اعداد انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة للتحليل البنيوي الهيكلي للتوزيع الحويصلة المتشابكة في المحطات العصبية

Summary

ونحن وصف إجراءات لمعالجه انسجه المخ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الدقة لتحليل مورفرومتري من توزيع الحويصلات متشابك في المحطات العصبية. الرسوم البيانية التي تم الحصول عليها مع هذه الأساليب يمكن أيضا ان تستخدم لدراسة المورفولوجية لعدد من المكونات الخلوية الأخرى وعلاقتاتها الهيكلية الابعاد.

Abstract

وقد استغل مختبرنا وغيرها الكثير من قوه حل عاليه من انتقال المجهر الكترون لدراسة المورفولوجية والتنظيم المكاني من الحويصلات متشابك. من أجل الحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الجودة التي يمكن ان تسفر عن درجه من التفاصيل المورفولوجية اللازمة للتحليل الكمي للتوزيع قبل متشابك الحويصلة ، اعداد العينة الأمثل أمر بالغ الاهميه. التثبيت الكيميائي هو الخطوة الاولي في عمليه اعداد العينات ، وذات اهميه قصوى للحفاظ علي البنية الدقيقة. تثبيت الاوعيه الدموية مع محلول الفورمالديهايد جلوتارالدهيد ، تليها معالجه العينات الذبذبات مع الاوزميوم tetroxide ، تستقر الحد الأقصى لعدد الجزيئات ، وخاصه البروتينات والدهون ، والنتائج في الحفظ المتفوق من البنية الفوقية. ثم تتم معالجه الانسجه مع المضادة للتلوين ، والجفاف متسلسلة والراتنج التضمين. ان تلطيخ كتله مع خلات اليورانيل (اي ، تلطيخ الانسجه الذبذبات الداخلية قبل التضمين الراتنج) يعزز التباين الذاتية وتستقر مكونات الخلية ضد الاستخراج اثناء معالجه العينات. ويمكن زيادة التباين من خلال تطبيق خلات اليورانيل كوصمه عار علي أقسام سامسونج. المزدوج تلطيخ المقاطع سامسونج مع سترات الرصاص بعد العلاج خلات اليورانيل يحسن أيضا دقه الصورة ، من خلال تكثيف الكترون التعتيم من الهياكل التي تحتوي علي حمض نووي من خلال ملزمه انتقائية من الرصاص إلى خلات اليورانيل. المجهر الكترون الإرسال هو أداه قويه لتوصيف التفاصيل المورفولوجية من الحويصلات متشابك والتقدير الكمي من حجمها والتنظيم المكاني في محطه بوتون. ومع ذلك ، لأنه يستخدم الانسجه الثابتة ، ونقل المجهر الكترون لا يمكن الا ان توفر معلومات غير مباشره فيما يتعلق بالحياة أو العمليات المتطورة. ولذلك ، ينبغي النظر في التقنيات الأخرى عندما يكون الهدف الرئيسي هو دراسة الجوانب الديناميكية أو الوظيفية لعمليات الاتجار بالحويصلات المتشابكة وندره المحببات.

Introduction

ونحن وصف أساليب لاعداد انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الكترونات عاليه الجودة المجهرية للتحليل في العمق مورفمتري من التوزيع المكاني فيجليد متشابك في المحطات العصبية^1،2. ويمكن أيضا استخدام الرسومات المجهرية عاليه التباين التي يمكن الحصول عليها من خلال معالجه العينات بعد هذه الطرق لدراسة المورفولوجية التفصيلية لعدد من المكونات الخلوية وعلاقتاتها الهيكلية الابعاد^3,4.

المجهر الكترون الإرسال (TEM) هو أداه قويه لدراسة المورفولوجية من العضيات وغيرها من الهياكل الخلوية كميا. اعتبارا من هذا العقد ، لا توجد طرق أخرى للتحقيق التي يمكن ان توفر نفس الدرجة من القرار من الاغشيه الدهنية والعضوية بدون وضع العلامات المناعية ، باستثناء كريوفيكسيشن بالضغط العالي التجميد. ومع ذلك ، لا تستخدم تقنيات استبدال التجميد علي نطاق واسع ، وتتطلب عاده معدات باهظه الثمن وأوقات اعداد طويلة.

من أجل الاستفادة من قوه الحل العالية لل TEM ، يعد الاعداد الأمثل للعينه أمرا بالغ الاهميه. الأهداف الرئيسية لاعداد العينات هي الحفاظ علي بنيه الانسجه مع الحد الأدنى من التغيير من الدولة الحية ، وتعزيز النقيض من العينة ، واستقرار الانسجه ضد استخراج المكونات الخلوية اثناء المعالجة والتعرض للكترون شعاع. وقد أدخلت العديد من البروتوكولات لاعداد الانسجه TEM والكمال من قبل العديد من المختبرات علي مر السنتين. وقد ركزت العديد منهم علي أساليب التصور الأمثل من الحويصلات متشابك⁵,^6,7,8,9,^10,11. من بين عدد من الأساليب الراسخة ، والذهب القياسية المستخدمة حاليا ، اخترنا إجراءات لتثبيت الكيميائية ، وتثبيت وظيفة ، وتلطيخ كتله ، والجفاف متسلسلة ، وتضمين الراتنج واخر تلطيخ التي تهدف إلى الحفاظ علي هيكل الانسجه الأمثل تحقيق التباين صوره ممتازة. من الملاحظة ، يمكن ان يكون الحفاظ علي البنية الدقيقة صعبا بشكل خاص عند العمل مع انسجه المخ الفئران حديثي الولادة. في الواقع ، يتميز الجهاز العصبي المركزي للحيوانات الصغيرة جدا بمحتوي المياه اعلي من الدماغ الكبار ، وتوسيع أكثر بروزا من المساحات خارج الخلية ، والاتصالات أكثر مرونة بين الخلايا¹². وهذا يجعل انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة حساسة للغاية للتغيرات في osmolarity ، وعرضه بشكل رائع لانكماش الارتيقيه و/أو تورم عند معالجتها من خلال حلول متسلسلة من قوه انقباض مختلفه¹². ولذلك ، استخدمت أساليبنا الحلول لمعالجه العينات التي هي من الاسموليه أقرب ما يمكن إلى ان من الفئران الوليد الدماغ. وكان هدفنا الحصول علي صور عاليه الجودة وعاليه الدقة المجهر الكتروني للتقييم الكمي للتوزيع المكاني لحويصلات متشابك في المحطات العصبية. علي وجه التحديد ، سعينا لقياس عدد الحويصلات داخل المحطة العصبية ، والمسافة من الحويصلات متشابك من غشاء البلازما قبل متشابك ، وعدد من الحويصلات رست في الغشاء قبل متشابك ، وحجم الحويصلات متشابك المسافات بين الحويصلات¹.

التثبيت الكيميائي المرضي هو شرط أساسي للحصول علي الرسوم المجهرية الكترون عاليه الجودة التي يمكن ان توفر التفاصيل المورفولوجية اللازمة لدراسة التشكل الحويصلة المتشابكة والتنظيم المكاني. علي الرغم من وجود عده طرق للتثبيت, تثبيت انسجه المخ عن طريق التروية الوعائية هو بالتاكيد متفوقة علي أساليب أخرى. منذ التثبيت عن طريق التروية الوعائية يبدا مباشره بعد إلقاء القبض علي الدورة الدموية الجهازية ، فانه يقصر الفاصل الزمني بين الاكسده من انسجه المخ وعبر ربط البروتينات مع المثبتات ، مما ادي إلى الحد الأدنى من التعديلات في الخلية هيكل. وعلاوة علي ذلك ، فانه يحقق اختراق سريع وموحد ، وذلك بسبب التدفق السريع من المثبت من سرير الاوعيه الدموية إلى المقصورات خارج الخلية والخلوية^12،13،14. التثبيت الاولي مع غلوتارالديهيد ، تليها التثبيت الثانوي (بعد التثبيت) مع الاوزميوم tetroxide ، غله ممتازة الحفاظ علي هيكل غرامه^15،16،17. مزيج من غلوتارالديهيد وبارافورمالدهيد لديه ميزه اضافيه لاختراق أكثر سرعه في الانسجه¹².

نظرا لان الانسجه البيولوجية ليست جامده بما فيه الكفاية ليتم قطعها إلى أقسام رقيقه دون دعم مصفوفة الراتنج ، فانها تحتاج إلى ان تكون جزءا لا يتجزا في وسط قبل التقطيع رقيقه. المياه-immiscible راتنجات الايبوكسي تستخدم عاده كوسيلة التضمين في TEM. عند استخدام هذا النوع من المصفوفة ، يجب استبدال جميع المياه المجانية للعينه بمذيب عضوي قبل تسلل الراتنج. يتم أزاله المياه عن طريق تمرير العينة من خلال سلسله من الحلول لتركيزات تصاعدية من الايثانول و/أو الأسيتون¹². في هذا البروتوكول ، والعينات هي أول شقه جزءا لا يتجزا بين أوراق aclar مرنه ، ثم جزءا لا يتجزا في كبسوله. والنتيجة النهائية هي الانسجه التي تقع في طرف كتله الراتنج أسطواني ، والتي لديها الهندسة المثالية لتكون اقل تاثرا بالاهتزازات الناشئة خلال ميكروتومي التماس.

تلطيخ مع المعادن الثقيلة لتعزيز التباين الانسجه الذاتية هو جانب آخر مهم من اعداد العينة. ويرجع تباين الصورة في TEM إلى تشتت الكترونات بواسطة الذرات في الانسجه. ومع ذلك ، تتكون المواد البيولوجية إلى حد كبير من جزيئات منخفضه الوزن الذري (اي الكربون والهيدروجين والأكسجين والنيتروجين). ولذلك ، فان توليد تباين التشتت الكافي يتطلب دمج ذرات الوزن الذري العالية في المكونات الخلوية للانسجه. ويتحقق ذلك من خلال تلطيخ العينة مع المعادن الثقيلة^12،18،19. الاوزميوم tetroxide ، واليورانيوم والرصاص ، والتي تربط بقوة للدهون ، هي المعادن الثقيلة الأكثر شيوعا المستخدمة كبقع الكترون.

الاوزميوم (الرقم الذري 76) هي واحده من المعادن الأكثر كثافة في الوجود. وهو علي حد سواء المثبت ووصمه عار, علي الرغم من ان دورها الأساسي في TEM كما هو مثبت موثوق¹². من بين بروتوكولات التثبيت المختلفة في الاستخدام ، وطريقه التثبيت المزدوج مع غلوتارالديهيد تليها الاوزميوم هو الأكثر فعاليه في الحد من استخراج مكونات الخلية اثناء اعداد العينة. وتستخدم هذه المثبتات اثنين لتحقيق الاستقرار في الحد الأقصى لعدد من أنواع مختلفه من الجزيئات ، وخاصه البروتينات والدهون ، ويؤدي إلى الحفاظ علي متفوقة من الانسجه البنية العالية^{12،14،15، 16 , السابعة عشره}

اليورانيوم (الرقم الذري 92) هو أثقل المعادن المستخدمة كبقعه الكترون ، ومعظمها عاده في شكل خلات اليورانيل. بالمثل إلى الاوزميوم, يتصرف هو بما ان وصمه عار ومثبت, رغم ان دوره أساسيه في [تيم] كوصمه عار^20,21. الأحماض النووية التي تحتوي علي والهياكل غشائي ملطخه بشده وبشكل تفضيلي مع أملاح اليورانيل في الدهيد-الانسجه الثابتة^22،23. علاج الانسجه مع خلات اليورانيل بعد osmication وقبل الجفاف يؤدي إلى استقرار غشائي والبني التي تحتوي علي الأحماض النووية ، فضلا عن التباين المعزز ، ويسمح بتحديد بعض التفاصيل الهيكلية التي لن يمكن الكشف عنها بسهوله في عينات ملطخه الاوزميوم وحدها^12،24،25. ويعتقد ان خلات اليورانيل قد استقرار هيكل غرامه من خلال الجمع بين مع انخفاض الاوزميوم التي تم إيداعها علي اغشيه الدهون خلال osmication²⁴. ويتحقق الحد الأقصى من التباين عندما يتم تطبيق خلات اليورانيل قبل تضمينها وباعتبارها بعد وصمه عار في المقاطع رقيقه¹².

الرصاص (الرقم الذري 82) هو وصمه عار الأكثر شيوعا المستخدمة لل TEM ويستخدم أساسا لما بعد تلطيخ من أقسام رقيقه. أملاح الرصاص لديها التعتيم الكترون عاليه وإظهار تقارب لمجموعه واسعه من الهياكل الخلوية ، بما في ذلك الاغشيه والبروتينات النووية والخلوية ، والأحماض الامينيه والجليكوجين^26،27. عندما يتم استخدام طريقه تلطيخ مزدوجة (اي ، تلطيخ مع خلات اليورانيل متبوعا بالعلاج مع الرصاص) ، وهذا الأخير بمثابه مطور من تلطيخ خلات اليورانيل. علي سبيل المثال ، يؤدي بعد تلطيخ الكروماتين الثابتة مع غلوتارالديهيد يزيد امتصاص اليورانيل خلات بعامل من ثلاثه^{28، 29،30،31،32}. الرصاص يعزز أيضا تلطيخ المنقولة من المعادن الأخرى مثل الاوزميوم. ويعتقد ان الأملاح الرصاص وصمه عار الاغشيه من الانسجه الاوزميوم الثابتة عن طريق ربط للمجموعة القطبية من الفوسفاتيدات في وجود انخفاض الاوزميوم³³. عيب محتمل من تلطيخ مع كل من خلات اليورانيل والرصاص ، وخاصه بالنسبة لفترات طويلة ، هو ان العديد من العناصر الهيكلية المختلفة ملطخه بالتساوي وغير علي وجه التحديد ، التالي قد لا يكون من السهل تمييزها عن بعضها البعض¹² .

الإدخال الأخير لمصادر الضوء البديلة ، مثل المجهر الضوئي البصري فائق الدقة المنشط للصور ، قد تحسن بشكل كبير من دقه المجهر الضوئي³⁴. ومع ذلك ، نظرا لان المجهر الضوئي يعتمد علي الطرق الكيميائية النسيجية والمناعية-الكيميائية لتصور البروتينات أو الانزيمات الموسومة بشكل فردي ، فان قوه TEM لعرض جميع العناصر الهيكلية في ان واحد تبقي غير مسبوقة للدراسة المتعمقة علاقات المورفولوجية والابعاد لهياكل الانسجه. علي وجه الخصوص ، لا يمكن لأي تقنيه أخرى توفير التفاصيل المورفولوجية اللازمة لاجراء تحليل مورفرومتري من توزيع الحويصلات متشابك في العصب العصبي قبل متشابك. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان الرسوم المجهرية الكترون التقاط هيكل النسيج بعد وفاه الكائن الحي ، التالي فانها لا يمكن ان توفر معلومات بشان ديناميات الاتجار بالحويصلات قبل متشابك والانتشار. التالي, أدوات أخرى, مثل التصوير الحية FM صبغ والتصحيح المشبك الكهربائية, وينبغي النظر عندما يكون الهدف الرئيسي هو دراسة الجوانب الحيوية و/أو الوظيفية من الاتجار بالحويصلات متشابك وكثرة المحببات.

Protocol

وتمت الموافقة علي جميع الدراسات من قبل اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها في جامعه فيرجينيا (شارلوتسفيل, VA) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة.

1. تثبيت بواسطة Perfusion الاوعيه الدموية

ملاحظه: وصف عام للأسلوب الفئران الاوعيه الدموية ترويه وقد سبق تفصيلها في هذه المجلة¹³ وخارج نطاق هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فان الخطوات التالية محدده لاعداد انسجه المخ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الجودة للتحليل الكمي للتوزيع الحويصلات متشابك في محطات ما قبل متشابك.

1. تحضير 4% بارافورمالدهيد
   1. مكان 800 mL من 0.1 M الفوسفات العازلة (PB) في كوب الزجاج 2 لتر علي لوحه التحريك تحت غطاء الدخان. الحرارة إلى ما يقرب من 60 درجه مئوية دون غلي العازلة.
   2. أضافه 40 غرام من مسحوق بارافورمالدهيد. يحرك باستمرار
   3. في حين قياس درجه الحموضة ، أضافه قطرات صغيره من 10 N NaOH حتى يتم مسح الحل. يجب ان يكون الأس الهيدروجيني النهائي 7.2-7.4.
   4. أضافه المتبقية 0.1 M PB إلى الحجم النهائي من 1 لتر. اسمحوا بارد ، فلتر مع غشاء 0.45 μm وتخزين في 4 °C بين عشيه وضحيها.
      ملاحظه: اعداد بارافورمالدهيد الطازجة في اليوم قبل perfusion.
      تحذير: استنشاق أبخره الديهيد يمكن ان يسبب اعراض الأنف وتهيج مجري التنفس. الاحتكاك بالجلد يسبب التهاب الجلدي. يجب التعامل مع الديهيديس في غطاء الدخان اثناء ارتداء القفازات والعباءة الواقية ونظارات الأمان
2. اعداد حل تيرودي
   1. ضع 1 لتر من الماء المقطر في كوب زجاجي علي لوحه تحريك. أضف كلوريد الصوديوم (8 غرام) ، KCl (0.15 g) ، CaCl₂ (0.1 g) ، mgcl₂ (0.006 غرام) ، الجناح₂PO₄ (0.055 g) ، نهاسكو₃ (1 غرام) وسكر العنب (1 غرام) في الدورق.
   2. يحرك باستمرار وقياس درجه الحموضة. الحفاظ علي درجه الحموضة بين 7.2 و 7.4.
      ملاحظه: تيرودي الحل هو أيضا متاحه تجاريا.
3. مزيج 4 ٪ بارافورمالدهيد مع غلوتارالديهيد في تركيز النهائي من 2 ٪. أضافه 40 mL من الكترون المجهر الصف 50 ٪ غلوتارالدهيد إلى 1 لتر من 4 ٪ بارافورمالدهيد. اخلطي جيدا في طبق التحريك
   ملاحظه: وهناك حاجه إلى ما يقرب من 100 مل من محلول التثبيت البارافورمالدهيد-غلوتارالديهيد لحقنت الجسم من الفئران حديثي الولادة. لذلك ، لا يقل عن 10 الفئران حديثي الولادة يمكن perfused مع 1 لتر من fixative. لا تخلط بارافورمالدهيد والغلوتارالدهيد حتى قبل الاستخدام مباشره. جلب جميع الحلول لدرجه حرارة الغرفة قبل perfusion.
4. مره واحده وقد اكتسبت الوصول إلى البطين الأيسر (انظر بروتوكول ترويه الحيوانية كله¹³), مسح نظام الاوعيه الدموية مع حل تيرودي ل 30 s في ضغط ترويه من 120 مم زئبق.
   ملاحظه: يعتمد نجاح التروية جزئيا علي الاستبعاد الكامل للدم من السرير الوعائي
5. دافق مع محلول البارافورمالدهيد-غلوتارالديهيد في نفس الضغط لمده 10 دقيقه.
   ملاحظه: الحفاظ علي ضغط ترويه المستمر أمر ضروري لتجنب إدخال التحف. الاضافه إلى ذلك ، فان درجه الحرارة من perfusate لا ينبغي ان تكون اقل من درجه حرارة الجسم الفئران لتجنب تضيق الاوعيه
6. أزاله الدماغ الثابت من الجمجمة ومكان في الطازجة بارافورمالدهيد-غلوتارالديهيد مثبت في 4 °c بين عشيه وضحيها.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. تشريح المخ

1. تضمين الدماغ الثابتة في 4 ٪ اجنشا والغراء كتله الدماغ-اجنشا علي مرحله الذبذبات
   ملاحظه: وقد حصلت مختبرات أخرى علي أقسام ذات نوعيه جيده من خلال تحقيق كتله مستقره علي الذبذبات دون دعم أجار
2. مقطع شرائح من سمك 50 μm. تعيين ميكروتومي إلى التردد المنخفض والسرعة.
   ملاحظه: يمكن تخزين الأقسام في 0.1 M PB مع 0.05 ٪ الصوديوم أزيد في 4 درجه مئوية لعده سنوات.
3. وضع الأقسام في 0.1 M PB في طبق بيتري ، ودراسة الأقسام تحت المجهر تشريح واختيار العينات لتضمين
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

3. الشطف

ملاحظه: من المهم شطف العينة بعد التثبيت مع الديهيديس وقبل التثبيت مع الاوزميوم ، لان المثبتات المتبقية قد تنتج الاوزميوم رواسب

1. ماصه 0.1 M PB إلى قارورة زجاجيه قصيرة وواسعة الفم مع غطاء. ضع عينه واحده لكل قنينة. تغطيه كامله للعينه بحيث لا تجف.
   ملاحظه: الحفاظ علي العينات في نفس القارورة من هذه الخطوة من خلال جميع التغييرات الحل من التثبيت ، والجفاف والتسلل ، حتى انها مستعدة لتضمين شقه.
2. شطف العينة في 0.1 M PB لمده 3 دقائق × 2 ، ثم أزاله PB مع ميكروماص.
   ملاحظه: منذ الدماغ من الفئران حديثي الولادة حساسة للغاية للتغيرات في الاسموليه^12,35,36,37, تنفيذ الغسيل في نفس السيارة كما ان المستخدمة في المخلوط المثبت

4. بعد التثبيت مع الاوزميوم

1. اعداد الاوزميوم تيروكسيد (اوسو₄)
   ملاحظه: يستخدم مختبر هذا المؤلف اوسو₄ 4 ٪ المقدمة في محلول مائي في أمبولات زجاجيه (5 مل من اوسو₄ 4 ٪ في ح₂س). وقد استخدمت مختبرات أخرى اوسو₄ بلورات بنجاح. ومع ذلك ، عده ساعات ضرورية لأذابه البلورات اوسو₄ في السيارة.
   1. خذ 5 مل (أمبوله واحده) من 4 ٪ OsO₄/H₂O ، فتحه ووضعه في زجاجه الزجاج البني
      ملاحظه: اوسو₄ هو عامل مؤكسد قوي ويقلل بسهوله عن طريق التعرض للضوء. ويمكن تجنب الحد اثناء التحضير عن طريق وضع اوسو₄ في زجاجه الزجاج البني
   2. أضافه 5 مل من 0.2 M PB. وهذا سوف تسفر عن 10 مل من 2 ٪ اوسو₄/0.1 M PB.
      ملاحظه: منذ الدماغ من الفئران حديثي الولادة حساسة للغاية للتغيرات في osmolarity ، واستخدام نفس المخزن المؤقت لاعداد المثبتات الدهيد و OsO₄ الحل^{12،35،36،37}
   3. أضافه 10 مل اضافيه من 0.1 M PB. وهذا سوف تسفر عن حل نهائي من 20 مل من 1 ٪ OsO₄ في 0.1 m PB.
   4. استخدم حقنه 20 مل مزوده بابره طويلة لرسم 1 ٪ OsO₄ ووضعها في زجاجه الزجاج البني أو قارورة scint مغطاه رقائق ألومنيوم.
      تحذير: اوسو₄ متقلبة للغاية وأبخرها سامه للأنف والعينين والحلق. يجب ان يتم تنفيذ جميع الاعمال في غطاء الدخان باستخدام القفازات والملابس الواقية ، ولا ينبغي ان يتعرض اي جزء من الجسم إلى اوسو₄. وينبغي ان يتم المناولة والتخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة الخاصة بك. تخزين الغير المستخدمة OsO₄ في زجاجه الزجاج البني باحكام مع بطانة تفلون علي سداده الزجاج ، التفاف الزجاجة في إحباط ألومنيوم مزدوجة وتخزينها في ديسيكاتور. في وجود أبخره تسرب ، يمكن اوسو₄ تلطيخ الأسطح الداخلية ومحتويات الثلاجة. تحت ظروف التخزين المذكورة أعلاه الحل اوسو₄ مستقره لعده أشهر. عند الحصول علي أكسده الحلول اثناء التخزين ، فانها تتحول الرمادي ، وفي هذه الحالة تحتاج إلى التخلص منها.
2. أضافه 1 ٪ OsO₄ في 0.1 M PB في قارورة العينة والسماح للجلوس 1 ح. استخراج اوسو₄ بعد 1 ح مع ميكروماص.
   ملاحظه: قبل تطبيق اوسو₄ علي القسم ، من المهم ان تتكشف وتسطيح العينة. تجنب التطبيق مباشره علي الجزء العلوي من العينة ، بدلا من استخدام جدران القارورة لتنقيط بلطف اوسو₄ إلى الجزء السفلي من القارورة. العينة يصبح البني وجامده بعد وقت قصير من التطبيق اوسو_{4 .} التعامل برفق من الآن فصاعدا لتجنب تلف الانسجه

5. الشطف

ملاحظه: من المهم شطف العينة بعد التثبيت مع اوسو₄ وقبل الجفاف ، لان المثبتات المتبقية قد تتفاعل مع عوامل الجفاف³⁷.

1. شطف مع 0.1 M PB لمده 3 دقائق × 3.
   ملاحظه: منذ الدماغ من الفئران حديثي الولادة حساسة بعمق للتغيرات في osmolarity ، وتنفيذ الغسيل في نفس السيارة كما ان المستخدمة في الخليط المثبت^{12،35،36،37}.
2. وضع الحل الاوزميوم وأول اثنين من الرصاص البرميل إلى اوسو₄ النفايات والتخلص منه وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة الخاصة بك.

6. الجفاف متسلسلة وتلطيخ مع خلات اليورانيل

ملاحظه: يستخدم مختبر هذا المؤلف راتنجات الايبوكسي المائية لتضمينها. عند استخدام راتنجات الايبوكسي ، يجب استبدال جميع المياه المجانية للعينه بمذيب عضوي قبل التسلل بواسطة الوسط المضمن. تتم أزاله المياه عن طريق تمرير العينة من خلال سلسله من الحلول لتركيزات تصاعدية من الايثانول والأسيتون¹².

1. اعداد خلات اليورانيل (UA)
   1. وضع 200 mL قارورة الزجاج الحجمي التي تحتوي علي 100 mL من EtOH 70 ٪ علي لوحه التحريك.
   2. أضف 4 غ من UA إلى القارورة. التفاف في رقائق ألومنيوم (UA يعجل عندما تتعرض للضوء) ويحرك باستمرار.
      ملاحظه: UA يذوب ببطء وبشكل غير كامل في 70 ٪ EtOH. السماح بلورات غير الذائبة ليستقر قبل استخدام الحل. وينبغي تصفيه UA الحل مع فلتر 0.45 μm قبل الاستخدام. UA يمكن اعدادها في وقت مبكر والاحتفاظ بها في زجاجه البني ملفوفه في رقائق ألومنيوم في 4 درجه مئوية لعده أشهر.
      تحذير: UA هو مشع معتدل وشديد السمية. استنشاق مسحوق UA يمكن ان يسبب اضطرابات الجهاز التنفسي العلوي والمرض في الرئتين والكبد والكلي. UA خطره عند بلعها أو عندما يتعلق الأمر في اتصال مباشر مع الجلد والاغشيه المخاطية. يجب ان يتم تنفيذ جميع الاعمال في غطاء الدخان باستخدام القفازات والملابس الواقية. وينبغي ان يتم المناولة والتخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة الخاصة بك.
2. ديهيدرات في 50 ٪ EtOH لمده 1 دقيقه. أزاله 50% EtOH قبل أضافه UA.
3. أضافه 4 ٪ UA في 70 ٪ EtOH. اسمحوا الجلوس لمده 1 ساعة أو بين عشيه وضحيها. إذا بين عشيه وضحيها ، مكان في الثلاجة في 4 درجه مئوية.
   ملاحظه: غطاء قارورة لتجنب التبخر EtOH وتغطيه مع رقائق ألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
   1. التخلص من النفايات UA والاثنين التالية الشطف وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة الخاصة بك
4. ديهيدرات في 70 ٪ EtOH لمده 1 دقيقه.
5. ديهيدرات في 90 ٪ EtOH لمده 5 دقائق.
6. ديهيدرات في 100 ٪ EtOH لمده 5 دقائق × 2.
7. شطف العينة في الأسيتون لمده 2 دقيقه × 3.

7. التسلل والتضمين

ملاحظه: الانسجه ليست جامده بما فيه الكفاية ليتم قطعها إلى أقسام رقيقه دون دعم إضافي من مصفوفة الراتنج. لذلك ، يجب ان تسبق التسلل والتضمين¹².

1. اعداد الراتنج EPON
   1. استخدام حقنه أنبوبي 60 mL. أزاله المكبس حقنه وغطاء حقنه مع ابره السلامة.
   2. ضع الحقنه مع الجانب المفتوح حتى وأضافه حجم كل مكون من مزيج الراتنج تدريجيا. أضافه 22 مل من تضمين-812 (الراتنج). أضافه DDSA (hardener) إلى حجم إجمالي 37 mL. أضافه NMA (hardener) إلى حجم الإجمالي من 50.5 mL. أضافه 525 μL من التفريغ-30 (مسرع) مع ماصه. تحريك المكبس من الماصة ببطء شديد كما ان الكوارث لزج جدا.
      ملاحظه: من المهم أضافه الكواشف التضمين بالترتيب المسرود. يجب أضافه المسرع (التفريغ-30) آخر. للحصول علي كتله الشفاء التي لديها الخصائص المطلوبة ، فمن المهم لاستخدام كميه الدقيق من المقوي والمسرع. يتم تفضيل الخلطات المضمنة الطازجة.
   3. وضع المكبس مره أخرى ووضع الحقنه علي الروك مع الاهتزاز المستمر لمده 30 دقيقه علي الأقل. سيتغير اللون من الأصفر إلى العنبر.
      ملاحظه: يجب ان تكون مختلطة جميع المكونات جيدا جدا. الفشل في القيام بذلك يؤدي إلى التشريب متفاوتة من عينه الانسجه وكتله من صلابة متفاوتة
2. مزيج 1 حجم من راتنج EPON مع 1 حجم الأسيتون في قارورة scint ويهز لخلط. تطبيق 1:1 EPON: خليط الأسيتون علي النسيج بعد أزاله الأسيتون الماضي شطف. يحفظ مغطي لتجنب تبخر الأسيتون. أزاله خليط 1:1 من الراتنج والأسيتون بعد 2-4 h أو الاحتفاظ بين عشيه وضحيها.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
3. استبدال خليط من الراتنج والأسيتون مع الراتنج الكامل. دعوانا نجلس لمده 4 ساعات أو بين عشيه وضحيها. وضع جميع النفايات EPON في حاويه جمع تحت غطاء محرك الشاحنة ليتم بلمره والتخلص منها في وقت لاحق.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

8. شقه--تضمين

ملاحظه: العينات هي مسطحه-جزءا لا يتجزا بين اثنين من الأفلام aclar في الأزياء مثل شطيرة.

1. قطع قطعتين مستطيله من ورقه aclar واضحة. مسح الأفلام نظيفه مع EtOH 70 ٪. تقليم الأوراق بحيث يكون هناك ما لا يقل عن 1.5 سم من البلاستيك الخالي من الانسجه علي كل جانب من القسم. ورقه aclar علي اعلي يجب ان يكون لها نفس العرض كما في الجزء السفلي ، وينبغي ان يكون ارتفاعه ما يقرب من ثلثي ورقه أسفل.
2. أماله ببطء القارورة مع العينة ورفع بلطف الانسجه من الجزء السفلي من القارورة.
3. استخدام ملعقة صغيره مرنه وفرشاه غرامه لنقل القسم بعناية علي طول الجدران قارورة ونقلها إلى ورقه aclar.
   ملاحظه: التعامل مع الأقسام بحذر لتجنب الضرر العينة.
4. ضع برفق ورقه aclar علي راس العينة.
   ملاحظه: تاكد من وجود ما يكفي من الراتنج بين ورقتين لختم ساندويتش
5. دفع بلطف من اي فقاعات الهواء المحاصرين دون ممارسه الضغط المباشر علي القسم. القضاء علي EPON الزائدة.
   ملاحظه: القضاء علي فقاعات الهواء مهم ، حيث ان وجودها يجعل التصور من العينة صعبه ويضعف استقرار السندات الراتنج.
6. تسميه الأوراق مع قلم مقاومه المذيبات ومكان في الفرن في 60 ͦC لمده 2-3 أيام لتتبلمر.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

9. كبسوله التضمين

ملاحظه: يتم تزويد ultramicrotomes مع الرمي لعقد كتل اسطوانيه التي تم الحصول عليها من تضمين العينات في كبسولات. الكتل الاسطوانيه لديها الهندسة المثالية لتكون اقل تاثرا بالاهتزازات الناشئة اثناء التقطيع.

1. افتح برفق الأفلام المحصورة. سوف العينة التمسك واحده من اثنين من صحائف aclar.
2. استخدم قلم مقاوم لمذيبات لوضع علامة علي جانب ورقه aclar التي تحتوي علي القسم. مارك بالقرب من النسيج.
   ملاحظه: من المهم لتنفيذ هذه الخطوة قبل اللكم الانسجه من الفائدة.
3. استخدام لكمه القرص للحصول علي عينه دائره من القسم. يجب ان تكون علامة القلم جزءا من الانسجه المثقوبة.
4. جهز غطاء كبسوله التضمين علي حامل الكبسولة. ضع قطره من الراتنج علي الغطاء.
5. ضع القرص المثقب داخل الغطاء مع القسم النسيجي المواجه. ستكون علامة القلم براقه عندما يكون الضوء مطفا علي العينة.
6. ادراج كبسوله في الغطاء واستخدام ملاقط غرامه لادراج وضع العلامات. لفه وخفض قطعه مطبوعه 2 سم-طويلة من الورق في الكبسولة. جعل التسمية لتتناسب مع انحناء الجدران الجانبية للكبسولة. انتظر حتى تكون البلمره كامله ، بحيث تصبح التسمية مضمنه بشكل دائم في الراتنج.
7. صب الراتنج التضمين داخل الكبسولة وملء حتى حافه الكبسولة.
8. دفع عينه الانسجه وصولا إلى الجزء السفلي من الكبسولة مع المعونة من عصا خشبيه مدببه ومكان في الفرن في 60 درجه مئوية لمده 2-3 يوما.
   ملاحظه: الحرص علي عدم الضغط علي الانسجه من الصعب جدا ، والسماح لها بدلا من ذلك تكمن فضفاضة بحيث طبقه رقيقه من الوسط التضمين موجودة بين الانسجه وسطح الكبسولة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

10. تقليم الوجه كتله

ملاحظه: صغيره الحجم والشكل المناسب للوجه كتله هي الشروط المسبقة للتماس مرضيه. ولذلك ، وتقليم كتله عينه هو ضرورة.

1. استخدم شفره حلاقه حاده ذات حافه واحده. نظفه بالأسيتون قبل الاستخدام مباشره.
2. جبل كتله كبسوله في حامل كتله ووضع حامل كتله علي خشبه المسرح من الفراغية.
   ملاحظه: يجب ان يتم اجراء التشذيب تحت مناظير المجهر والاضاءه المائلة.
3. أزاله ورقه aclar من غيض من الكبسولة باستخدام شفره الحلاقة. تظهر ورقه aclar كطبقه لامعه تحت ضوء نطاق تشريح.
4. عقد شفره الحلاقة في زاوية من 45 درجه مئوية وجعل التخفيضات إلى أسفل أربعه جوانب من كتله كبسوله.
   ملاحظه: ويتحقق التحكم الأفضل في التشذيب إذا تم عقد النصل بكلتا يديه.
5. جعل التخفيضات القصيرة بحيث ياخذ كتله شكل هرم قصير مع زوايا الجدار من حوالي 45 درجه مئوية.
   ملاحظه: ويدعم الوجه عينه أفضل بكثير إذا تم الاحتفاظ الجانبين المؤدية اليها قصيرة. إذا كان الطرف كتله رقيقه جدا وطويلة ، وسوف يهتز اثناء التقطيع رقيقه. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان تتركز منطقه الاهتمام في وجه كتله.
6. تقليم غيض من الكبسولة للتخلص من الانسجه زائده عن اللزوم والحفاظ فقط علي منطقه الاهتمام.
   ملاحظه: لا ينبغي ان يكون جزء من القسم دون الانسجه ، والاختلافات في كثافة الوجه كتله هي سبب رئيسي لصعوبة في التماس. من الناحية المثالية ، يجب ان تكون المساحة السطحية لوجه الكبسولة أكثر من 1 مم².
7. تقليم وجه الكبسولة في شكل شبه منحرف scalene. لأنه في شبه منحرف scalene اي جانب يساوي ، هذا الشكل هو الأفضل لتوجيه منطقه الفائدة بالنسبة لبقية العينة.
   ملاحظه: اثناء التقسيم ، يتم دعم الوجه شبه المنحرف علي شكل أفضل بكثير من اي شكل آخر.

11. ميكروتومي التماس

ملاحظه: الاغلبيه من عينات احيائيه جدا سميكه في حالتهم طبيعيه ان يكون اخترقت بشعاع الكترون. لذلك ، يجب قطع المواد في المقاطع الرقيقة التي يمكن اختراقها من قبل شعاع الكترون.

1. قطع رقيقه المقاطع (لون التداخل الفضة ، 600-900 Å) علي ultramicrotome في الطائرات موازيه للسطح.
2. ضع الأقسام علي الشبكات. يستخدم مختبر هذا المؤلف شبكات نحاسية من 3.05 مم في القطر الخارجي.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

12. بعد تلطيخ مع خلات اليورانيل

1. اعداد 2 ٪ UA في الماء المقطر. وضع 200 mL قارورة الزجاج الحجمي التي تحتوي علي 100 مل من الماء المقطر علي لوحه التحريك. أضف 2 غ من UA إلى القارورة. التفاف في رقائق ألومنيوم (UA يعجل عندما تتعرض للضوء) ويحرك باستمرار.
   ملاحظه: وللاطلاع علي تفاصيل التحضير لتعميم المعلومات ، انظر الفرع 6 من هذا البروتوكول.
2. ضع عده قطرات فرديه من 2 ٪ UA علي ورقه نظيفه من شمع الأسنان في طبق بيتري.
3. تعويم الشبكة مع عينه (قسم الجانب أسفل) علي قطره من UA لمده 25 دقيقه.
   ملاحظه: تعويم كل شبكه علي قطره منفصلة من UA.
4. عقد الشبكة علي حافته مع ملقط وشطف مرتين تحت طائره لطيف من الماء المقطر المغلي في درجه حرارة الغرفة من زجاجه غسل البلاستيك.
   ملاحظه: لا تسمح للشبكة لتجف قبل تلطيخ مع الرصاص.

13. بعد تلطيخ مع الرصاص

1. اعداد غرفه₂-الحرة (co₂ في الهواء هو المصدر الرئيسي لهطول الامطار الرصاص). ضع قطعه من ورق الفلتر غارقه مع 1 N NaOH في طبق بيتري. وضع ورقه صغيره من الشمع الأسنان نظيفه علي راس ورقه فلتر ووضع عده الكريات NaOH علي جانب واحد من الطبق. غطي الصحن.
   ملاحظه: اعداد هذا الاعداد قبل الملونة الشبكات مع UA ، بحيث الغلاف الجوي في الغرفة خاليه من CO₂ وعلي استعداد لتلطيخ الرصاص بحلول الوقت الانتهاء من تلطيخ ua.
2. جعل 4 ٪ NaOH. أضافه 0.2 غرام من NaOH إلى 5 مل من الماء المقطر.
3. اعداد الحل الثلاثي الرصاص ساتو. لاعداد 10 مل ، أضافه 0.1 غرام من نترات الرصاص ، 0.1 غرام من سيترات الرصاص ، 0.1 غرام من خلات الرصاص و 0.2 غرام من سيترات الصوديوم في زجاجه. أضافه 8.2 مل من الماء المقطر ويهز بقوة لمده 5 دقائق. سوكاتي ل 30 ثانيه ، ثم أضافه 1.8 مل من الطازجة 4 ٪ NaOH.
4. وضع عده قطرات من الرصاص ساتو علي الشمع في طبق بيتري.
5. وضع الشبكة ملطخه UA (قسم الجانب أسفل) علي قطره من الرصاص.
   ملاحظه: يجب ان يتم طرح كل شبكه علي قطره منفصلة من الرصاص. يجب ان يكون كل قطره صغيره بما يكفي للسماح للشبكة لتطفو علي راس قبة القطرة بدلا من الانزلاق إلى أسفل علي الجانبين.
6. غطي الطبق واتركيه لمده 5 دقائق.
7. عقد الشبكة في حافته مع ملقط ويغسل جيدا تحت طائره لطيف من الماء المقطر المغلي في درجه حرارة الغرفة من زجاجه غسل البلاستيك.
8. لطخه جافه الشبكة علي ورق الترشيح وتخزين الشبكة.
   ملاحظه: تاكد من ان القسم لا ياتي في اتصال مباشر مع ورقه الفلتر.

النتائج

وقد وضعت معايير عامه مقبوله في معظمها بوصفها مؤشرا علي الحفظ المرضي أو المعيب للعينه الخاصة بالعينة. وتتمثل هذه المعايير في أربعه الكترونات المجهرية المختارة (مثالين علي التحضير الأمثل ، وهما مثالان علي اعداد معيبه) التي تم الحصول عليها من خلال علاج انسجه المخ الفئران الشباب اتباع الأسال...

Discussion

التعامل مع أقسام الانسجه اثناء اعداد العينات لل TEM يتطلب درجه كبيره من البراعة والتركيز والصبر. عند استخدام الماصات المجهرية لأضافه المحاليل وأزالها ، يمكن امتصاص العينات في طرف الماصة عن طريق التوتر السطحي ، لذا ينبغي توخي الحذر الشديد لتجنب تلف الانسجه بواسطة الماصة. أيضا ، خطوات معينه ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder