel da proteína e adicione 10 μL do tampão da SDS-amostra de 2x Laemmli e 1 μL do 2-mercaptoethanol (BME).
2. Aqueça uma amostra por 5 min a 37 ° c e a segunda amostra por 15 min a 98 ° c para inverter a ligação cruzada de formaldeído.

9. análise SDS-PAGE

1. Prepare 1 L de tampão running da Tris-glicina 1x (25 milímetros Tris, 192 milímetros de Glycine, 0,1% (w/v) SDS).
2. Configure o dispositivo de execução SDS-PAGE.
   Nota: este protocolo utiliza um 16% pré-moldado TGX SDS-PAGE. De notar, qualquer percentagem de gel pode ser usado.
   1. Por o protocolo do fabricante, abra o pacote que o gel é armazenado dentro e remova a gaveta.
   2. Retire o pente que está alinhando os poços e a fita da parte inferior da gaveta.
   3. Coloque o gel no aparelho em funcionamento.
   4. Encha a câmara com o tampão de funcionamento 1x até que os poços estejam submersos no líquido. Usando um Pipet plástico, enxague para fora os poços com o amortecedor running.
3. Coloque as amostras no gel juntamente com 10 μL de marcador padrão pré-esforcido.
4. Execute o gel em 200 V até que a parte dianteira da tintura esteja aproximadamente 1 cm da parte inferior do gel.

10. borrão ocidental

1. Preparar 1 L de tampão de transferência 1x (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% metanol) e conservar a 4 ° c até ao seu uso.
2. Retire cuidadosamente o gel e abra a gaveta. Usando uma navalha, cuidadosamente cortar e descartar o gel de empilhamento. Pegue o gel usando um canto e coloque-o em uma bandeja com tampão de transferência, permitindo que ele balanç suavemente por 5 min.
3. Enquanto o gel está balançando, coloque um bloco de gelo (armazenado em-20 ° c) no tanque de transferência e adicione o buffer de transferência para 3/4 completo.
4. Molhe a membrana do fluoreto do polivinilideno (PVDF) mergulhando o no metanol de 100% para 30 s.
5. Uma vez que os 5 min passaram, prepare-se para configurar a transferência em uma bandeja com buffer de transferência. O buffer de transferência deve ser suficiente para submergir completamente a mancha. Configurar a transferência blot da seguinte forma: na parte inferior, na parte inferior do suporte da gaveta (preto); Então uma esponja grossa, papel de blotting grosso extra, o gel do poliacrilamida, uma membrana de PVDF, papel de blotting grosso extra, e uma esponja grossa; em seguida, finalmente, a parte superior do suporte da gaveta (branco) na parte superior.
6. Trave a gaveta e coloc a unidade no tanque de transferência com a membrana de PVDF para o ânodo positivo e o gel para o negativo. Cubra a unidade com o buffer de transferência até que sua transferência esteja completamente submersa.
7. Coloque a unidade no topo de uma placa de agitação. Adicione uma barra de agitação para a unidade e começar a mexer em 125 RPM.
8. Executar em 100 V por 60 min.
9. Enquanto a transferência está sendo executada, prepare uma solução de 5% de leite em pó dissolvido em soro fisiológico com tampão Tris, com Tween-20, pH 7,5 (TBST).
10. Desmontar a unidade e remover a membrana, observando que lado estava em contato com o gel; Assegure-se de que este lado permaneça na bandeja para as etapas restantes.
11. Mergulhe a membrana por 2 min em salina Tris-tamponada (TBS) seguida bloqueando a membrana incubando em 5 mL da solução de leite-TBST de 5% por 30 minutos na temperatura ambiente.
12. Substitua o leite por uma solução fresca de 4 mL de leite-TBST a 5% e adicione o anticorpo primário à diluição adequada (neste caso, a nossa diluição é 1:2000 para o anticorpo dUTPase) e incubar durante a noite com balanço suave a 4 ° c.
13. No dia seguinte, retire a mancha do balancim de 4 ° c para um balancim de temperatura ambiente, descartando a solução de anticorpos primários.
14. Faça três lavagens rápidas com TBST, usando o suficiente líquido para submergir completamente o borrão, seguido por 3 lavagens, 5 min cada, balançando lentamente.
15. Após a última lavagem, adicionar 5 mL da solução de leite-TBST de 5% e agitar o Borrão por 15 minutos e depois descartar.
16. Adicionar anticorpo secundário diluído em 5% de leite-TBST na concentração desejada. (Neste caso, 1:5000 diluição do anti-coelho de cabra diluído em 5 mL de solução de 5% de leite-TBST)
17. Incubar à temperatura ambiente, balançando por 1 h, em seguida, descartar a solução.
18. Faça três lavagens rápidas com TBST seguido por 3 lavagens, 5 min cada, balançando lentamente, em seguida, descartar a lavagem final e adicionar 5 mL de TBS.
19. Prepare uma mistura 1:1 de soluções de detecção quimioluminescente ECL (1 mL de cada reagente para um volume final de 2 mL) e adicione-a diretamente à mancha incubando por 1 min.
20. Retire a membrana usando pinças e DAB o canto com uma limpeza de laboratório, removendo qualquer solução em excesso. Coloc a membrana no envoltório do psiquiatra e coloc o lado da proteína acima em uma gaveta do raio x.
21. Expor a membrana de filme de raios-x. O tempo de exposição variará.

Resultados

A dUTPase nuclear forma uma articulação dissulfeto intermolecular formando uma configuração de dímero estável através da interação de dois resíduos de cisteína posicionados no terceiro aminoácido de cada proteína monomérica¹¹. Isto é demonstrado na Figura 1a, B. Para garantir que essa articulação dissulfeto não foi uma interação não específica devido a anormalidades migratórias no ambiente não r...

Discussão

O método esboçado aqui dá um protocolo reto-forward para a análise de complexos multimérica estabilizados através dos LINKAGES do dissulfide. Este protocolo pode facilmente ser adaptado a outras linhas da cultura de pilha, tecidos e organismos permitindo uma escala de aplicações larga.

Um passo importante neste procedimento é garantir que as ligações dissulfeto não são uma consequência do procedimento de extração. Qualquer resíduo de cisteína livre pode ser bloqueado usando i...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090