АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем процедуры обработки ткани мозга новорожденных крыс для получения электронов высокого разрешения для морфометрического анализа синаптической везиклраспределения распределения на нервных терминалах. Микрографы, полученные с помощью этих методов, также могут быть использованы для изучения морфологии ряда других клеточных компонентов и их размерных структурных связей.

Аннотация

Наша лаборатория и многие другие использовали высокую разрешающую силу электронной микроскопии передачи для изучения морфологии и пространственной организации синапических пузырьков. Для получения высококачественных электронных микрографов, которые могут дать степень морфологических деталей, необходимых для количественного анализа досинаптической везикуловой дистрибутива, оптимальная подготовка образца имеет решающее значение. Химическая фиксация является первым шагом в процессе подготовки образца, и имеет первостепенное значение для сохранения тонкой ультраструктуры. Сосудистая фиксация раствором глутаральдегида-формальдегида, за которым следует обработка вибратообразных образцов с тетрокидом осмия, стабилизирует максимальное количество молекул, особенно белков и липидов, и приводит к превосходному сохранению ультраструктуры. Ткань затем обрабатывается с контрпятном, последовательным обезвоживанием и встраиванием мелины. En блок окрашивания с уранилом ацетата (т.е. окрашивание вибратообразной ткани до встраивания мелины) усиливает эндогенный контраст и стабилизирует компоненты клеток против добычи во время обработки образцов. Контраст может быть дополнительно увеличен путем применения уранила ацетата в качестве пост-пятна на ультратонких секциях. Двойное окрашивание ультратонких секций свинцом цитрата после лечения унанила ацетата также улучшает разрешение изображения, усиливая электронную непрозрачность нуклеиновой кислотно-содержащей структуры путем селективного связывания свинца с ацетатом уранил. Трансмиссия электронной микроскопии является мощным инструментом для характеристики морфологических деталей синаптической пузырьков и количественной оценки их размера и пространственной организации в терминале бутона. Однако, поскольку он использует фиксированную ткань, передача электронной микроскопии может предоставить только непрямую информацию о живых или эволюционных процессов. Поэтому следует учитывать другие методы, когда основной целью является изучение динамических или функциональных аспектов синаптической везикловой торговли и экзоцитоза.

Введение

Описываем методы подготовки ткани мозга новорожденных крыс для получения высококачественных электронных микрографов для углубленного морфометрического анализа синаптической везикулной пространственного распределения на нервных терминалах1,2. Высококонтрастные микрографы, которые могут быть получены путем обработки образцов после этих методов, также могут быть использованы для изучения детальной морфологии ряда клеточных компонентов и их мерных структурных связей3,4.

Электронный микроскоп передачи (TEM) является мощным инструментом для изучения морфологии органелл и других клеточных структур количественно. По состоянию на это десятилетие, Есть никаких других методов исследования, которые могут обеспечить такую же степень разрешения липидных мембран и органелл без иммуно-метки, за исключением криофиксации высокого давления замораживания. Тем не менее, методы замораживания замены не широко используются, и, как правило, требуют дорогостоящего оборудования и длительного времени подготовки.

Для того, чтобы воспользоваться высокой мощностью TEM, оптимальная подготовка образца имеет первостепенное значение. Основными целями подготовки образца являются сохранение структуры тканей с минимальным изменением от живого состояния, повышение контрастности образца и стабилизация ткани от извлечения клеточных компонентов во время обработки и воздействия электрона луч. Многочисленные протоколы для подготовки ткани TEM были введены и усовершенствованы несколькими лабораториями на протяжении многих лет. Многие из них сосредоточились на методах оптимальной визуализациисинаптической пузырьков 5,6,7,8,9,10,11. Среди ряда устоявшихся, золотой стандарт методы в настоящее время используется, мы выбрали процедуры для химической фиксации, пост-фиксации, ан блок окрашивания, последовательное обезвоживание, встраивание мелины и после окрашивания, которые направлены на сохранение оптимальной структуры ткани и добиться превосходного контраста изображения. Следует отметить, сохранение тонкой ультраструктуры может быть особенно сложным при работе с новорожденной ткани мозга крысы. В самом деле, центральная нервная система очень молодых животных характеризуется более высоким содержанием воды, чем взрослый мозг, более заметное расширение внеклеточных пространств, и слабее связи между клетками12. Это делает новорожденную ткань мозга крысы глубоко чувствительныки к изменениям в осмоляритности, и изысканно склонны к артефактной усадки и / или отек при обработке через последовательные решения различной тона12. Таким образом, наши методы использовали решения для обработки образцов, которые имеют осмоляритность как можно ближе к крысиного новорожденного мозга. Нашей целью было получение высококачественных изображений электронной микроскопии с высоким разрешением для количественной оценки синаптической везикл пространственного распределения на нервных терминалах. В частности, мы стремились измерить количество пузырьков в нервном терминале, расстояние синаптической пузырьков от досинаптической плазменной мембраны, количество пузырьков, пристыкованных к досинаптической мембране, размер синаптических пузырьков и межвезикулные расстояния1.

Удовлетворительная химическая фиксация является необходимым условием для получения высококачественных электронных микрографов, которые могут обеспечить морфологическую деталь, необходимую для изучения синаптической везикальной морфологии и пространственной организации. Хотя существует несколько способов фиксации, фиксация тканей головного мозга с помощью сосудистой перфузии явно превосходит другие методы. Так как фиксация через сосудистую перфузию начинается сразу после ареста системного кровообращения, она сокращает интервал между дезоксигенацией ткани мозга и перекрестной связью белков с фиксаторами, что приводит к минимальным изменениям в клетках структуры. Кроме того, он достигает быстрого и равномерного проникновения, из-за быстрого потока фиксатора из сосудистого ложа в внеклеточные и клеточные отсеки12,13,14. Первичная фиксация с глютаральдегидом, за которой следует вторичная фиксация (послефиксация) с тетроком осмия, дает отличную консервацию тонкой структуры15,16,17. Смесь глютаральдегида и параформальдегида имеет дополнительное преимущество более быстрого проникновения в ткани12.

Поскольку биологические ткани не являются достаточно жесткими, чтобы быть разрезаны на тонкие секции без поддержки матрицы мелиссы, они должны быть встроены в среду перед тонким сечением. Водонепроницаемые эпоксидные смолы обычно используются в качестве встраивающей среды в TEM. При использовании этого типа матрицы, свободная вода образца должна быть заменена органическим растворителем до проникновения в мудрец. Вода удаляется путем передачи образца через ряд растворов восходящих концентраций этанола и/или ацетона12. В этом протоколе образцы сначала плоские, встроенные между гибкими акларными листами, затем встроены в капсулу. Конечным результатом является ткань, расположенная на кончике цилиндрического блока мелиссовой, которая имеет идеальную геометрию, которая меньше всего зависит от вибраций, возникающих во время микротомирования.

Еще одним важным аспектом подготовки образцов является окрашивание тяжелыми металлами для повышения контраста эндогенных тканей. Контраст изображения в TEM обусловлен рассеянием электронов атомами в тканях. Однако биологические материалы состоят в основном из молекул с низким атомным весом (т.е. углерода, водорода, кислорода и азота). Поэтому генерация достаточного рассеянного контраста требует включения атомов высокого атомного веса в клеточные компоненты ткани. Это достигается за счет окрашивания образца тяжелыми металлами12,18,19. Тетроксид осмия, урана и свинца, которые сильно связываются с липидами, являются наиболее распространенными тяжелыми металлами, используемыми в качестве электронных пятен.

Осмий (атомный номер 76) является одним из самых плотных металлов в существовании. Это и фиксатор и пятно, хотя его основная роль в TEM как надежный фиксатор12. Среди различных протоколов фиксации в использовании, метод двойной фиксации с глютаральдегидом следуют осмия является наиболее эффективным в снижении извлечения клеточных компонентов во время подготовки образца. Эти два фиксатора используются для стабилизации максимального количества различных типов молекул, особенно белков и липидов, и приводят к превосходному сохранению ткани ультраструктуры12,14,15, 16 Год , 17.

Уран (атомный номер 92) является самым тяжелым металлом, используемым в качестве электронного пятна, чаще всего в виде ацетата уранила. Подобно осмию, он действует как пятно и фиксатор, хотя его основная роль в TEM, как пятно20,21. Нуклеиновые кислотосодержащие и мембранные структуры сильно и преимущественно окрашены солью уранила в альдегидно-фиксированных тканях22,23. Лечение тканей ацетатом уранила после осмеяния и до обезвоживания приводит к стабилизации мембранных и нуклеиновых кислотосодержащих структур, а также усиленного контраста и позволяет выявить некоторые структурные детали, которые не будут быть легко обнаружены в образцах окрашенных осмия только12,24,25. Считается, что уранил ацетат может стабилизировать тонкую структуру, сочетая с уменьшенным осмия, который был отложен на липидных мембранах во время осмии24. Максимальная контрастность достигается, когда уранил ацетат применяется перед встраиванием и как после пятно в тонких разделах12.

Свинец (атомный номер 82) является наиболее распространенным пятном, используемым для TEM и в основном используется для пост-окрашивания тонких секций. Свинцовые соли имеют высокую непрозрачность электронов и проявляют сродство к широкому спектру клеточных структур, включая мембраны, ядерные и цитоплазматические белки, нуклеиновые кислоты и гликоген26,27. При приеме двойного метода окрашивания (т.е. окрашивания ацетатом уранила следует лечение свинцом), последний выступает в качестве разработчика окрашивающего уранил-ацетат. Например, свинец после окрашивания хроматина фиксированной с глютаральдегидом увеличивает поглощение уранила ацетата в три28,29,30,31,32. Свинец также усиливает окрашивание, привитое другими металлами, такими как осмий. Считается, что свинцовые соли окрашивают мембраны осмий-фиксированных тканей, прикрепляя к полярной группе фосфатидов в присутствии уменьшенного осмия33. Потенциальным недостатком окрашивания как уранил ацетата и свинца, особенно в течение длительного времени, является то, что многие различные структурные элементы окрашены одинаково и не конкретно, и, таким образом, не может быть легко отличить друг от друга12 .

Недавнее введение альтернативных источников света, таких как оптическое супер-разрешение фото-активированной локализации микроскопии, значительно улучшило разрешение световой микроскопии34. Однако, поскольку световая микроскопия опирается на гистохимические и иммуноцитохимические методы для визуализации индивидуально обозначенных белков или ферментов, сила TEM для отображения всех структурных элементов одновременно остается непревзойденной для углубленного изучения морфология и мерные отношения структур тканей. В частности, никакая другая методика не может обеспечить морфологические детали, необходимые для выполнения морфометрического анализа синаптической везикл распределения на досинаптических нервных бутонов. Тем не менее, важно отметить, что электронные микрографы фиксируют структуру ткани после смерти организма, и поэтому они не могут предоставить информацию о динамике досинаптической везикл торговли и экзоцитоза. Таким образом, другие инструменты, такие как FM краситель живой изображения и патч-зажим электрофизиологии, должны быть рассмотрены, когда основная цель заключается в изучении динамических и / или функциональных аспектов синаптической везикл торговли и экзоцитоза.

протокол

Все исследования были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Университете Вирджинии (Шарлоттсвилл, Вирджиния) и проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения.

1. Фиксация сосудистой перфузией

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Общее описание метода перфузии сосудов крысиного мозга уже подробно описано в этом журнале13 и выходит за рамки этого протокола. Тем не менее, следующие шаги специфичны для подготовки ткани мозга новорожденных крыс для получения высококачественных электронных микрографов для количественного анализа распределения синаптической пузырьков на досинапических терминалах.

  1. Подготовка 4% параформальдегида
    1. Поместите 800 мл 0,1 м фосфатного буфера (PB) в 2 l стеклянный стакан на перемешивание пластины под дым-капюшон. Нагрейте примерно до 60 градусов по Цельсию, не кипячение буфера.
    2. Добавьте 40 г параформальдегидного порошка. Перемешать непрерывно
    3. При измерении рН, добавить небольшие капли 10 N NaOH, пока решение очищается. Окончательный рН должен быть 7.2-7.4.
    4. Добавьте оставшиеся 0,1 Млн ПБ до окончательного объема 1 л. Дайте остыть, процедите мембраной 0,45 мкм и храните при 4 градусах Цельсия на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Приготовить свежий параформальдегид за день до перфузии.
      ПРЕДЕКТОСИЯЕИ Вдыхание паров альдегида может вызвать носовые симптомы и раздражение дыхательных путей. Контакт с кожей вызывает дерматит. Альдегиды должны быть обработаны в дым-капюшон во время ношения перчаток, защитное платье и защитные очки
  2. Подготовка решения Tyrode
    1. Поместите 1 л дистиллированной воды в стеклянный стакан на перемешивающую тарелку. Добавьте NaCl (8 г), KCl (0,15 г), CaCl2 (0,1 г), MgCl2 (0,006 г),2PO4 (0,055 г), NaHCO3 (1 г) и декстрозу (1 г) в стакане.
    2. Непрерывно перемешать и измерить рН. Держите рН между 7,2 и 7,4.
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Решение Tyrode также доступно на коммерческой тяге.
  3. Смешайте 4% параформальдегида с гюттаральдегидом при окончательной концентрации 2%. Добавьте 40 мл электронной микроскопии класса 50% глютаральдегида до 1 л 4% параформальдегида. Хорошо перемешать в перемешивающейся тарелке
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Для пронизывания организма новорожденной крысы необходимо около 100 мл параформальдегида-глютаральдегида. Таким образом, по крайней мере 10 новорожденных крыс могут быть проникнуты 1 L фиксатора. Не смешивайте параформальдегид и глютаральдегид до непосредственнопередиса. Доведите все растворы до комнатной температуры перед перфузией.
  4. После того, как доступ к левому желудочку был получен (см. протокол перфузии всего животного13),промойте сосудистую систему раствором Tyrode на 30 с при перфузионном давлении 120 мм рт. ст.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Успех перфузии частично зависит от полного исключения крови из сосудистого дна
  5. Промыть раствором параформальдегида-глютаральдегида при том же давлении в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Поддержание постоянного перфузионного давления необходимо, чтобы избежать введения артефактов. Кроме того, температура перфузата не должна быть ниже температуры тела крысы, чтобы избежать сосудосуживаний
  6. Удалить фиксированный мозг из черепа и поместить в свежий параформальдегид-глютаральдегид фиксатор на 4 градуса Цельсия в одночасье.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Протокол можно приложить здесь.

2. Нарезка мозга

  1. Встроить фиксированный мозг в 4% агарозы и клея мозга агарозный блок на стадии вибратом
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Другие лаборатории получили секции хорошего качества, достигнув стабильного блока на вибратом без поддержки агара
  2. Сечение ломтиками толщины 50 мкм. Установите микротом на низкую частоту и скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Разделы могут храниться в 0,1 M PB с 0,05% азида натрия при 4 градусах Цельсия в течение нескольких лет.
  3. Поместите секции в 0,1 М ПБ в чашку Петри, изучите секции под микроскопом вскрытия и выберите образцы для встраивания
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Протокол можно приложить здесь.

3. Промывка

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Важно промыть образец после фиксации с альдегидами и перед пост-фиксацией с осмием, так как остаточные фиксаторы могут производить осмий ныельные осадки

  1. Пипетка 0.1 M PB в короткий, широкий рот стеклянный флакон с крышкой. Поместите по одному экземпляру на каждый флакон. Полностью покройте образец так, чтобы он не высох.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Держите образцы в той же флакон от этого шага через все изменения решения фиксации, обезвоживания и инфильтрации, пока они не будут готовы к плоскому встраиванию.
  2. Промыть образец в 0,1 М ПБ в течение 3 мин х 2, затем удалить ПБ с помощью микропипетта.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Так как мозг новорожденной крысы глубоко чувствителен к изменениям в осмолярити12,35,36,37, осуществлять стирки в том же транспортном средстве, что и в фиксаторной смеси

4. Постфиксация с Осмиемом

  1. Препарат тетроксида осмия (OsO4)
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Эта лаборатория автора использует OsO4 4% поставляется в aqueous раствор в стеклянных ампулах (5 мл OsO4 4% в H2O). Другие лаборатории успешно использовали кристаллы OsO 4. Тем не менее, несколько часов, необходимых для растворения кристаллов OsO4 в транспортном средстве.
    1. Возьмите 5 мл (один ампулу) 4% OsO4/H2O, откройте его и поместите в коричневую стеклянную бутылку
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ OsO4 является сильным окислительным агентом и легко снижается при воздействии света. Сокращения можно избежать во время подготовки, поместив OsO4 в коричневую стеклянную бутылку
    2. Добавьте 5 мл 0,2 МПБ. Это даст 10 мл 2% OsO4/0,1 М ПБ.
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Так как мозг новорожденной крысы глубоко чувствителен к изменениям в осмоляритности, используйте тот же буфер для подготовки альдегида фиксаторы и OsO4 решение12,35,36,37
    3. Добавьте дополнительные 10 мл 0,1 МПБ. Это даст окончательное решение 20 мл 1% OsO4 в 0,1 м ПБ.
    4. Используйте 20 мл шприц оснащен длинной иглой, чтобы нарисовать 1% OsO4 и поместить его в коричневую стеклянную бутылку или пробирку, покрытую алюминиевой фольгой.
      ПРЕДЕКТОСИЯЕИ OsO4 является чрезвычайно летучих и его пары токсичны для носа, глаз и горла. Все работы должны быть выполнены в дымовой капюшон с использованием перчаток и защитной одежды, и ни одна часть тела не должна подвергаться OsO4. Обработка и удаление отходов должно осуществляться в соответствии с руководящими принципами вашего учреждения. Храните неиспользованные OsO4 в плотно stoppered коричневой стеклянной бутылке с тефлоновой вкладыш на стеклянной пробке, оберните бутылку в двойную алюминиевую фольгу и хранить в dessicator. При наличии протекающих паров OsO4 может обесцвечивать внутренние поверхности и содержимое холодильника. В вышеуказанных условиях хранения решение OsO4 стабильно в течение нескольких месяцев. Когда растворы окисляются во время хранения, они становятся серыми, и в этом случае их необходимо утилизировать.
  2. Добавить 1% OsO4 в 0,1 М ПБ в образец флакон и пусть сидят в течение 1 ч. Экстракт OsO4 после 1 ч с микропайпет.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Перед нанесением OsO4 на секцию, очень важно развернуть и сгладить образец. Избегайте применения непосредственно на верхней части образца, вместо этого используйте стенки флакона, чтобы аккуратно капать OsO4 на дно флакона. Образец становится коричневым и жестким вскоре после применения OsO4. Ручка мягко отныне, чтобы избежать повреждения тканей

5. Промывка

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Важно промыть образец после пост-фиксации с OsO4 и до обезвоживания, так как остаточные фиксаторы могут вскакивать с обезвоживанием агентов37.

  1. Промыть с 0,1 М ПБ на 3 мин х 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Так как мозг новорожденной крысы глубоко чувствителен к изменениям в осмолярите, проводить стирки в том же транспортном средстве, что и в фиксаторной смеси12,35,36,37.
  2. Поместите раствор осмия и первые два ПБ промыть в OsO4 отходов и утилизировать его в соответствии с руководящими принципами вашего учреждения.

6. Последовательное обезвоживание и окрашивание с помощью уранила ацетата

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Лаборатория этого автора использует водонепроницаемые эпоксидные смолы для встраивания. При использовании эпоксидной смолы, вся свободная вода образца должна быть заменена органическим растворителем перед проникновением вэмплинг-средой. Вода удаляется путем передачи образца через ряд растворов восходящих концентраций этанола и ацетона12.

  1. Приготовление ацетата уранила (UA)
    1. Поместите 200 мл объемной стеклянной колбы, содержащей 100 мл EtOH 70% на перемешивание пластины.
    2. Добавьте 4 г UA в колбу. Оберните в алюминиевую фольгу (УАЗ осаждает при воздействии света) и непрерывно перемешивайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ UA растворяется медленно и неполно в 70% EtOH. Разрешить нерастворенные кристаллы, чтобы успокоиться перед использованием раствора. Раствор UA должен быть отфильтрован фильтром 0,45 мкм перед использованием. UA можно приготовить заранее и хранить в коричневой бутылке, завернутой в алюминиевую фольгу при 4 градусах цельсия в течение нескольких месяцев.
      ПРЕДЕКТОСИЯЕИ UA является легко радиоактивным и высокотоксичным. Вдыхание порошка UA может вызвать нарушения верхних дыхательных путей и заболевания легких, печени и почек. UA опасен при погловал или когда он вступает в прямой контакт с кожей и слизистыми оболочками. Все работы должны выполняться в дым-капюшон с использованием перчаток и защитной одежды. Обработка и удаление отходов должно осуществляться в соответствии с руководящими принципами вашего учреждения.
  2. Обезвоживание в 50% EtOH в течение 1 мин. Удалить 50% EtOH перед добавлением UA.
  3. Добавьте 4% UA в 70% EtOH. Пусть сидят в течение 1 ч или на ночь. Если на ночь, поместите в холодильник при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ примечанием,     чтобы избежать испарения EtOH и накрыть алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света. Протокол можно приложить здесь.
    1. Утилизация отходов UA и два следующих полоскания в соответствии с руководящими принципами вашего учреждения
  4. Обезвоживание в 70% EtOH в течение 1 мин.
  5. Обезвоживание в 90% EtOH в течение 5 мин.
  6. Обезвоживание в 100% EtOH в течение 5 мин х 2.
  7. Промыть образец в ацетоне в течение 2 мин х 3.

7. Проникновение и встраивание

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Ткани не являются достаточно жесткими, чтобы быть разрезаны на тонкие секции без дополнительной поддержки матрицы мелиссы. Таким образом, проникновение и встраивание должно предшествовать разделу12.

  1. Подготовка ресины EPON
    1. Используйте 60 мл гаваж шприц. Удалите шприц поршень и крышка шприц с защитной иглой.
    2. Поместите шприц с открытой стороной вверх и добавить объем каждого ингредиента смеси мелины постепенно. Добавьте 22 мл встраиваемого-812 (сыворотки). Добавьте DDSA (затвердевной) в общий объем 37 мл. Добавьте NMA (затвердев) в общий объем 50,5 мл. Добавьте 525 л DMP-30 (ускоритель) с помощью пипетки. Перемещение поршень пипетки очень медленно, как DMP очень вязкий.
      ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, важно добавить встраивающие реагенты в перечисленный порядок. Ускоритель (DMP-30) должен быть добавлен последним. Для получения вылеченного блока, который имеет желаемые характеристики, очень важно использовать точное количество затвердевателя и ускорителя. Предпочтительнее свежеприготовленные встраивающие смеси.
    3. Положите поршень обратно и поместите шприц на рокер с непрерывной тряской в течение не менее 30 мин. Цвет изменится с желтого на янтарь.
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Все ингредиенты должны быть смешаны очень тщательно. Невыполнение этого требования приводит к неравномерной пропитке образца ткани и блоку неравномерности
  2. Смешайте 1 том реучницы EPON с 1 томом ацетона в пробирке и встряхните, чтобы перемешать. Нанесите смесь EPON 1'1 epon-ацетон на ткань после удаления последнего промыть ацетоном. Держите покрыты, чтобы избежать испарения ацетона. Удалите смесь 1 no 1 из мисиной и ацетона после 2-4 ч или держите на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, протокол можно приложить здесь.
  3. Замените смесь мисы и ацетона полной мисеной. Пусть сидят в течение 4 ч или на ночь. Поместите все отходы EPON в контейнер для сбора под капотом для полимеризации и утилизации позже.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, протокол можно приложить здесь.

8. Плоское встраивание

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Виды плоские встроенные между двумя акларными фильмами в сэндвич-как мода.

  1. Вырезать два прямоугольных кусочков ясного листа аклара. Протрите пленки чистой с EtOH 70%. Обрезать листы так, чтобы есть по крайней мере 1,5 см ткани пластика на каждой стороне раздела. Аклар лист сверху должен иметь ту же ширину, что и нижний, а его высота должна быть примерно на две трети нижнего листа.
  2. Медленно наклоните флакон с образцом и осторожно поднимите ткань со дна флакона.
  3. Используйте микро гибкий шпатель и тонкую кисть, чтобы аккуратно переместить секцию вдоль стенок флакона и перенести на акларлист.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Обвисть разделы с осторожностью, чтобы избежать повреждения образца.
  4. Аккуратно поместите аклар лист поверх образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Убедитесь, что есть достаточно йенсы между двумя листами, чтобы запечатать бутерброд
  5. Аккуратно выталкивайте любые захваченные пузырьки воздуха, не оказывая прямого давления на секцию. Протрите избыток EPON.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Устранение пузырьков воздуха имеет важное значение, так как их наличие затрудняет визуализацию образца и ослабляет стабильность связей с мислин.
  6. Пометьте листы растворителем, устойчивым пером, и поместьте в духовку при температуре 60 кВ в течение 2-3 дней для полимеризации.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, протокол можно приложить здесь.

9. Встраивание капсулы

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Ультрамикротомы снабжаются патронами для хранения цилиндрических блоков, полученных из встраивания образцов в капсулы. Цилиндрические блоки имеют идеальную геометрию, которая меньше всего зависит от вибраций, возникающих во время секции.

  1. Аккуратно откройте зажатые акларные пленки. Образец будет придерживаться одного из двух акларных листов.
  2. Используйте растворительную ручку, чтобы отметить сторону листа aclar, который содержит раздел. Отметьте возле ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Очень важно выполнить этот шаг, прежде чем пробивая ткани интереса.
  3. Используйте диск удар для получения круг образца раздела. Знак пера должен быть частью выбитой ткани.
  4. Подготовьте крышку встраивающей капсулы вверх на держатель капсулы. Поместите каплю сечки с мишени на крышку.
  5. Поместите пробивной диск внутри крышки с тканью разделе вверх. Знак пера будет блестеть, когда свет сияет на образце.
  6. Вставьте капсулу в крышку и используйте тонкие пинцеты для вставки маркировки. Roll и опустите напечатанный 2 см длиной лист бумаги в капсулу. Сделайте этикетку, чтобы соответствовать кривизне боковых стенок капсулы. Подождите, пока полимеризация будет полной, так что этикетка становится постоянно встроенной в мизину.
  7. Налейте вложение мели смущающей сядр в капсулу и заполните до края капсулы.
  8. Нажмите образец ткани вниз на дно капсулы с помощью остроконечной деревянной палкой и поместите в духовку при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Позаботьтесь, чтобы не нажимать ткань слишком сильно, вместо этого дайте ему лежать свободно так, что тонкий слой встраивающей среды присутствует между тканью и поверхностью капсулы. Протокол можно приложить здесь.

10. Обрезка лица блока

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Небольшой размер и соответствующая форма лица блока являются предпосылками для удовлетворительного сечения. Поэтому обрезка блока образца является необходимостью.

  1. Используйте острое одногранное лезвие бритвы. Чистота с ацетоном непосредственно перед использованием.
  2. Установите блок капсулы в держатель блока и поместите держатель блока на стадию стереомикроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Процедура обрезки должна проводиться под биноклей микроскопа и косым освещением.
  3. Удалите аклар лист с кончика капсулы с помощью лезвия бритвы. Аклар лист выглядит как блестящий слой под светом расчленяющего прицела.
  4. Держите лезвие бритвы под углом 45 градусов и сделайте вырубки четырех сторон капсульного блока.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Лучший контроль отделки достигается, если лезвие держится обеими руками.
  5. Сделайте короткие стрижки так, чтобы блок принимает форму короткой пирамиды с углами стены примерно 45 ".
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Лицо образца поддерживается гораздо лучше, если стороны, ведущие к нему, держатся короткими. Если наконечник блока слишком тонкий и длинный, он будет вибрировать во время тонкого сечения. В идеале, область интереса должна быть сосредоточена в блоке лицо.
  6. Обрезать кончик капсулы, чтобы отказаться от лишних тканей и только сохранить область интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Ни одна часть секции не должна быть без ткани, так как изменения в плотности блока лица являются основной причиной трудностей в секции. В идеале площадь поверхности поверхности поверхности лицакапсулы должна быть не более 1 мм 2.
  7. Обрезать лицо капсулы в форме мачеха трапециевидной. Поскольку в мачепообразной трапециевидной ни одна сторона не является равной, эта форма лучше всего ориентировать область интереса по отношению к остальной части образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Во время секции, трапециевидной формы лица поддерживается гораздо лучше, чем у любой другой формы.

11. Микротомсекция

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Большинство биологических образцов слишком толстые в своем естественном состоянии, чтобы быть проникли электронным лучом. Поэтому материал должен быть разрезан тонкими секциями, которые могут быть проникли электронным лучом.

  1. Вырезать тонкие секции (серебряный интерференционный цвет, 600-900) на ультрамикротоме на плоскостях параллельно поверхности.
  2. Разместите секции на сетках. Лаборатория этого автора использует медные сетки 3,05 мм внешнего диаметра.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Протокол можно приложить здесь.

12. Пост-окрашивание с уранильным ацетатом

  1. Приготовьте 2% UA в дистиллированной воде. Поместите 200 мл объемной стеклянной колбы, содержащей 100 мл дистиллированной воды, на перемешивание пластины. Добавьте 2 г UA в колбу. Оберните в алюминиевую фольгу (УАЗ осаждает при воздействии света) и непрерывно перемешивайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Подробнее о подготовке UA читайте раздел 6 этого протокола.
  2. Поместите несколько отдельных капель 2% UA на чистый лист зубного воска в чашку Петри.
  3. Поплавок сетки с образцом (раздел стороны вниз) на капле UA в течение 25 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Плавать каждую сетку на отдельной капле UA.
  4. Держите сетку на ее краю щипками и промыть дважды под нежной струей кипяченой дистиллированной воды при комнатной температуре из пластиковой бутылки для мытья.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Не позволяйте сетке высохнуть перед окрашиванием свинцом.

13. Пост-окрашивание свинцом

  1. Подготовка CO2-свободной камеры (CO2 в воздухе является основным источником осадков свинца). Поместите кусок фильтровальной бумаги, пропитанной 1 N NaOH в чашку Петри. Поместите небольшой лист чистого зубного воска поверх фильтровальной бумаги и поместите несколько гранул NaOH на одну сторону блюда. Накрыть блюдо.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Подготовьте эту установку до того, как сетки будут окрашены UA, так что атмосфера в камере свободна от CO2 и готова к окрашиванию свинца к моменту завершения окрашивания УА.
  2. Сделать 4% NaOH. Добавьте 0,2 г NaOH к 5 мл дистиллированной воды.
  3. Подготовьте тройное решение Sato. Для приготовления 10 мл добавьте 0,1 г нитрата свинца, 0,1 г свинцового цитрата, 0,1 г свинцового ацетата и 0,2 г цитрата натрия в стеклянную бутылку. Добавить 8,2 мл дистиллированной воды и энергично встряхнуть в течение 5 мин. Sonicate в течение 30 с, затем добавить 1,8 мл свежеприготовленных 4% NaOH.
  4. Поместите несколько капель свинца Сато на воск в чашке Петри.
  5. Поместите сетку, окрашенную UA (раздел наячку вниз) на каплю свинца.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Каждая сетка должна быть плавающей на отдельной капле свинца. Каждая капля должна быть достаточно маленькой, чтобы сетка плавала на куполе капли, а не сползала по бокам.
  6. Накройте блюдо и дайте пятно в течение 5 мин.
  7. Держите сетку на ее краю с щипками и тщательно мыть под нежной струей кипяченой дистиллированной воды при комнатной температуре из пластиковой бутылки для мытья.
  8. Подьем высушить сетку на фильтровальной бумаге и хранить сетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Убедитесь, что раздел не встывает в прямой контакт с фильтровальной бумагой.

Результаты

Установлены общие критерии, которые в основном признаются как показательудовлетворительного или дефектного сохранения образца для ТЭМ. Эти критерии иллюстрируются в четырех выбранных электронных микрографах (два примера оптимальной подготовки, два примера дефектной подготовки), ко?...

Обсуждение

Обработка секций тканей во время подготовки образца к TEM требует значительной степени утонченности, концентрации и терпения. При использовании микропипетта для добавления и удаления растворов образцы могут быть всасывается в кончик пипетки поверхностным натяжением, поэтому следует ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данная рукопись была поддержана NIH/NIGMS K08 123321 (в N.L.) и за счет средств кафедры анестезиологии Университета Вирджинии. Авторы хотели бы поблагодарить Алев Эрисир (департамент биологии, Университет Вирджинии, Шарлоттсвилл, Штат Вирджиния) за отличную подготовку и техническую помощь с TEM, и за ее бесценную критику рукописи. Авторы также благодарят Расширенный электрон микроскопии объекта в Университете Вирджинии за техническую помощь с образцом секции и после окрашивания.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4% Osmium tetroxideElectron Microscopy Sciences19170acqueous
50% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16310EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding filmElectron Microscopy Sciences50425-257.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holderElectron Microscopy Sciences69916holds size "00" capsules
BEEM embedding capsulesElectron Microscopy Sciences70021size "00", flat
Butler block trimmerElectron Microscopy Sciences69945-01
Camel hair paint brushElectron Microscopy Sciences65576-01
Disc punchElectron Microscopy Sciences77850-09
Embed 812 kitElectron Microscopy Sciences14120
Lead acetateElectron Microscopy Sciences17600
Lead citrateElectron Microscopy Sciences17800
Lead nitrateElectron microscopy Sciences17900
Leica UC7 ultracut microtomeLeica
Micro scaleElectron Microscopy Sciences62091-23
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19208EM grade, granular
Precision Thelco laboratory ovenThelco51221159
Sodium azideSigma-AldrichtS2002
StatMark penElectron Microscopy Sciences72109-01
Tyrode solutionElectron Microscopy Sciences11760-05
Uranyl acetateElectron Microscopy Sciences22400powder

Ссылки

  1. Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
  2. Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
  3. Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
  4. Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
  5. Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
  6. Akert, K., Sandri, C., Santini, M. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).
  7. Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
  8. Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
  9. Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
  10. Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
  11. Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
  12. Hayat, M. A., Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
  14. Hayat, M. A., Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
  15. Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).
  16. Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
  17. Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
  18. Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
  19. Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
  20. Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
  21. Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
  22. Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
  23. Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
  24. Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
  25. Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
  26. Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
  27. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  28. Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
  29. Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
  30. Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
  31. Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
  32. Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
  33. Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
  34. Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
  35. Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).
  36. Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
  37. Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены